專利名稱：一種三烯抗生素及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種抗生素，特別涉及一種三烯抗生素及其制備方法和應用，屬于生物技術領域。
背景技術：
植物病害一直以來都是農業生產的大敵，在三類植物病害中由病原真菌引起的植物病害位居首位(真菌病害、細菌病害和病毒病害)，在小麥的200多種病害中，真菌病害占據了 90%左右，因此所造成的損失每年可占其總產量的10%-20%。長期以來，人們為對抗病害，使用了大量的化學農藥，導致了三大難題的產生污染環境，積累殘毒，最終危害人類 自身健康；病原真菌的抗藥性呈爆發式上升；有益微生物被殺死,破壞了動植物體內微生物種群的平衡，使得病原真菌成為優勢種群，導致病害的暴發流行。基于化學農藥的這些毒副作用以及人們環保意識的不斷增強和對綠色無公害食品要求的逐漸提高，研發、生產和使用具有自主知識產權的高科技、無公害生物農藥已經成為了當務之急。農用抗真菌抗生素作為生物農藥的一個重要的分支，因其具有高效、易降解、無殘留、無污染等優點而日益受到人們的重視，如井R霉素、春雷霉素、中生菌素、武夷霉素、新多氧霉素、多抗霉素、農抗120、慶豐霉素等，現已被廣泛應用于防治各類植物病原真菌病害中。農用抗生素是在微生物代謝過程中產生的，它是指在低濃度下就能抑制或能殺死農作物病、蟲、草害或者可以調節作物生長發育的化學物質，美國、英國、日本等國家最早開始應用農用抗生素。對農用抗生素的研究是隨著醫用抗生素的發展而發展起來的，早期使用如鏈霉素、灰黃霉素、土霉素等醫用抗生素來防治植物病害。后來，Dekker等人相繼報道了一批例如放線菌酮(Cycloheximide)、抗霉素A(ActimycinA)以及其他一些多烯類農用抗生素。日本于1958年成功研制出殺稻痕菌-S(Blasticidin-s),并在1961年大規模應用于稻瘟病的防治，這就基本替代了有機汞制劑在稻瘟病防治上的使用，可以說殺稻瘟菌素-S的發現和生產的工業化，是農用抗生素開發的里程碑。在這之后，相繼開發的又有春雷霉素、多抗霉素等一系列高效低毒的抗真菌農藥新品種。我國對農用抗生素的研究開始于上世紀五十年代初，起步雖晚但發展較為迅速。井網霉素、公主嶺霉素(Gongzhulingmycin)、農抗120、武夷菌素、春雷霉素等農用抗生素品種相繼被研制出并得到應用。經過幾十年的探索研究，我國在篩選新型農用抗生素的方法上有了較大的提高，近年來又研發出天柱菌素、中生菌素(Zhongshengmycin)、新多氧霉素等。多烯類抗真菌抗生素是作用于真菌感染的藥物，它的作用機理是與真菌細胞膜的固醇部分進行選擇性結合，在細胞膜上形成孔道，從而改變細胞膜的通透性，導致細胞內多種小分子物質外泄，最終導致細胞死亡而發揮抗菌作用，但它對細菌無作用，因為細菌細胞膜不含固醇。多烯類抗真菌藥物在近幾年來發展較快。多烯類抗生素中有一類是多烯大環內酯抗生素，它們的組成包括由25-37個碳原子組成的內酯環和環上的一部分共軛多烯結構，在其對應部位有羥基，并由苷鍵連接一個或多個氨基糖。按結構中共軛雙鍵數目的不同可分為三、四、五、六、七烯，每一種都有其特異的紫外吸收峰值。這類抗生素有許多共同的性質，如廣譜抗真菌、遇光易分解、不易溶于水、靜脈給藥毒性高、口服毒性低等。由放線菌產生的具有共軛四烯的大環內酯，紫外吸收光譜在(291±2)nm，(302±2)nm，(320±3)nm有特征吸收峰，每個吸收峰都有抗真菌活性。目前多烯類抗真菌藥物約有50余種，如兩性霉素B (amphotericin B, AMB)的新制劑AMB是目前唯一臨床使用的可靜脈注射的多烯類抗真菌抗生素，它能與真菌細胞膜中的麥角留醇(ergosterol)結合并使其氧化,具有殺真菌活性強、抗菌譜廣等特點，不足之處是AMB有較強的腎毒性，目前臨床研究及開發上市的AMB新制劑主要有3類脂質體(liposome)、脂質復合物(lipid complex)和膠體分散劑(colloidal dispersion),它們都是以脂類為介質制成的。制霉菌素脂質體NyotranNystatin(NYS)能結合麥角甾醇，降低細胞膜的穩定性，對多種真菌有抗生活性，但由于其在胃腸道不易被吸收，且毒性較大等原因，使得該藥的臨床應用受到很大的限制。Aronex公司的Johnson等研制成商品名為Nyotran的脂質體，不僅大大提高了療效，而且降低了它的毒副作用。3874H1和3874H3這2個化合物與AMB類似，均屬于七烯類抗生素，其中3874H1含有一個芳香環，而3874H3不含芳香環，因此3874H3的水溶性很強，兩者都有廣泛的抗菌作用，對多種皮膚真菌、絲狀真菌及酵母都有抗生活性，且活性高于AMB和NYS。
由于真菌是真核微生物，它們與高等動植物的許多生物特性都相似，因此真菌抗生素不具有細菌抗生素那種高效低毒且專一性好的特性，一般它們的毒副作用較大且療效較低。因此，盡管臨床上抗真菌感染的藥物有許多種，但多數化學合成藥只能用于表面感染的治療，能作為體內用藥的非常少。所以，篩選殺菌(或抑菌)效率高、副作用小、專一性好的抗真菌抗生素具有重要意義。
發明內容
本發明的目的是提供一種三烯抗生素及其制備方法和應用，該種抗生素具有較好的抑菌活性，且提取的時間周期明顯縮短，經濟成本也相應降低，純度高。本發明采取的技術方案為—種三烯抗生素，其分子式為C23H34O8S,結構式如下
權利要求
1.一種三烯抗生素，其分子式為C23H34O8S，結構式如下
2.權利要求I所述的三烯抗生素的制備方法，其特征是，包括如下步驟 (1)發酵液預處理從山東鏈霉菌成熟斜面上刮取菌體接種于高氏I號液體培養基中，25-30°C培養70-75h，再接種至發酵罐中25_30°C攪拌條件下發酵4_5天，調節發酵液pH =3-6，將發酵液離心除去菌體留上清液； (2)用大孔樹脂X-5柱層析預處理將上清液在大孔樹脂X-5柱上樣，先用去離子水沖洗，然后用40%乙醇沖洗洗掉色素等雜質，再用50%乙醇洗下活性組分，收集洗脫液，將收集的洗脫液閃蒸濃縮，濃縮至上清液體積的30-40%，得初步濃縮液； (3)用大孔樹脂HP-20柱層析預處理將初步濃縮液在大孔樹脂HP-20柱上樣，先用45%乙醇沖洗洗掉雜質，然后用50%乙醇洗下活性組分，收集洗脫液，將收集的洗脫液閃蒸濃縮，濃縮至上清液體積的20 ±5%，得二次濃縮液； (4)HPLC半制備型液相分離將二次濃縮液液相分離，HPLC半制備柱為C18，流動相為甲醇和20mM乙酸銨pH3. 0，采用程序梯度洗脫方法，20mM乙酸銨pH3. O的起始濃度為50%，終止濃度為10%，甲醇起始濃度為50%，終止濃度為90%，收集液相中的各個峰，除去溶劑甲醇和乙酸銨； (5)將活性組分所在的峰對應的收集液旋轉蒸發濃縮后冷凍干燥即得所要純品。
3.根據權利要求2所述的三烯抗生素的制備方法，其特征是，步驟(I)所述的高氏I號液體培養基的重量份比組成為可溶性淀粉20份、KNO3 I份、NaCl O. 5份、K2HPO4 · 3Η200· 655 份、MgSO4O. 5 份、FeSO4 O. 01 份、水 1000 份；ρΗ 7. 2 7. 4。
4.根據權利要求2所述的三烯抗生素的制備方法，其特征是，步驟(I)所述的攪拌速度為 200-400r. mirr1 ;所述的離心速度為 6000-12000r. mirT1。
5.根據權利要求2所述的三烯抗生素的制備方法，其特征是，步驟(5)所述的旋轉蒸發溫度50°C，冷凍干燥的時間24-32h。
6.根據權利要求2所述的三烯抗生素的制備方法，其特征是，步驟(5)活性組分所在的峰為 271±lnm。
7.權利要求I所述的三烯抗生素在制備真菌抑制劑中的應用。
8.權利要求I所述的三烯抗生素在制備蘋果腐爛菌、白地霉菌抑制劑中的應用。
全文摘要
本發明涉及三烯抗生素，其分子式為C23H34O8S，結構式如下，其制備是用山東鏈霉菌培養發酵液，將發酵液離心除去菌體留上清液，上清液先用大孔樹脂X-5柱層析預處理，再用大孔樹脂HP-20柱層析預處理，然后進行HPLC半制備型液相分離，將活性組分所在的峰對應的收集液旋轉蒸發濃縮后冷凍干燥即得所要純品。本發明能得到雜質比較少，純度比較高的純品，在相同濃度下，本發明抗生素抑菌圈直徑較大，抑菌效果較強。
文檔編號C12R1/465GK102659734SQ20121012965
公開日2012年9月12日 申請日期2012年4月28日 優先權日2012年4月28日
發明者李德舜, 陳琦, 馬井玉 申請人:山東大學