專利名稱：梅毒螺旋體tpn47基因fq-pcr檢測試劑盒及其制備的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種試劑盒，尤其是涉及一種梅毒螺旋體TPN47基因FQ-PCR檢測試劑盒及其制備方法。
背景技術：
梅毒(Syphilis)是一種由梅毒螺旋體(Treponema pallidum, TP)引起的性傳播疾病，其病原體是梅毒螺旋體，屬螺旋體科。梅毒螺旋體主要通過性接觸、輸血、創口或者胎盤等途徑傳播。梅毒螺旋體從感染區附近的淋巴結進入血液播散全身，使機體幾乎所有的組織及器官受累，臨床表現為全身性的，可分為不同臨床階段，包括一期、二期、三期和潛伏期。世界衛生組織(WHO)曾樂觀地預言([1]WH0. Global prevalence andincidence of selected curable sexually transmitted infections:Overview andestimates [J] · Geneva: WHO, WH0/HIV/AIDS, 2001:1-30.):“ 由于有高靈敏度檢測方法和高效的治療方案，梅毒是一種能夠通過公共衛生措施得到成功控制的性傳播性疾病”。遺憾的是，由于至今仍然缺乏高靈敏的檢測方法和高效的治療方案，梅毒依然是嚴重危害人類健康的全世界范圍的公共衛生問題。中國疾病控制中心的官方數據顯示2010年我國梅毒(Syphilis)的發病數為375309例，比2009年同期增長24. 50%。報告發病數僅次于病毒性肝炎和肺結核居第三位，居于性傳播疾病首位(中國疾控中心http://www.chinacdc. net. cn)。近年來,有關梅毒與艾滋病之間存在著互相促進的研究結果([2]Buchacz, K. , Klausner, J. D. , Kerndt, P. R. , et al. McElroy, P. D. and Schwendemann, J. HIVincidence among men diagnosed with early syphilis in Atlanta, San Francisco, andLos Angeles, 2004to 2005[J] · Jaids-J Acq Tmm Def,2008, 47(2):234-240. [3]Ghanem, K.G. , Erbelding, E. J. , Wiener, Z. S. , et al. Serological response to syphilis treatmentin HIV-positive and HIV-negative patients attending sexually transmitteddiseases clinics [J]. Sex Transm Infect, 2007，83 (2) :97-101.),使得梅毒的控制越發困難而且重要。無疑，人們對梅毒的防控過于樂觀，對梅毒的認識遠遠不夠。盡管青霉素成功應用于治療各期梅毒已經有50年歷史，但治療失敗可見于任何一種被推薦的治療方案。林麗蓉等([4]林麗蓉，楊波，潘錫濤，等.潛在的血源傳播患者梅毒血清學檢測方法的選擇[J].中華醫院感染學雜志，2010，. 20(10) :1491-1494)在對健康體檢者、門診患者和潛在血源傳播患者梅毒血清學調查中均發現，這些人群存在一定比例的梅毒感染率，推測本地區人群梅毒的檢出率應該在2. 59%以上。顯然，梅毒感染者已經較廣泛地存在于普通人群中。梅毒正以過去500年任何國家和地區都未曾有過的速度在中國傳 播，由于存在隱性感染以及無法統計的私人診所患者患病率，目前看到的梅毒發病率或許只是梅毒現狀的冰山一角([5]Lin, L. R. , Fu, Z. G. , Dan, B. , Jing, et al. Developmentof a colloidal gold—immunochromatography assay to detect immunoglobulin Gantibodies to Treponema pallidum with TPNl7and TPN47[J]. Diagn Micr InfecDis, 2010，68(3) : 193-200. [6]Tucker JD, C. X. , Peeling RW. Syphilis and socialupheaval in china[J]. N Engl J Med, 2010, 362(18):1658-1661. [7]Chen, Z. Q. , Zhang, G.C. , Gong, X. D. , Lin, C. , Gao, X. , Liang, G. J. , Chen, X. S. , and Cohen, M. S. Syphilis inchina:Results of a national surveillance programme[J]. Lancet, 2007, 369:132-138.[8]Li-Rong Lin, Man-Li Tong,Zuo-Gen Fu,et al.Evaluation of acolloidalgold-immunochromatography assay in the detection of Treponema Pallidm specificIgM antibody in syphilis serofast reaction patients:a serologic marker for therelapse and infection of syphilis[J]. Diagnostic Microbiology and InfectiousDisease. 2011, 70:10-16)。實驗室檢查是診斷梅毒必不可少的方法，也是判斷療效和復發的重要依據，包括暗視野顯微鏡檢查和血清學試驗。梅毒螺旋體感染早期，梅毒抗體還未產生或含量 較低時，暗視野顯微鏡查找螺旋體成為最早的實驗室診斷方法，但敏感度較低，且易受肛門周圍非致病螺旋體的影響而產生假陽性。梅毒螺旋體尚不能進行體外培養，梅毒診斷與流行病學調查主要依賴于血清學試驗，包括特異性抗體和反應素檢測兩大類型。反應素檢測對早期梅毒檢測靈敏度不高，而且生物假陽性率較高，是主要用于療效觀察的一項血清學指標([9]林麗蓉，但冰，付左根，等.潛在血源傳播患者梅毒血清學TRUST/TPPA與IgM抗體聯合檢測.中國皮膚性病學雜志.2010，152(05):446-448)。梅毒特異性抗體檢測的敏感性和特異性均較反應素高。但是，梅毒特異性抗體檢測仍然存在著靈敏度不足的缺陷，尤其是早期梅毒患者抗體滴度較低。如果能建立一種方法能靈敏、特異和快速檢測到梅毒患者各類組織、體液中存在梅毒螺旋體，能證明梅毒螺旋體存在，那么這些棘手問題將迎刃而解。兔睪丸是梅毒螺旋體易感器官，少量梅毒螺旋體即可導致兔睪丸炎，因此，兔感染試驗被視為梅毒螺旋體檢測的最靈敏的方法。然而，兔感染試驗操作繁瑣，觀察時間要求3個月，甚至更長時間才能得到結果，臨床可操作性差。PCR擴增技術以梅毒螺旋體特異性的基因片段做為擴增模板，通過指數擴增實現了病原體的快速檢測，具有高效、靈敏和特異等優勢。從理論上分析，通過優化、改良PCR擴增技術，其檢測的靈敏度和特異性可以媲美兔感染試驗，而檢測時間僅僅需要2個小時([10]HAYP E, CLARKE JR,TAYL0R-R0BINS0N D, et al. Detection of treponemal DNA in the csf of patientswith syphilis and hiv infection using tte polymerase chain reaction [J].Genitourin Med, 1990，66 (6) : 428-32)，有望成為解決這些棘手問題的最佳方法。.盡管國內外有些企業研發出梅毒PCR檢測試劑，但尚未有進入臨床應用的有注冊文號PCR檢測試劑，而僅僅停留在科研應用。更嚴重的是，目前的PCR檢測試劑在研發過程中由于未經嚴格的比對試驗，無一例外的存在靈敏度和特異性嚴重不足，其準確性不高，是目前梅毒PCR技術在臨床中應用的瓶頸。梅毒螺旋體基因TPN47 (47kDa lipoprotein gene)為特異性47-kDa脂蛋白基因，是梅毒螺旋體蒼白株最常見的表達基因具有高度的特異性，該47-kDa蛋白為青霉素結合蛋白，與青霉素類的治療密切相關([II]Smajs, D.，M. McKevitt, J. K. Howell,，etal.Transcriptome of Treponema pallidum:gene expression profile duringexperimental rabbit infection. J.Bacteriol. 2005. 187:1866 - 1874. Transcriptomeof Treponema pallidum:gene expression profile during experimental rabbitinfection. J. Bacteriol. 2005. 187:1866 - 1874.)。在梅毒早期快速診斷、療效判斷、療程選擇、神經梅毒確診、胎傳梅毒診斷，以及獻血員、孕產婦、婚前體檢、手術患者和輸血前篩查等領域發揮重大作用，有著目前常用的血清學檢測不可比擬的優勢，將逐漸替代這些方法或作為這些方法的驗證試驗，具有廣闊的應用前景和重要的社會、經濟價值。
發明內容
本發明的目的是提供 一種梅毒螺旋體TPN47基因FQ-PCR檢測試劑盒及其制備方法。所述梅毒螺旋體TPN47基因FQ-PCR檢測試劑盒設有DNA提取試劑瓶、耐熱DNA聚合酶瓶、PCR反應液瓶、標準品瓶、質控品瓶和包裝盒；所述DNA提取試劑瓶、耐熱DNA聚合酶瓶、PCR反應液瓶、標準品瓶和質控品瓶設在包裝盒內；所述DNA提取試劑瓶設有蛋白酶K瓶、裂解液瓶、無水乙醇瓶、抑制物去除液瓶、第I清洗緩沖液瓶、洗脫液瓶、第2清洗緩沖液瓶和含收集管的尚心柱；所述標準品瓶設有6個含TPN47基因的標準品質粒瓶；所述質控品瓶設有陰性質控品瓶和陽性質控品瓶。所述耐熱DNA聚合酶瓶可采用Tag酶瓶。所述陰性質控品為不含梅毒螺旋體DNA的樣品，陽性質控品為含梅毒螺旋體DNA的樣品。所述6個含TPN47基因的標準品質粒的濃度可分別為I. O X 102copies/mL、I. OX IO3Cop ies/mL、I. OX 104copi es/mL、I. 0X105cop ies/mL、I. OXlO6Cop ies/mL 和1.0X 107copies/mL,共 6 個濃度。所述PCR反應液的成份含有PCR緩沖液、MgCl2、dNTPs和TPN47基因引物、探針組成的混合物。所述耐熱DNA聚合酶(Tag酶)具有V - DNA聚合酶活性、5 ^ — 3' DNA外切核酸酶活性和可耐受高溫的聚合酶；所述耐熱DNA聚合酶(Tag酶)最好是半衰期>45min的高溫聚合酶。所述梅毒螺旋體TPN47基因FQ-PCR檢測試劑盒的制備方法，包括以下步驟I)靶基因篩選，具體方法如下從基因庫(GENBANK)中篩選梅毒螺旋體TPN47基因，TPN47基因探針和引物的設計米用 PCR 引物探針設計軟件 primer premier 5.0、Oligo 6· O、TM Utility vl. 3、ClustalX等設計軟件輔助完成，然后通過Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)進行同源性比對以保證其特異性，合成的引物和探針用TE溶解，使用ND-1000UV-VIS波長紫外/可見光掃描分光光度計進行濃度測定后，保存，所述TE為IOmM Tri-HCl，pH5. 0,0. ImM TA ；2) TPN47基因標準品質粒的構建，具體方法如下以硅膠膜-離心柱法提取梅毒螺旋體Nichols株DNA作為模板，采用步驟I)中的TPN47基因的引物，進行PCR擴增，具體過程如下將擴增產物經過回收及純化后，在微量離心管中配制DNA溶液，后加入5 μ L等量的Solution I，16°C反應30min，與pMD18_T載體連接將連接產物轉化至DH5a中，冰中放置30min，42°C加熱45s后，再在冰中放置lmin，力口入LB培養基，37°C震蕩培養60min后，在含有X_Gal、IPTG、Amp的LB瓊脂平板培養基上培養，形成單菌落，挑選白色菌落，進行增殖培養，提取質粒并對其進行PCR，Xab I和Sal I雙酶切及測序鑒定后，將構建好的質粒進行單酶切線性化處理，再用紫外分光光度計定量并-20°C保存作為FQ-PCR的標準品；3) TPN47基因檢測試劑標準曲線制作，其具體方法如下包含TPN47基因的陽性克隆大腸桿菌在含Amp LB肉湯增菌，提取質粒，取10 μ L質粒用雙蒸水稀釋100倍,260nm, 280nm比色，純度=A26(I/A28(I,濃度=A260X 50 X 2 X 100 X IO-6X 6. 02 X IO23/(2806 X 324. 5 X 2) copies/mL,根據質粒濃度，進行梯度稀釋，以每個濃度標準品作模板進行熒光定量反應，確定線性范圍；4)制備PCR反應液，其具體方法如下采用PCR緩沖液、MgCl2、dNTPs、TPN47基因引物、探針的混合物共同組成PCR反應液；5)制備耐熱DNA聚合酶，其具體方法如下大腸桿菌用異丙基硫代_β-D半乳糖苷(IPTG)進行誘導表達，誘導后的菌懸液IOOml 經 5000r/min, 4°C離心 5min,以 IOml 緩沖液 I 重懸菌液，4°C，5000r/min,離心 5min,細菌沉淀再懸于5ml緩沖液I中，加入溶菌酶(Lys)使濃度達5mg/ml，37°C水浴20min ;力口入5ml緩沖液II, 75°C水浴45min, 4°C , 15000r/min離心IOmin ;上清加入硫酸銨使達30%,4°C,1500r/min離心lOmin，沉淀溶于Iml緩沖液III中，并對緩沖液III在4°C條件下透析，每6h換液I次共4次，離心除去不溶物后，-20°C凍存；6)建立樣品處理方法，其具體方法如下使用梅毒螺旋體TPN47基因FQ-PCR檢測試劑檢測梅毒螺旋體的樣本，采用硅膠膜-離心柱法提取模板DNA ；7)制備質控品，其具體方法如下制備陰性質控品選擇經過臨床確認為陰性的臨床標本；制備陽性質控品選擇經過臨床確認為陽性的臨床標本經稀釋獲得陽性質控品；8)制備梅毒螺旋體TPN47基因FQ-PCR檢測試劑盒，將DNA提取試劑、耐熱DNA聚合酶、PCR反應液、標準品和質控品共同組成梅毒螺旋體TPN47基因FQ-PCR檢測試劑盒。在步驟I)中，所述TPN47基因探針和引物的序列如表I所不。表I
權利要求
1.梅毒螺旋體TPN47基因FQ-PCR檢測試劑盒，其特征在于設有DNA提取試劑瓶、耐熱DNA聚合酶瓶、PCR反應液瓶、標準品瓶、質控品瓶和包裝盒；所述DNA提取試劑瓶、耐熱DNA聚合酶瓶、PCR反應液瓶、標準品瓶和質控品瓶設在包裝盒內；所述DNA提取試劑瓶設有蛋白酶K瓶、裂解液瓶、無水乙醇瓶、抑制物去除液瓶、第I清洗緩沖液瓶、洗脫液瓶、第2清洗緩沖液瓶和含收集管的尚心柱；所述標準品瓶設有6個含TPN47基因的標準品質粒瓶；所述質控品瓶設有陰性質控品瓶和陽性質控品瓶。
2.如權利要求I所述的梅毒螺旋體TPN47基因FQ-PCR檢測試劑盒，其特征在于所述耐熱DNA聚合酶瓶采用Tag酶瓶； 所述6個含TPN47基因的標準品質粒的濃度可分別為I. OX 102COpieS/mL、I. OX IO3Cop ies/mL、I. OX 104copies/mL、I. 0X105copies/mL、l. 0 X 106copi es/mL 和1.0X 107copies/mL,共 6 個濃度。
3.如權利要求I所述的梅毒螺旋體TPN47基因FQ-PCR檢測試劑盒，其特征在于所述PCR反應液的成份含有PCR緩沖液、MgCl2、dNTPs和TPN47基因引物、探針組成的混合物； 所述耐熱DNA聚合酶具有3' —5' DNA聚合酶活性、5' —3' DNA外切核酸酶活性和可耐受高溫的聚合酶；所述耐熱DNA聚合酶最好是半衰期>45min的高溫聚合酶。
4.如權利要求I所述的梅毒螺旋體TPN47基因FQ-PCR檢測試劑盒的制備方法，其特征在于包括以下步驟 1)靶基因篩選，具體方法如下 從基因庫中篩選梅毒螺旋體TPN47基因，TPN47基因探針和引物的設計采用PCR引物探針設計軟件輔助完成，然后通過Basic Local Alignment Search Tool進行同源性比對以保證其特異性，合成的引物和探針用TE溶解，使用ND-1000UV-VIS波長紫外/可見光掃描分光光度計進行濃度測定后，保存，所述TE為IOmM Tri-HCl，pH5. 0,0. ImM TA； 2)TPN47基因標準品質粒的構建，具體方法如下 以硅膠膜-離心柱法提取梅毒螺旋體Nichols株DNA作為模板，采用步驟I)中的TPN47基因的引物，進行PCR擴增，具體過程如下將擴增產物經過回收及純化后，在微量離心管中配制DNA溶液，后加入5 μ L等量的Solution I，16°C反應30min，與pMD18_T載體連接將連接產物轉化至DH5 α中，冰中放置30min，42°C加熱45s后，再在冰中放置Imin，加入LB培養基，37°C震蕩培養60min后，在含有X_Gal、IPTG、Amp的LB瓊脂平板培養基上培養，形成單菌落，挑選白色菌落，進行增殖培養，提取質粒并對其進行PCR，Xab I和Sal I雙酶切及測序鑒定后，將構建好的質粒進行單酶切線性化處理，再用紫外分光光度計定量并_20°C保存作為FQ-PCR的標準品； 3)TPN47基因檢測試劑標準曲線制作，其具體方法如下 包含TPN47基因的陽性克隆大腸桿菌在含Amp LB肉湯增菌，提取質粒，取IOyL質粒用雙蒸水稀釋100倍,260nm, 280nm比色，純度=A26(I/A28(I,濃度=A260X 50 X 2 X 100 X IO-6X 6. 02 X IO23/(2806 X 324. 5 X 2) copies/mL,根據質粒濃度，進行梯度稀釋，以每個濃度標準品作模板進行熒光定量反應，確定線性范圍； 4)制備PCR反應液，其具體方法如下 采用PCR緩沖液、MgCl2、dNTPs、TPN47基因引物、探針的混合物共同組成PCR反應液； 5)制備耐熱DNA聚合酶，其具體方法如下大腸桿菌用異丙基硫代-β-D半乳糖苷進行誘導表達，誘導后的菌懸液IOOml經5000r/min, 4°C離心5min,以IOml緩沖液I重懸菌液，4°C, 5000r/min,離心5min,細菌沉淀再懸于5ml緩沖液I中，加入溶菌酶使濃度達5mg/ml，37°C水浴20min ;加入5ml緩沖液II，75°C水浴 45min, 4°C, 15000r/min 離心 IOmin ;上清加入硫酸銨使達 30%, 4°C, 1500r/min 離心lOmin，沉淀溶于Iml緩沖液III中，并對緩沖液III在4°C條件下透析，每6h換液I次共4次，離心除去不溶物后，-20°C凍存； 6)建立樣品處理方法，其具體方法如下 使用梅毒螺旋體TPN47基因FQ-PCR檢測試劑檢測梅毒螺旋體的樣本，采用硅膠膜_離心柱法提取模板DNA ； 7)制備質控品，其具體方法如下 制備陰性質控品選擇經過臨床確認為陰性的臨床標本； 制備陽性質控品選擇經過臨床確認為陽性的臨床標本經稀釋獲得陽性質控品； 8)制備梅毒螺旋體TPN47基因FQ-PCR檢測試劑盒，將DNA提取試劑、耐熱DNA聚合酶、PCR反應液、標準品和質控品共同組成梅毒螺旋體TPN47基因FQ-PCR檢測試劑盒。
5.如權利要求4所述的梅毒螺旋體TPN47基因FQ-PCR檢測試劑盒的制備方法，其特征在于在步驟I)中，所述TPN47基因探針和引物的序列如下所示 革巴基因序列名稱引物/探針序列 TPN47 上游引物序列 5' -CCGTGAGTTCATCGACTATGTGA-3' 下游引物序列 5' -TTGGTGTAGCTCGCGTCATC-3' 熒光探針序列 5' -FAM-TTCAACACGGTCCGCTACGACTACTACGG-BHQ1-3'。
6.如權利要求4所述的梅毒螺旋體TPN47基因FQ-PCR檢測試劑盒的制備方法，其特征在于在步驟3)中，所述梯度稀釋選I. OX 102copies/mL、1.0X 103copies/mL、I. O X 104copies/mL、I. O X 105copies/mL、I. O X 106copies/mL、I. O X 107copies/mL 6 個濃度作標準品。
7.如權利要求4所述的梅毒螺旋體TPN47基因FQ-PCR檢測試劑盒的制備方法，其特征在于在步驟4)中，所述PCR緩沖液為ρΗ=5. (ΓΙΟ. O之間的穩定緩沖時，ρΗ=7. (T9. O ;引物的濃度為25ρπι01/μ L，熒光探針的濃度為20ρπιΟ1/μ L，dNTPs的濃度為2mmol/L ;鎂離子的濃度為 15 20mmol/Lo
8.如權利要求4所述的梅毒螺旋體TPN47基因FQ-PCR檢測試劑盒的制備方法，其特征在于在步驟 5)中，所述緩沖液 I 為 50mmol/L tris-HCl, 50mmoI /T, Glucose, lmmol/L EDTA,ρΗ8· 0 ;所述緩沖液 II 為 5mmol/L Tris-HCl, 50mmol/L KCl, lmmol/L EDTA, lmmol/L PMSF,0.5%Tween 20,0. 5%NP 40 ;所述緩沖液III為 50ml mol/L Tris-HCl, lOmmol/L KCl, lmmol/LDTT,0. 5%PMSF，50% 甘油。
9.如權利要求4所述的梅毒螺旋體TPN47基因FQ-PCR檢測試劑盒的制備方法，其特征在于在步驟6)中，所述樣本包括組織、全血、分泌物臨床標本；所述分泌物可包括皮膚、生殖器潰瘍、糜爛部分的分泌物。
10.如權利要求4所述的梅毒螺旋體TPN47基因FQ-PCR檢測試劑盒的制備方法，其特征在于在步驟8)中，所述耐熱DNA聚合酶的用量為8 10U/反應。
全文摘要
梅毒螺旋體TPN47基因FQ-PCR檢測試劑盒及其制備，涉及一種試劑盒。試劑盒設有DNA提取試劑瓶、耐熱DNA聚合酶瓶、PCR反應液瓶、標準品瓶、質控品瓶和包裝盒；DNA提取試劑瓶設有蛋白酶K瓶、裂解液瓶、無水乙醇瓶、抑制物去除液瓶、第1清洗緩沖液瓶、洗脫液瓶、第2清洗緩沖液瓶和含收集管的離心柱；標準品瓶設有6個含TPN47基因的標準品質粒瓶；質控品瓶設有陰性質控品瓶和陽性質控品瓶。先篩選靶基因，再構建TPN47基因標準品質粒，制作TPN47基因檢測試劑標準曲線后，先后制備PCR反應液、耐熱DNA聚合酶，建立樣品處理方法后，制備質控品，最后完成梅毒螺旋體TPN47基因FQ-PCR檢測試劑盒。
文檔編號C12M1/34GK102634452SQ20121014056
公開日2012年8月15日 申請日期2012年5月8日 優先權日2012年5月8日
發明者劉莉莉, 張長弓, 徐竟波, 楊天賜, 林麗蓉, 童曼莉 申請人:廈門大學附屬中山醫院