專利名稱：一株Pseudomonas psychrophila Den-03低溫好氧反硝化菌及其篩選方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物工程、環境工程技術領域,涉及菌株Pseudomonas psychrophilaDen-03的篩選及其在低溫污水脫氮過程中的應用。
背景技術：
進入21世紀，全球性的水資源危機給人類帶來巨大困擾，尤其我國作為ー個發展大國，經濟發展迅速，加速水污染治理已經成為我國加強水資源保護的主要目標之一。集中排放的城鎮生活污水的氨氮，大量化肥產生的硝態氮等各種形式氮元素積存，加劇了湖泊水體富營養化的程度，影響并制約了社會經濟的發展。“十二五”期間，我國在已有及新建的污水處理廠中，執行《城市污水處理廠污水綜合排放標準》(GB18918-2002) ー級A標準(氨氮<5mg/L，TN〈15mg/L)，表明城市污水處理的目標已經逐漸從關注COD和懸浮固體的去除擴大到氮等有機營養物質的去除。因此，開發經濟高效的生物脫氮方法和技術已成為水污染控制領域熱點之一。由于好氧反硝化較傳統生物脫氮技術存在著明顯的優勢，近年來好氧反硝化技術成為了國內外廢水生物脫氮新的發展方向。馬放等人針對好氧反硝化菌在環境中數量較少，不易形成優勢種群，直接篩選難度較大，有可能篩到的菌反硝化效率不高的特點，采用SBR反應器，通過間歇曝氣和連續曝氣兩種方式均對活性污泥體系中好氧反硝化菌起到了選擇和富集的作用，并開發出了相應的試驗裝置。好氧反硝化應用的主體是好氧反硝化菌群，到目前為止，好氧反硝化菌主要集中在假單胞菌屬(Pseudomonas)、產堿桿菌屬(Alcaligenes)、副球菌屬(Paracoccus)和芽孢桿菌屬(Bacillus),菌種應用及機理研究較多，而低溫好氧反硝化菌的報道則較少。為此，從自然界篩選出低溫條件下可顯著提高生物脫氮效率的菌株，并將其制成生物菌制劑，應用于此類污染的治理將有著實際的應用價值。
發明內容
本發明的目的在于為好氧反硝化技術的應用提供高效的菌劑，強化低溫生物脫氮的效能，從自然界中分離出Pseudomonas psychrophila Den_03,能夠在低溫環境下提高生物脫氮的效率，對低溫城市污水的穩定運行奠定理論基礎。本發明能為現有城市污水廠提供低溫高效生物脫氮菌制劑，強化低溫生化系統的脫氮效能，從自然界中分離出菌株Pseudomonas psychrophila Den_03,能夠在低溫環境中促進N素的轉化效率，是ー株低溫好氧反硝化菌株，適宜冬季城市污水處理。本發明的技術解決方案是，本發明提供的菌株為Pseudomonas psychrophiliaDen-03，為革蘭氏陰性假單胞菌，于2012年03月27日保藏于“中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心”(北京市朝陽區北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所)，其 保藏號 CGMCC NO. 5941。
該菌株Pseudomonas psychrophila適宜在中性(pH 7. 2)的培養介質中生長，生長溫度為10 oC。其細菌學形態特征為革蘭氏陰性假單胞菌，無鞭毛，細胞為黃白色，好氧，接觸酶陽性，氧化酶陽性，可進行反硝化作用，能夠以硝態氮為能源生長。菌株Pseudomonas psychrophila Den-03是從哈爾濱城市污水廠好氧池活性污泥中分離得到。從哈爾濱城市污水廠好氧反應池采集活性污泥樣品，作為菌源進行馴化培養，整個培養過程均在低溫(10°c)條件下進行。即將所取污泥到好氧反硝化培養基中馴化，馴化采用一次性投加高濃度化合物的馴化方法，每個馴化周期結束時，將培養物取一定體積加入到新鮮的好氧反硝化培養基中，將此混合菌液涂布在好氧反硝化固體基礎培養基上，反復進行平板涂布，分離出ー株具有高效低溫好氧反硝化能力的菌株psychrophi Ia。具體按以下步驟進行
1)冬季從哈爾濱城市污水處理廠取IOmL新鮮活性污泥加入IOOmL好氧反硝化培養基 三角瓶中，置于溫度為10°C、轉速為150r/min的搖床中培養48h，獲得富集菌液；
2)取IOmL富集菌液加入IOOmL好氧反硝化培養基三角瓶中，重復步驟I)的培養條件，獲得馴化菌液；
3)取100μ L馴化菌液加入固體好氧反硝化培養基平板中，涂布法涂勻，置于溫度為10°C的培養箱中，培養48 72h，獲得單菌落；
4)重復操作步驟3)3^4次，即完成低溫好氧反硝化菌的獲得；
其中所述的好氧反硝化培養基組成為7.9 g/L Na2HPO4 ·7Η20、0. 3 g/L NH4Cl、4. 7 g/L檸檬酸鈉、I. 5 g/L KH2P04、0. I g/L MgSO4 · 7H20、1. 5 g/L KNO3, 2mL 微量元素液溶于 1000mL蒸餾水中，調節pH 7. 2 ；
微量元素液的組成EDTA 50; ZnSO4 2. 2 g /L; CaCl2, 5. 5 g /L; MnCl2 · 4 H2O 5.0g /L; FeSO4 · 7 H2O 5 g /L; ( NH4 ) 6Mo702 · 4 H2O I. I g /LjCuSO4 · 5 H2O I. 57 g /L;CoCl2 · 6H20 I. 61 g /L ；pH:7. 2。步驟2)中馴化菌液的0D_值為I. 0，好氧反硝化培養基均在121°C下滅菌30 min以后使用。經過菌種鑒定，得到了長度為1501bp的16S rDNA序列。PCR 引物采用細菌 16S rDNA 的通用引物 27F :5’ -AGAGTTTG ATCCTGGCTCAG-3’ 和1492R :5’ -GGTTACCTTGTTACGACT-3’。PCR 擴增反應體系總體積為 50 μ :超純水 36 μ ,10 X Buffer 5 μ , dNTP 4 PL，27F 引物 I PL，1492R 引物 I μ ，rTaq 酶 I μ ，總 DNA 2 μ 于反應體系中。擴增儀器為PCR儀(GeneAmp，PCR System 9700)，PCR擴增反應條件為94oC預變性5 min,經過30個循環，其中，94 oC變性30 S，55 oC退火40 S，72 oC延伸30s，30個循環后再在72 oC延伸8 min，l%瓊脂糖凝膠電泳，紫外檢測。通過Blast程序進行同源性比較，表明該菌株與Pseudomonas psychrophila的同源性高達99%。本發明的菌株Pseudomonas psychrophila Den-03在應用前需在好氧反硝化培養基中進行馴化，培養條件為菌株在10°c,pH 7. 2,低溫好氧培養。該菌株對低溫生境中硝酸鹽的降解能力極強，且具有廣泛的底物廣譜性。本發明提供的菌株Pseudomonas psychrophila在低溫城市污水處理過程中具有較強的反硝化能力，活化簡単，在低溫條件下生長較快，在溶解氧充足條件下，提高冬季的城市污水廠氮轉化率，提高冬季城污廠生產效率，降低能耗。由于其低溫好氧條件下可大量繁殖的特點，使其在低溫條件下處理多種城市污水過程中具有極大潛力，可以應用于大規模的低溫城市污水處理的脫氮過程中。該菌株對低溫生活污水中的TN去除率達到74%。本發明在保證脫氮效率穩定的前提下，提高了冬季城市污水處理系統脫氮率、提高生產效率，降低生產能耗，對于實現短程同步硝化反硝化的具有重大意義。
圖I是本發明的好氧反硝化菌96小時的菌體生長情況及污染物降解率變化。其中·表示好氧反硝化菌在96小時生長周期中的菌濁，柱形圖□為96小時好氧反硝化菌生長周期中的污染物降解率。圖2是本發明的好氧反硝化菌低溫反硝化過程中不同硝態氮濃度的去除率趨勢。其中·表示好氧反硝化菌在硝酸鹽初始濃度100mg/L時的降解轉化率，其中·表示好氧反硝化菌在硝酸鹽初始濃度80mg/L時的降解轉化率，其中▲表示好氧反硝化菌在硝酸鹽初 始濃度60mg/L時的降解轉化率，其中▼表示好氧反硝化菌在硝酸鹽初始濃度40mg/L時的降解轉化率。圖3是本發明的好氧反硝化菌低溫反硝化過程中亞硝氮積累轉化趨勢。其中·表示SBR反應器中配水進水濃度，其中·表示SBR反應器中單純含有活性污泥的亞硝氮轉化趨勢，其中▲表示SBR反應器中含活性污泥和低溫好氧反硝化菌的亞硝氮轉化趨勢。
具體實施例方式具體實施方式
一本實施方式提供好氧反硝化菌的篩選步驟
一、冬季從哈爾濱城市污水廠取IOmL新鮮活性污泥加入IOOmL好氧反硝化培養基三角瓶中，置于溫度為10°C，轉速為150r/min的搖床中培養48h，獲得富集菌液；ニ、取IOmL富集菌液加入IOOmL好氧反硝化培養基三角瓶中，重復步驟一的培養條件，獲得馴化菌液；三、取100 μ L馴化菌液加入固體好氧反硝化培養基平板中，涂布法涂勻，置于溫度為10°C的培養箱中，培養48 72h，獲得單菌落；四、重復操作步驟三3 4次，即完成低溫好氧反硝化菌的獲得；五、其中步驟四獲得的低溫好氧反硝化菌，屬于psychrophilia,保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號CGMCC NO. 5941 ；
其中所述的好氧反硝化培養基組成為7.9 g/L Na2HPO4 ·7Η20、O. 3 g/L NH4Cl、4. 7 g/L檸檬酸鈉、I. 5 g/L KH2P04、0. I g/L MgSO4 · 7H20、1. 5 g/L KNO3, 2mL 微量元素液溶于 1000mL蒸餾水中，調節pH 7. 2 ；
微量元素液的組成EDTA 50; ZnSO4 2. 2 g /L; CaCl2, 5. 5 g /L; MnCl2 · 4 H2O 5.0g /L; FeSO4 · 7 H2O 5 g /L; ( NH4 ) 6Mo702 · 4 H2O I. I g /LjCuSO4 · 5 H2O I. 57 g /L;CoCl2 · 6H20 I. 61 g /L ；pH:7. 2。
步驟2)中馴化菌液的0D_值為I. O,好氧反硝化培養基均在121°C下滅菌30 min以后使用。
具體實施方式
ニ取具體實施方式
一中獲得的低溫好氧反硝化菌單菌落于裝有滅菌的好氧反硝化培養基中低溫好氧培養96h，轉速150r/min，即為低溫好氧反硝化菌的生長降解曲線。結果如圖I所示，96h的好氧反硝化菌0D_趨于穩定達到I左右。污染物降解率達到70%，說明本實施方式獲得的好氧反硝化菌具有良好的降解能力。
具體實施方式
三與具體實施方式
ニ不同的是將培養96h后的好氧反硝化菌液置于SBR反應器。根據四個不同硝態氮濃度100mg/L、80mg/L、60mg/L、40mg/L分別裝入四個三角瓶SBR反應器中，每個500mL三角瓶中加入10%的活性污泥，IO0C培養，150 r/min，好氧培養10d。反應周期ー個周期12h，進水O. 5h，曝氣8h，沉淀2h，排水和閑置時間I. 5h。結果如圖2所示，隨著培養時間的延長，8d不同濃度硝態氮降解效果明顯，硝態氮濃度均達到20mg/L以下，說明本實施所用的低溫好氧反硝化菌具有良好的反硝化能力。
具體實施方式
四與具體實施方式
三不同的是將培養96h后的低溫好氧反硝化菌液置于SBR反應搖瓶中。一個搖瓶中單純采用活性污泥處理配水進水，另ー個搖瓶采用活性污泥加入本實施獲得的低溫好氧反硝化菌液共同處理配水進水。
本實施中配水進水各種營養元素比例按照城市生活污水比例配制。本實施中SBR反應周期與具體實施方式
三相同。SBR連續運行23d，亞硝氮的濃度變化結果如圖3所示，亞硝酸鹽在SBR運行初期有明顯的積累，運行IOd之后加入本實施制備的低溫好氧反硝化菌的反應搖瓶中亞硝酸鹽的含量急劇下降，隨著周期的延長亞硝酸鹽的含量趨于穩定，平均濃度維持在10mg/L左右。單純活性污泥的反應搖瓶亞硝酸鹽的含量在累積過后無下降趨勢，平均濃度維持在65mg/L左右。說明本實施制備的低溫好氧反硝化菌有較強的好氧反硝化能力，可以應用于大規模的低溫城市污水處理的脫氮過程中。
權利要求
1.一株·Pseudomonas psychrophila Den_03低溫好氧反硝化菌,其特征在于為革蘭氏陰性假單胞菌，于2012年03月27日保藏于“中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心”，其保藏號CGMCC NO. 5941。
2.根據權利要求I所述的低溫好氧反硝化菌，其特征在于菌株適宜在中性(pH7. 2)的培養介質中生長，生長溫度為10°C，無鞭毛，細胞為黃白色，好氧，接觸酶陽性，氧化酶陽性，可進行反硝化作用，能夠以硝態氮為能源生長。
3.根據權利要求I或2所述的ー株Aewt/offlmaspsychrophila Den_03低溫好氧反硝化細菌的篩選方法，其特征在于按以下步驟進行 1)冬季從哈爾濱城市污水處理廠取IOmL新鮮活性污泥加入IOOmL好氧反硝化培養基三角瓶中，置于溫度為10°C、轉速為150r/min的搖床中培養48h，獲得富集菌液； 2)取IOmL富集菌液加入IOOmL好氧反硝化培養基三角瓶中，重復步驟I)的培養條件，獲得馴化菌液； 3)取100μ L馴化菌液加入固體好氧反硝化培養基平板中，涂布法涂勻，置于溫度為10°C的培養箱中，培養48 72h，獲得單菌落； 4)重復操作步驟3)3^4次，即完成低溫好氧反硝化菌的獲得； 其中所述的好氧反硝化培養基組成為7.9 g/L Na2HPO4 ·7Η20、O. 3 g/L NH4Cl、4. 7 g/L檸檬酸鈉、I. 5 g/L KH2P04、0. I g/L MgSO4 · 7H20、1. 5 g/L KNO3, 2mL 微量元素液溶于 1000mL蒸餾水中，調節pH 7. 2 ；微量元素液的組成EDTA 50; ZnSO4 2. 2 g /L; CaCl2, 5. 5 g /L; MnCl2 · 4 H2O 5.0g /L; FeSO4 · 7 H2O 5 g /L; ( NH4 ) 6Mo702 · 4 H2O I. I g /LjCuSO4 · 5 H2O I. 57 g /L;CoCl2 · 6H20 I. 61 g /L ；pH:7. 2。
4.根據權利要求3所述的篩選方法，其特征在于步驟2)中馴化菌液的0D_值為1.0。
5.根據權利要求3所述的篩選方法，其特征在于好氧反硝化培養基均在121°C下滅菌30 min以后使用。
6.根據權利要求I或者所述的低溫好氧反硝化菌，其特征在于菌株應用于大規模的低溫城市污水處理的脫氮過程中。
全文摘要
一株PseudomonaspsychrophilaDen-03低溫好氧反硝化細菌，屬于生物工程、環境工程技術領域，菌株適宜在中性(pH7.2)的培養介質中生長，生長溫度為10℃，無鞭毛，細胞為黃白色，好氧，接觸酶陽性，氧化酶陽性，可進行反硝化作用，能夠以硝態氮為能源生長，經篩選獲得的該菌株解決了北方低溫城市污水處理過程中存在生產效率低、提升冬季脫氮效率等問題，其對低溫生活污水中的TN去除率達到74%，在保證脫氮效率穩定的前提下，提高了冬季城市污水處理系統脫氮率、提高了生產效率，降低了生產能耗，對于實現短程同步硝化反硝化的具有重大意義。
文檔編號C12N1/02GK102690765SQ201210139980
公開日2012年9月26日 申請日期2012年5月8日 優先權日2012年5月8日
發明者孔祥震, 崔迪, 龐長瀧, 張斯 , 李昂, 蔡蕊, 邱天, 馬放 申請人:哈爾濱工業大學宜興環保研究院