專利名稱：一株耐高溫石蠟降解菌及其在清防蠟中的應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于石油微生物領域，具體涉及ー株具有清防蠟功能的菌株及其在清防蠟中的應用。
背景技術：
對于溶有一定量石蠟的原油，在開采過程中，隨著溫度、壓カ的降低和氣體的析出，溶解的石蠟便以結晶體析出、長大聚集并沉積在管壁等固相表面上，即出現所謂的結蠟現象。結蠟會堵塞產油層，降低油井產量，同時也會増大油井負荷，造成生產事故。在含蠟原油的開采過程中，雖然可采用各類防蠟方法，但油井仍不可避免地存在有蠟沉積的問題。 蠟沉積嚴重地影響著油井正常生產，所以必須采取措施將其清除。目前，油井常用的清蠟方法有機械清蠟、熱カ清蠟、化學清蠟等。清防蠟技術就是根據原油物性及油井開采狀況的復雜性，并根據不同區塊、不同油井、區塊開采的不同時期以及油井結蠟狀況的不同，為清蠟、阻止蠟沉積而采取的一種有效的エ藝。微生物清防蠟技術則是針對原油含蠟的特點以及結蠟機理，篩選合適的細菌組合注入井筒，利用微生物細菌及其代謝產物的作用，阻止石蠟結晶，防止或緩解井筒結蠟，達到代替或逐漸替代傳統清防蠟措施的目的。目前，雖然國內外已經分離篩選出大量的石油降解菌株，但是耐高溫高效的石蠟降解菌株卻不多見，這也是開發利用微生物技術進行清防蠟エ藝的最大障礙，在實際應用中受到很大的限制，所以開發高效清防蠟菌株具有重要的創新性和應用價值。
發明內容
本發明的目的是為了解決目前缺少耐高溫高效的石蠟降解菌株的問題，而提供一株耐高溫石蠟降解菌及其在清防蠟中的應用。本發明的耐高溫石臘降解菌為微桿菌(Microbacterium sp. ) JNS02,保藏在中國典型培養物保藏中心，其保藏編號為CCTCC NO M 2012022。本發明微桿菌JNS02是從大慶油田被原油污染的水樣中經分離、純化獲得。該微桿菌JNS02在LB平板上生長I天形成直徑約I 3mm的菌落，菌落圓形，凸起，表面濕潤，邊緣整齊，半透明。單細胞，呈短桿狀，革蘭氏陽性。呼吸代謝，產熒光、不產生H2S、吲哚、甲基紅；具有硝酸鹽還原性和反硝化能力，具有液化明膠能力，能利用葡萄糖、蔗糖。本發明的的耐高溫石臘降解菌,它為微桿菌sp. )JNS02,其16SrDNA 基因序列參照《Bergey’s Mannual of Systematic Bacteriology))VoI. VtO 內容，根據其生理生化特征和16S rDNA基因序列，通過NCBI BLASTn程序比對，本發明微桿菌JNS02與Microbacterium sp. A95的16S rDNA基因序列同源為99%，因此鑒定本發明的菌株為微桿菌屬的ー個新菌種。本發明的耐高溫石臘降解菌,它為微桿菌iMi crobac teri um sp. ) JNS02,屬于微桿菌屬(#icrc^aci6 riw ),保藏在中國典型培養物保藏中心,保藏地址為中國.武漢.武漢大學，保藏日期為2012年2月16日，保藏編號為CCTCC NO M 2012022。本發明微桿菌NS02能夠使凝固在管壁等固體上的石蠟溶解成網狀并剝離，并且剝離下的固體石蠟變軟或已經溶解，經測定，清蠟率可達59%。因此，該微桿菌JNS02可用于油田生產過程中的清蠟操作，也可用于防止結蠟情況的發生。本發明微桿菌JNS02能夠在3(T70°C條件下生長，在70°C時菌液的OD62tl仍可達到O. 42，該菌株能夠適應較高及較廣的溫度范圍，因此該菌株的耐高溫性能使其在油田的實際生產中具有廣泛的應用價值。
圖I為微桿菌JNS02在不同溫度條件下的生長情況。
具體實施例方式具體實施方式
一本實施方式的耐高溫石臘降解菌為微桿菌
sp. XJNS02，保藏在中國典型培養物保藏中心，其保藏編號為CCTCC NO M 2012022。該微桿菌JNS02在LB平板上生長I天形成直徑約I 3mm的菌落，菌落圓形，凸起，表面濕潤，邊緣整齊，半透明。單細胞，呈短桿狀，革蘭氏陽性。呼吸代謝，產熒光、不產生H2S、吲哚、甲基紅；具有硝酸鹽還原性和反硝化能力，具有液化明膠能力，能利用葡萄糖、蔗糖。該微桿菌JNS02是從大慶油田被原油污染的水樣中經分離、純化獲得。具體步驟如下取被原油污染的水樣5ml加入50ml含有質量體積比為1%的原油的液體無機鹽基本培養基中，在30°C、轉速200r/min條件下震蕩培養7天，然后以10%的體積比的接種量接種到新的含有質量體積比為1%的原油的液體無機鹽基本培養基中，在30°C、180r/min條件下震蕩培養7天，再繼續轉接，重復這ー過程3 5次。將培養的菌液稀釋1000000倍涂布到含有質量體積比為I. 6%的瓊脂LB固體培養基上，30°C條件下靜止培養36小吋。選取長出的單菌落繼續接50ml含有質量體積比為1%的原油的液體無機鹽基本培養基中，在30°C、180r/min條件下震蕩培養7天，篩選能夠利用原油作為唯一碳源和能源生長的菌株，最終獲得ー株降解能力較好的菌株。經過穩定性實驗表明，該菌株具有非常高的穩定性，連續培養后降解原油的能力沒有降低。所述的無機鹽培養基的配方為=KH2PO4 O. 5g/L, K2HPO4 4 g/L，NH4Cl I g/L，質量百分比為1%的CaCl2 2 ml/L，質量百分比為10%的MgCl2 · 6H20 2 ml/L，質量百分比為1%的FeCl3 200 μ 1/L，維生素混合液200 ml/L，離子混合液5 ml/L，配制好后在121で條件下滅菌20 mirio所述的離子混合液的配方為姆升蒸懼水含有=ZnCl2 O. 5g, FeCl2 0.5 g,MnCl2 · 4H20 O. 5g, Na2MoO4 · 2H20 0. lg, CuCl2 · 2H20 0. 05g, Na2WO4 · 2H20 0. 05g, HCl 120mmol/Lo所述的維生素混合液的配方為姆升蒸懼水含有400 mg泛酸 丐,200 mg肌醇，400 mg尼克酸/畑酸，400 mg VB6,200 mg對氨基苯甲酸，O. 5 mg VB12。所述的LB培養基配方為1升蒸懼水中含10g蛋白胨,5g酵母粉，IOg Nacl ;固體LB培養基在上述配方的基礎上加入質量體積比為I. 6%的瓊脂粉，在121で條件下滅菌20分鐘。將上述菌株進行16S rDNA基因提取并測序，其基因序列長度為1452 bp，核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示。該菌株的16S rDNA基因序列參照《Bergey’ s Mannual ofSystematic Bacteriology)) Vol. VtO內容,根據其生理生化特征和16S rDNA基因序列，通過NCBI BLASTn程序比對,本實施方式的菌株與#icroAacteritt sp. A95的16S rDNA基因序列同源為99%，鑒定本發明的菌株為微桿菌屬的ー個新菌種，并將其命名為微桿菌{Mi crobac teri um sp.)JNS02o具體實施方式
ニ 本實施方式將具體實施方式
一的微桿菌
sp. ) JNS02用于清蠟實驗，具體步驟如下實驗組將ー小段鋼管的表面包裹固體石蠟，然后放入裝有微桿菌JNS02發酵液的三角瓶中，靜置培養36小吋。對照組將ー小段鋼管的表面包裹固體石蠟，然后放入裝有蒸餾水的三角瓶中，靜置培養36小吋。實驗結果見表I。通過觀察實驗結果及表I中的數據可知，空白組的鋼管上的石蠟基本沒有變化，清蠟率僅 為2. 4%，基本可以忽略，而浸泡在微桿菌JNS02發酵液中的鋼管上包裹的固蠟已經呈網狀，有的固體石蠟已經剝離，并且剝離下的固體石蠟變軟或已經溶解，經測定，清蠟率可達59%。因此，該微桿菌JNS02可用于油田生產過程中的清蠟操作，也可用于防止結蠟情況的發生。表I清蠟實驗結果。
m試驗次數1ig)聲用前后固體<g> 細率
桿菌 INS02 I 2J39IJMl59%
2umI·545%
33.m1J2849J%
—空 __I__2-7 __2703__2Λ%_具體實施方式
三本實施方式對具體實施方式
一的微桿菌sp.)JNS02在不同溫度下的生長情況進行了測定，實驗具體步驟如下(I)斜面培養將微桿菌JNS02接種于含有質量體積比為I. 5%的瓊脂的LB固體培養基中，在30°C條件下，靜止培養24h；(2)種子培養將步驟(I)中培養的菌株在無菌條件下用接種環接I 2環于5ml液體培養基中，在30°C條件下，振蕩培養12h，將培養物用無菌的O. 85%生理鹽水洗滌三次，制得種子液；(3)將步驟(2)中制得得種子液按照5%接種量接種到IOml含有2% (w/v)柴油的無機鹽培養基中，在30°C、37 °C、40 V、45 °C、50 V、55 °C、60 V、65 V和70 V條件下，振蕩培養24h，測定620nm吸光度，實驗結果見圖I。所述的無機鹽培養基及LB固體培養基的配方同具體實施方式
一。由圖I中的實驗結果可知，微桿菌JNS02能夠在3(T70°C條件下生長，最適生長溫度為45°C，在此溫度下OD62tl達到I. 5 ;隨著溫度的升高生長變慢，但在70°C時OD62tl仍可達到O. 42，說明微桿菌JNS02能夠適應較高及較廣的溫度范圍，因此該菌株的耐高溫性能使其在油田的實際生產中具有廣泛的應用價值。
權利要求
1.一株耐高溫石臘降解菌，該菌株為微桿菌sp. )JNS02,保藏在中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO M 2012022。
2.如權利要求I所述的耐高溫石蠟降解菌在清防蠟中的應用。
全文摘要
一株耐高溫石蠟降解菌及其在清防蠟中的應用。屬于石油微生物領域。它解決了目前缺少耐高溫高效的石蠟降解菌株的問題。本發明耐高溫石蠟降解菌為微桿菌(Microbacteriumsp.)JNS02，保藏在中國典型培養物保藏中心，其保藏編號為CCTCCNOM2012022。本發明微桿菌NS02的清蠟率可達59%，并能夠在30~70℃條件下生長，能夠適應較高及較廣的溫度范圍，因此該菌株的耐高溫性能使其在油田的實際生產中具有廣泛的應用價值。
文檔編號C12R1/01GK102660475SQ20121013727
公開日2012年9月12日 申請日期2012年5月7日 優先權日2012年5月7日
發明者蓋忠輝, 蔣立民 申請人:黑龍江吉納森生物工程股份有限公司