專利名稱：能夠同時檢測CymMV和ORSV的RT-PCR檢測試劑盒及方法
技術領域：
本發明涉及一種能夠同時檢測建蘭花葉病毒(Cymbidium mosaic virus, CymMV)和齒蘭環斑病毒(Odontoglossum ringspot virus, 0RSV)的RT-PCR檢測試劑盒及其檢測方法。
(ニ)
背景技術：
建蘭花葉病毒(Cymbidium mosaic virus, CymMV)是侵染蘭花最常見的兩種病毒之一。CymMV隸屬線形病毒科(Flexiviridae)、馬鈴薯X病毒屬(Potexvirus), CymMV病毒粒子為線狀正鏈單鏈RNA (+ssRNA),大小約為475nmX13nm或為490nmX 13nm,病毒外殼無包膜，線行彎曲，螺旋對稱延伸，螺紋明顯，螺距2. 8nm，5’端有甲基化結構，3’端帶有 poly(A)尾巴，病毒RNA基因組全序列約6_7kb，整個基因組由5個開放讀碼框架(ORF)構成，編碼為 RDRP (160KDa)、TGB (26KDa/13KDa/10KDa)以及 CP (24KDa)，其中 CP 基因是完整地0RF5框，長約700nt，編碼24kD的外殼蛋白，與該同屬的其它成員有很高的同源性。齒蘭環斑病毒(Odontoglossum ringspot virus, ORSV)也是侵染蘭花最常見的兩種病毒之一，曾經被命名為煙草花葉病毒蘭花株系，ORSV隸屬煙草花葉病毒屬(Tobamovirus), ORSV病毒粒子形狀為立體桿狀，大小為300nmX 18nm,螺距對稱，螺紋明顯，ORSV病毒粒體由衣殼蛋白和+ssRNA組成，衣殼蛋白無包膜，單組分或多組分，5’端含有甲基化帽子結構m7G5’PPP5，3’端帶有類似t_RNA的結構。病毒RNA基因組全序列約6_7kb，是煙草花葉病毒屬中最長的，包含4個0RF，基因組RNA編碼181KDa的通讀蛋白分別含126kDa RdRp蛋白、34kDa運動蛋白、52kDa推斷復制酶蛋白和18kDa外殼蛋白。CP基因位于最后ー個0RF，長約470bp，編碼ISkD的外殼蛋白，與該同屬的其它成員也有很高的同源性。蘭科植物受CymMV和ORSV病毒病嚴重侵害而無法根治的問題，其中復合侵染率高，一旦感染了這兩種病毒，蘭花的葉片將會形成褪綠條紋、凹陷的灰白斑或者是壞死圈斑等癥狀，導致植株生長不良、開花小而少、花期縮短、使植株的觀賞價值大為下降，造成巨大經濟損失，是阻礙蘭科植物正常生長、蘭科珍惜種質資源保存及蘭花產業發展的重要瓶頸。常規的病毒血清學檢測方法普遍存在靈敏度不高的缺點，而一般的分子檢測病毒，RNA提取質量的好壞對實驗結果影響很大，而RNA又特別容易降解，提取技術要求高；同吋，要檢測兩種蘭花病毒必須要設計針對兩種病毒的不同引物對，檢測的過程也要分開進行，費時費力。
發明內容
本發明目的是提供ー步RT-PCR同時檢測CymMV和ORSV兩種主要的蘭花病毒的試劑盒及方法。本發明采用的技術方案是一種能夠同時檢測CymMV和ORSV的RT-PCR檢測試劑盒，主要包括特異性簡并引物以及PCR反應試劑，所述簡并引物核苷酸序列如下上游引物5’-TYAAMAMTKKCGAGAAAG-3’ ；
下游引物5’-TYGKGWMCRGTGTTAAT-3’ ；其中Y、M、K、W、R為簡并堿基，Y為C或T，M為A或C，K為G或T，W為A或T，R為A或G。簡并引物是獲得序列未完全清楚的核酸的一種引物設計方案，特點是所設計的引物序列某位置的核苷酸可以分別是兩個或兩個以上不同的堿基，結果所合成的引物是該位置上不同序列的混合物。本申請發明人利用NCBI上的CymMV與ORSV病毒核酸信息，通過DNAMAN軟件對兩種蘭花病毒進行同源比對(Ktuple=6, Gap_penalty=7),設計了同時針對兩種病毒的一對簡并引物，引物序列及結合位點見圖I。預期擴增目的條帶大小分別為CymMV 558bp ；0RSV 825bp。本發明的關鍵在于簡并引物的設計，試劑盒中其他組成，可按本領域常規進行選擇。PCR反應試劑包括PCR緩沖液、脫氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合酶等，其中PCR緩沖液可采用市購商品，也可自行配制，例如將Tris-HCl、KCl,MgCl2等按比例混合進行配制，進 行檢測時，將PCR反應試劑和擴增引物混合，再加入待測樣品，即可進行PCR擴增反應。本發明還涉及ー種ー步RT-PCR檢測CymMV和ORSV的方法，所述方法包括(I)提取待測蘭花樣品總RNA ;待測樣品一般選擇蘭花葉片上有局部褪綠、黃化條紋的部分；(2 )樣品總RNA經反轉錄獲得其cDNA ；(3)以樣品cDNA為模板，加入簡并引物和PCR反應試劑，進行PCR擴增，擴增產物進行凝膠電泳，若電泳結果出現558bp條帶，則表示樣品中含有CymMV ;若樣品中出現825bp條帶，則表示樣品中含有ORSV ;反之，則表示樣品中不含有CymMV或ORSV ;所述簡并引物核苷酸序列如前所述。PCR產物也可測序后到NCBI里進行Blast同源比對以進ー步驗證其結論。所述PCR反應程序如下94°C預變性3分鐘，94°C I分鐘，45°C復性I分鐘，68°C延伸I分鐘，循環次數為30次，68°C延伸5分鐘。本發明的有益效果主要體現在本發明通過設計能針對兩種病毒的簡并引物，建立了同時檢測兩種蘭花病毒的一歩RT-PCR檢測試劑盒和方法，實踐證明，該方法高效、快捷、準確，不失為ー種好的病毒檢測方法。
圖I為DNAMAN軟件對ORSV及CymMV進行同源比對，展示出了簡并引物結合的具體位點；數字表示核苷酸的位置，兩種病毒序列中完全一致的核苷酸序列用“ I ”表示；a:上游引物序列及結合位點；b :下游引物序列及結合位點；圖2為6個品種35個樣品免疫捕獲RT-PCR電泳圖；1 15 :四季蘭；16 28 :墨蘭；29 :慧蘭;30、31 :金釵石斛;32、33 :春蘭;34、35 :蝴蝶蘭；M:Marker DL2000。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述，但本發明的保護范圍并不僅限于此實施例I :
I、材料與方法I. I實驗材料墨蘭(Cymbidium sinensis)、建蘭(Cymbidium ensifolium)、四李蘭(Cymbidiumensifolium var ruDrigemmum;>(Cymbidium faberi(Cymbiaium goeringiiノ、金釵石斛(Dendrobium Stem)、來自于廣東汕頭，蝴蝶蘭(Phalaenopsis amabilis)來自杭州市農業科學研究院。所有葉片樣品采集有局部褪綠、黃化條紋的部分。I. 2 試劑BioRT cDNA第一鏈合成試劑盒購自杭州博日科技，內含AMVReverseTranscriptaseλ5 X RT Buffer、dNTP Mixture、RNase inhibitor、Random Primer、RNase-free H2O ； Taq酶購自上海生エ生物技術有限公司。T/A 克隆測序試劑盒Target Clone , TOYOBO0酵母浸出液，蛋白胨為國產分析純。I. 3 方法I. 3. I 提取總 RNA(I)取Ig待測葉片用液氮研磨，裝入DEPC處理過的I. 5mL EP管中，加入ImLTrizol (購于Invitrogen公司),鏇潤振蕩；(2)4°C，4000r/min，離心15分鐘，將上清液轉移至新的EP管中，冰上靜置15分鐘；(3)加入200 μ L預冷的氯仿，充分漩渦30秒，冰上靜置5分鐘；(4) 4°C，4000r/min，離心15分鐘，將上清液轉移至新的EP管中，并置于冰上；(5)加入500 μ L預冷的異丙醇，振蕩混勻，冰上放置10分鐘；(6) 4°C, 4000r/min,離心 30 分鐘，棄上清；(7)加入ImL 80%預冷的こ醇洗漆沉淀,輕微振蕩,4°C, 4000r/min,離心5分鐘,棄
上清；( 8 )重復(7 )步驟一次；(9)室溫干燥10分鐘；(10)在冰上加入55 μ L Rnase-free無菌水，冰上放置10分鐘，重懸RNA溶解；(11) IyL上述RNA稀釋至500倍測濃度；(12)取 I μ L 總 RNA(稀釋成 5 μ L) +5 μ L 2XRNA loading buffer, 65°C水浴 5 分鐘，1%瓊脂糖凝膠電泳。I. 3. 2 反轉錄按照試劑盒的使用說明，加入Rnase-free H2O 3. 5μ L.5XRT Buffer2 μ L、2mMdNTP I μ L、下游簡并引物 O. 5μ L (20 μ M/μ L)、Rnase inhibitorO. 5 μ L、模板 RNA 2 μ L、AMV Reverse transriptase 0. 5 μ L,總體積 10 μ し反轉錄程序為48°C 45 分鐘之后 94°C 3分鐘。反轉錄完成后冰上放置3分鐘。1.3.3PCR 擴增取反轉錄產物2μ L做為模板，上、下游簡并引物(20 μ M/μ L)各0. 5 μ L、10 X PCRBuffer (購于 Invitrogen 公司)2. 5 μ L、25mM MgCl2 I. 5 μ L、2mMdNTP 2· 5 μ L、Taq 酶O.3 μ L，加滅過菌的雙蒸水到總體積25 μしPCR程序為94°C預變性3分鐘，94°C I分鐘，45 °C復性I分鐘，68 °C延伸I分鐘，循環次數為30次，68°C延伸5分鐘。反應結束以后取5 μ L擴增產物于1%瓊脂糖凝膠上進行電泳。I. 3. 4PCR產物Τ/Α克隆后測序取CymMV及ORSV PCR擴增產物做Τ/Α克隆，具體的操作依據試劑盒說明書。重組載體轉DH5 α感受態細胞，之后倒LB固體培養基平板，37°C培養12 16小時后藍白斑篩選。挑取白色的單斑于LB液體培養基搖菌過夜。第二天用菌液做PCR模板，進行PCR驗證找出陽性重組載體。挑選出的重組載體菌液取ImL送上海Invitrogen公司測序。I. 4結果與分析I. 4. I 提取總 RNA、RT-PCR 擴增
·
對6種35個樣進行提取總RNA后RT-PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳檢測發現有31份呈陽性，檢出率為88% (31/35)，其中感染ORSV為77% (27/35)，感染CymMV為25% (9/35)，復合感染率為14% (5/35)(圖2)。這說明這一地區中齒蘭環斑病毒流行率較高，同時也存在一定量的復合感染。PCR擴增與預計擴增條帶大小基本一致，CymMV 558bp ;0RSV825bp。I. 4. 2T/A克隆測序結果PCR產物T/A克隆后菌液送Invitrogen公司測序，代表性序列的測序結果到NCBI里進行Blast同源比對，結果表明PCR擴增的CymMV條帶序列(SEQ ID No. 3)(11號樣品)與編號AF016914. I的建蘭花葉病毒韓國株2型全基因組序列97%同源；0RSV條帶序列(SEQID No. 4) (23號樣品)與NCBI中編號AY571290. I齒蘭環斑病毒臺灣株全基因組的同源性高達99%,進ー步驗證了檢測結果。
權利要求
1.一種能夠同時檢測CymMV和ORSV的RT-PCR檢測試劑盒，主要包括特異性簡并引物以及PCR反應試劑，其特征在于所述簡并引物核苷酸序列如下 上游引物5’ -TYAAMAMTKKCGAGAAAG-3’ ； 下游引物5’ -TYGKGWMCRGTGTTAAT-3’ ； 其中Y、M、K、W、R為簡并堿基，Y為C或T，M為A或C，K為G或T，W為A或T，R為A或G0
2.—種ー步RT-PCR檢測CymMV和ORSV的方法，所述方法包括 (1)提取待測蘭花樣品總RNA; (2)樣品總RNA經反轉錄獲得其cDNA； (3)以樣品cDNA為模板，加入簡并引物和PCR反應試劑，進行PCR擴增，擴增產物進行凝膠電泳，若電泳結果出現558bp條帶，則表示樣品中含有CymMV ;若樣品中出現825bp條帶，則表示樣品中含有ORSV ;反之，則表示樣品中不含有CymMV或ORSV ； 所述簡并引物核苷酸序列如下 上游引物5’ -TYAAMAMTKKCGAGAAAG-3’ ； 下游引物5’ -TYGKGWMCRGTGTTAAT-3’ ； 其中Y、M、K、W、R為簡并堿基，Y為C或T，M為A或C，K為G或T，W為A或T，R為A或G0
3.如權利要求2所述的方法，其特征在于所述PCR反應程序如下94°C預變性3分鐘，940C I分鐘，45°C復性I分鐘，68°C延伸I分鐘，循環次數為30次，68°C延伸5分鐘。
全文摘要
本發明提供了一種能夠同時檢測CymMV和ORSV的RT-PCR檢測試劑盒，主要包括特異性簡并引物以及PCR反應試劑，所述簡并引物核苷酸序列如下上游引物5’-TYAAMAMTKKCGAGAAAG-3’；下游引物5’-TYGKGWMCRGTGTTAAT-3’；本發明通過設計能針對兩種病毒的簡并引物，建立了同時檢測兩種蘭花病毒的一步RT-PCR檢測試劑盒和方法，實踐證明，該方法高效、快捷、準確，不失為一種好的病毒檢測方法。
文檔編號C12Q1/70GK102676695SQ20121013969
公開日2012年9月19日 申請日期2012年5月7日 優先權日2012年4月16日
發明者施農農, 楊科府, 章鵬程, 陳芝娟 申請人:杭州師范大學