專利名稱：一種表達角蛋白酶的重組菌及其發酵方法
技術領域：
本發明涉及酶領域，具體涉及ー種表達角蛋白酶的重組菌及其發酵方法。
背景技術：
角蛋白是ー種堅硬的不溶性蛋白，分為α-角蛋白和β-角蛋白，α-角蛋白是毛發中主要蛋白質，β_角蛋白主要存在于動物的羽毛、皮膚、爪和鱗片中。由于高度交聯的胱氨酸殘基形成的ニ硫鍵、分子間的疏水作用以及氫鍵作用，角蛋白難以被膜蛋白酶、胃蛋白酶和木瓜蛋白酶等降解，傳統高壓水解、酸堿蒸煮降解羽毛的方法耗能高，破壞熱敏性氨基酸并污染環境。角蛋白酶是降解角蛋白的ー類酶，由真菌、放線菌和細菌等多種微生物產生，主要 是金屬蛋白酶和絲氨酸蛋白酶，其用于酶降解角蛋白，不存能耗高、污染強的問題，具有巨大的應用價值和研究前景。角蛋白酶不僅可以用于對角蛋白廢棄物如羽毛、豬毛、羊毛等的降解，而且在肥料、醫藥、食品、洗滌劑和制革等エ業中廣泛應用，具有生產高級營養品、飼料添加剤、美容、軟化皮革、嫩化肉類等作用，并可降解引起人類新克雅氏癥和瘋牛病的Prion蛋白(PrPSc構象)，從而消滅朊病毒，更使其成為世界性的研究熱點。角蛋白酶的應用領域十分廣泛，但由于天然菌株中角蛋白酶產量較低、生產成本昂貴、難以エ業化生產，分離的角蛋白酶作用緩慢、有效性不夠好，因此角蛋白酶還沒有得到廣泛的實際應用。隨著基因工程技術的發展，通過現代分子生物學技術，構建具有潛在應用價值的高效角蛋白酶基因工程菌株，并改造現有角蛋白酶基因，提高重組酶表達量及其穩定性，為角蛋白酶的エ業化生產、廢棄角蛋白的循環利用和飼料蛋白資源開發提供新的有效途徑。王麗華等，“枯草芽孢桿菌角蛋白酶基因kerC在畢赤酵母中的表達研究”，四川農業大學，2011-06-01公開了ー種利用DNA重組技術將枯草芽孢桿菌B-3的角蛋白酶基因與pPICZ a A質粒重組，并成功地在在巴斯德畢赤酵母X-33中表達，但是其產酶能力低，僅為32. 31U/ml，不能滿足エ業應用的需求。
發明內容
為了解決上述問題，本發明提供了一種新的角蛋白酶及其制備方法。角蛋白酶，keratinase,是ー類可專一地降解角蛋白的蛋白酶。本發明提供了ー種如SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列。還提供了ー種重組載體，它包含SEQ ID NO :I所示的核苷酸序列。其中，所述的重組載體是重組pPICZ a A質粒。還提供了ー種重組菌，它包含前述的重組載體。其中，所述的重組菌為重組畢赤酵母。還提供了ー種角蛋白酶，它由SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列編碼。優選地，它的氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示。
其中，它的最適溫度范圍是50_60°C。其中，它的最適pH范圍為7-10。還提供了前述角蛋白酶的制備方法，包含如下步驟i、取前述重組菌，接種到BMGY培養基上培養，培養溫度為30°C，pH為6，至0D_=2 6 ；ii、收集菌體，將其培養在BMMY培養基中，培養溫度為30°C，pH為6，進行誘導表達，誘導劑為甲醇，每24小時，加甲醇至I %濃度，誘導時間為96 144h ；iii、收集培養物上清，分離純化，即得到角蛋白酶。還提供了前述角蛋白酶的另一種制備方法，包含如下步驟(I)取上述重組菌接種到YPD種子培養基上，pH為5. 5，溫度為30°C下培養，制備得到種子液；(2)取步驟(I)制備的種子液，以5%的接種量接種到發酵培養基中發酵，發酵pH為4. 9，發酵溫度為30°C ；每IL發酵培養基含有如下成分50g葡萄糖、15g磷酸ニ氫鉀、16g硫酸鎂、IOg硫酸鉀、O. 8g氫氧化鉀、O. 8g硫酸鈣、O. 5g消泡劑、4g硫酸銨、Ig增效劑、生物素O. 473mL、微量元素溶液(PTMl) 2. 2mL ；(3)待碳源耗盡后，補加濃度為25%葡萄糖，流加濃度為25%甘油與甲醇的混合物，誘導表達，25%甘油與甲醇的體積比為8:1，甲醇的濃度維持為1%，直至酶活出現指數增長時終止發酵；(4)收集培養物上清，分離純化，即得到角蛋白酶。本發明提供了一種新的表達角蛋白酶的畢赤酵母工程菌，該工程菌生產角蛋白酶的表達量高，且制備的角蛋白酶與天然角蛋白酶性質相似，適合大規模エ業化生產，具有良好的市場應用前景。
圖I地衣芽孢桿菌S90kerA基因擴增結果，其中，MiDNA標準分子量(DL2000) ；1為kerA基因圖2地衣芽胞桿菌角蛋白酶基因T克隆測序結果及其氨基酸序列圖3地衣芽胞桿菌角蛋白酶基因與pPICZ a A連接克隆測序結果圖4畢赤酵母菌落PCR鑒定結果，M為DNA標準分子量，1-4 :含pPICZ a A-kerA的菌落圖5重組畢赤酵母表達產物電泳分析結果圖6重組角蛋白酶基因菌株誘導產酶曲線圖7重組畢赤酵母角蛋白酶分泌量及菌體密度變化曲線圖8重組角蛋白酶最適反應pH圖9重組角蛋白酶最適反應溫度圖10重組角蛋白酶溫度穩定性圖11重組角蛋白酶熱穩定性
具體實施例方式以下通過實施例形式的具體實施方式
，對本發明的上述內容作進ー步的詳細說明。但不應將此理解為本發明上述主題的范圍僅限于以下的實施例。凡基于本發明上述內容所實現的技術均屬于本發明的范圍。實施例I本發明角蛋白酶的制備一、角蛋白酶重組菌的構建(一)角蛋白酶基因片段的制備I、地衣芽胞桿菌基因組DNA提取；2、利用RT-PCR及定點突變技術擴增出角蛋白酶除去信號肽的CDS序列，引物(下劃線為酶切位點，斜體部分為突變堿基)和反應條件如下 引物I (F) :5’ GCTGGTACCGCTCAACCAGCTAAAAATGT-3’ (Kpn I)引物2 (R) :5’ -CGAGCGGCCGCTTGAGCAGCAGCTTCGACATTGAT-3’ (Not I)反應條件為
9.1 °C4 min
94 0C40 s
59°C50 SI 35 cycles
72 UImin」
72 "C10 min3、DNA片段回收割取含目的基因的膠條，用小量柱式凝膠回收試劑盒進行回收；4、在T4DNA連接酶作用下將回收的目的基因片段與T載體連接，得含目的基因(B. Iicheniformis角蛋白酶基因)的T克隆載體；5、瓊脂糖凝膠電泳并測序檢驗擴增得到的目的基因片段。由圖I可知，擴展得到的目的基因片段跟天然角蛋白酶基因片段的大小無差別，由圖2可知，測序證明本發明擴增的到的目的基因片段跟地衣芽孢角蛋白酶基因片段核苷酸序列的數量一祥，有3個堿基的類型有差異(下劃線標記的三個堿基的類型有區別)，且這幾個堿基差異使該基因片段恰好含有與畢赤酵母偏愛的密碼子，有利于角蛋白酶的表達。結果證明，本發明準確地擴增得到了含有畢赤酵母偏愛密碼子的編碼角蛋白酶的目的基因片段(KerA基因片段)，其核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示。(ニ)重組表達載體構建I、質粒雙酶切及片斷回收含目的基因KerA基因片段(B. Iicheniformis角蛋白酶基因)的T克隆載體與表達載體pPICZ a A均用限制性內切酶KpnI和Not I雙酶切；酶切產物經瓊脂糖凝膠電泳純化后回收備用(膠回收純化試劑盒，購自天根生物公司)。雙酶切體系如下
權利要求
1.一種如SEQ ID NO :1所不的核苷酸序列。
2.ー種重組載體，其特征在干包含SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列。
3.根據權利要求2所述的重組載體，其特征在于所述的重組載體是重組PPICZaA質粒。
4.ー種重組菌，其特征在于它包含權利要求2或者3所述的重組載體。
5.根據權利要求4所述的重組菌，其特征在于所述的重組菌為重組畢赤酵母。
6.ー種角蛋白酶，其特征在干它由SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列編碼。
7.根據權利要求6所述的角蛋白酶，其特征在干它的氨基酸序列如SEQID N0:2所/Jn ο
8.根據權利要求7所述的角蛋白酶，其特征在干它的最適溫度范圍是50-60°C;最適pH范圍為7-10。
9.權利要求61任意一項所述角蛋白酶的制備方法，其特征在于包含如下步驟 i、取權利要求4或者5所述的重組菌，接種到BMGY培養基上培養，培養溫度為30°C，pH 為 6，至 OD6QQ=2 6 ； ii、收集菌體，將其培養在BMMY培養基中，培養溫度為30°C，pH為6，進行誘導表達，誘導劑為甲醇，每24小時，加甲醇至I %濃度，誘導時間為96 144h ； iii、收集培養物上清，分離純化，即得到角蛋白酶。
10.權利要求61任意一項所述角蛋白酶的制備方法，其特征在于包含如下步驟 (O取權利要求4或者5所述的重組菌接種到YPD種子培養基上，pH為5. 5，溫度為.30°C下培養，制備得到種子液； (2)取步驟(I)制備的種子液，以5%的接種量接種到發酵培養基中發酵，發酵pH為.4.9，發酵溫度為30 0C ； 每IL發酵培養基含有如下成分50g葡萄糖、15g磷酸ニ氫鉀、16g硫酸鎂、IOg硫酸鉀、.O.8g氫氧化鉀、O. 8g硫酸鈣、O. 5g消泡劑、4g硫酸銨、Ig增效劑、生物素O. 473mL、微量元素溶液(PTMl) 2. 2mL ； (3)待碳源耗盡后，補加濃度為25%葡萄糖，流加濃度為25%甘油與甲醇的混合物，誘導表達，25%甘油與甲醇的體積比為8:1，甲醇的濃度維持為1%，直至酶活出現指數增長時終止發酵； (4)收集培養物上清，分離純化，即得到角蛋白酶。
全文摘要
本發明公開了一種如SEQ ID NO1所示的核苷酸序列，公開了包含該核苷酸序列的重組載體、重組菌，以及SEQ ID NO1所示的核苷酸序列編碼的角蛋白酶。本發明還公開了利用本發明重組菌制備角蛋白酶的方法，該方法產酶量高，制備的角蛋白酶與天然角蛋白酶的性質類似，克服了現有技術的缺陷，具有工業應用價值。
文檔編號C12N15/63GK102676561SQ201210140340
公開日2012年9月19日 申請日期2012年5月8日 優先權日2012年5月8日
發明者何軍, 余冰, 吳德, 胡洪, 陳代文 申請人:陳代文