專利名稱：小麥生長素合成基因TaYUCCA1序列及其應用和植物表達載體的制作方法
TaYUCCAl§H*
(Triticum aestivum L.) ^ TMi^jR'n'J$36l3 TaYUCCAl tfttMMXftXXWm&TK
(Wang and Li, 2008) /J^>7jaS^#tf WWft YUCCA(flavinmonooxygenase-like enzyme, FM0)EKj^ixll' IAA(indole-3-acetic acid)EKlKI^BI (Zhao et al. ,2001) Zhao ^ (2001) yuccam^#4* YUCCA 1-Mif (GC-MS)IAA#￡ YUCCA, YUCCA2.YUCCA4 fR YUCCA6 % YUCCA1J±Jt^tii YUCCA2>YUCCA4 JiJc YUCCA6 yuccal (35S: :YUCCA1) W#-$ife yuclyuc4> yuc2yuc6m&mw yucca(Cheng et al. ,2006)o
YUCCAYUCCAic 11 'NcM (Zhao et al. ,2001 ;Cheng et al. , 2006) ￡7fOsYUCCA^S (0sYUCCAl-7) , ^ OsYUCCAlIAA(Yamamoto et al. , 2007) Gallavotti et al. (2008)YUCCA4>- xmmmyucca
A p
TaYUCCAl mu
發明內容
本發明的目的旨在提供一種小麥生長素合成基因TaYUCCAl，同時提供一種該基因 在獲得株型改變的轉基因擬南芥中的應用，并應用于生產其它具有明顯株型改變的轉基因 植物。本發明提供的核苷酸序列及氨基酸序列來自小麥。本發明根據擬南芥(YUCCA1-11)、水稻(OsYUCCAl-7)和小麥的EST序列設計引物， 利用聚合酶鏈式反應(PCR)、反轉錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)、基因克隆等技術，從小麥 (Triticum aestivum L.)中分離出編碼合成生長素的TaYUCCAl基因序列，其基因核苷酸序 列如SEQ. ID. NO. 1所示；其cDNA的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 2所示；其氨基酸序列如SEQ. ID. NO. 3所示。具體方法如下本發明根據擬南芥(YUCCA1-11)、水稻(OsYUCCAl-7)和小麥的EST序列，設計一 對引物；從小麥幼苗中提取小麥基因組DNA ;從小麥幼苗中提取總RNA，然后反轉錄成cDNA ； 分別用小麥基因組DNA和cDNA為模板進行常規聚合酶鏈式反應(PCR)，PCR產物連接到 PMD18-T載體上，轉化大腸桿菌DH5ci感受態細胞，篩選重組子，進行序列測定。獲得了小麥 生長素合成基因TaYUCCAl的基因序列和cDNA序列。該基因TaYUCCAl的基因序列為1448bp，含4個外顯子序列，分別為612bp、234bp、 123bp和180bp ；cDNA序列為1149bp，編碼382個氨基酸殘基。將TaYUCCAl編碼的氨基酸 序列與已知的來自擬南芥、水稻、玉米(Maize ZmSPIl)的YUCCA基因編碼的氨基酸序列進 行聚類分析表明，TaYUCCAl與擬南芥的YUCCA10和YUCCA11有較高的同源性。該結果表明 這個基因為生長素合成基因YUCCA在小麥中的同源基因。除了提供TaYUCCAl基因序列外，本發明的另一個目的是提供一種改變植株形態 的方法，但也包括與生長素參與調控的其它生物學性狀的改變。該方法包括用本發明的 TaYUCCAl基因的表達載體轉化植物。所述轉化是通過農桿菌介導的方法進行。所用表達載 體可通過使用Ti質粒、Ri質粒、植物病毒載體、直接的DNA轉化、微注射、電穿孔等導入植 物細胞。該基因的DNA序列如下CGCTACGAGT TGTGATGGAG GAGGTCGTAG TTTTGATTGT TGGCGCAGGG CCTGCGGGAC 60TCGCMCTGC AGCATGCGTT AGCCMTTCT CCATCCCATA TGTCATCGTT GAGCGTGAGA 120ATTGCAGCGC ATCACTATGG CGCMCCGCA CGTATGACCG TCTGAAGCTA CATCTAGCGA 180GGGMTTTTG TGAGTTGCCA CACATGCCAT ACCCTGCAGA TACCCCAACA TACATACCM 240AGMCACTTT CGTCAAGTAC GTGGATGACT ACATTGAGTG TTTCGCTATC CATACGAGGT 300ATCTCACTGT TGTTGAGTCA TCCACATATG ACTTCMTGG AAMTATTGG TCCATCATGG 360CGCACGACAT GGCAMGTGC AAMTAGTTA ATTACAGGGC AMGTTTCTT GTTGTGGCM 420GTGGTMGM TAGTGTTGAG MTATTCCAG TGGTCCCTGG CCTGGAAMC TTTCCGGGTG 480TGGCCATCCA TTCATCATGT TACAAGTCAG GCATCGACTA CTCCGGGAGG MCGTGTTGG 540TCATCGGATC TGGTMCTCT GGGATGGAGA TCGCCTACGA CCTTGCTTCT CATGGTGCCA 600ATACTTCTAT MTTATACGA AGTCCGGTAT GTATACTATA TGTGACTTTA ACTGCAMTC 660TCTTTTATAG ATCTTATTTT ATCTTGCATA TTGTAAMGA TGGTGACCCT TTTGTGACTG 720CAGATTCATG TMTGACAM GGMTTMTC CGACTAGGGA TGACACTAGT CCATTATCTT 780
CCACTAAAGA TGATAGATGG TCTCCTTTTG ATGATGGCAA ATGCCGTATT CGGGGACCTC 840
TCTAGGCATG GCATCACAAG ACCAGAAAAG GGTCCATTTG TGCTGAAGTC GGAAACTGGT 900
CGATCCGCAG TGATTGATGT TGGCACCATA GGGTTAATCA AGAAAGACAA AATTAAAGTG 960
AGCATATCCT CGGTCAAACA TACATAGTAT AAGAAATTTA GTTTCATATA TGACAAGTTA1020
TAGTTTTTAA CCTGCTGTAG GTTCATGGAA GGATTACTAA GATCAAAGGA AAAACAATTG1080
AATTTGAAGG TGGGAAGGAA GCCTCCTTTG ATGCCATTGT GTTTGCAACC GGATACAAAA1140
GCACAACAAA TTCGTGGCTC AAGGTAATAA GATAAACTGA GATTTGAATT TCATGCACTG1200
TAACTTCTCT AGATGCAAGA CTTGTTATAT GTTCTTAATC GAGTAAGATT TGCAAGTGCA1260
GAATGATGAG GACATGCTTA ATAGCGATGG CGTGCCCAAG AGGGAATTCC CTAATCATTG1320
GAAAGGGGCA AATGGGCTCT ACTGTGCCGG GTTAGGGAGA AGGGGATTGG CCGGTATTGC1380
CATGGATGCT AAGAACATCG CCAATGACAT TAAACGCAGC ATAGACTCTA TGTGCAGCTA1440
AAATAGCA1448
tJ cDNA:
CGCTACGAGT TGTg| TG|gAG GAGGTCGTAG TTTTGATTGT TGGCGCAGGG CCTGCGGGAC60
TCGCAACTGC AGCATGCGTT AGCCAATTCT CCATCCCATA TGTCATCGTT GAGCGTGAGA 120
ATTGCAGCGC ATCACTATGG CGCAACCGCA CGTATGACCG TCTGAAGCTA CATCTAGCGA 180
GGGAATTTTG TGAGTTGCCA CACATGCCAT ACCCTGCAGA TACCCCAACA TACATACCAA240
AGAACACTTT CGTCAAGTAC GTGGATGACT ACATTGAGTG TTTCGCTATC CATACGAGGT300
ATCTCACTGT TGTTGAGTCA TCCACATATG ACTTCAATGG AAAATATTGG TCCATCATGG360
CGCACGACAT GGCAAAGTGC AAAATAGTTA ATTACAGGGC AAAGTTTCTT GTTGTGGCAA420
GTGGTGAGAA TAGTGTTGAG AATATCCCAG TGGTCCCTGG CCTGGAAAAC TTTCCGGGTG480
TGGCCATCCA TTCATCATGT TATAAGTCAG GCATCGACTA CTCCGGGAGG AACGTGTTGG540
TCATCGGATC TGGTAACTCT GGGATGGAGA TCGCCTACGA CCTTGCTTCT CATGGTGCCA600
ATACTTCTAT AATTATACGA AGTCCGATTC ATGTAATGAC AAAGGAATTA ATCCGACTAG660
GGATGACACT AGTCCATTAT CTTCCACTAA AGATGATAGA TGGTCTCCTT TTGATGATGG720
CAAATGCCGT ATTCGGGGAC CTCTCTAGGC ATGGCATCAC AAGACCAGAA AAGGGTCCAT780
TTGTGCTGAA GTCGGAAACT GGTCGATCCG CAGTGATTGA TGTTGGCACC ATAGGGTTAA840
TCAAGAAAGA CAAAATTAAA GTTCATGGAA GGATTACTAA GATCAAAGGA AAAACAATTG900
AATTTGAAGG TGGGAAGGAA GCCTCCTTTG ATGCCATTGT GTTTGCAACC GGATACAAAA960
GCACAACAAA TTCGTGGCTC AAGAATGATG AGGACATGCT TAATAGCGAT GGCGTGCCCA1020
AGAAGGAATT CCCTAATCAT TGGAAAGGGG CAAATGGGCT CTACTGTGCC GGGTTAGGGA1080
GAAGGGGATT GGCCGGTATT GCCATGGATG CTAAGAACAT CGCCAATGAC ATTAAACGCA1140
GCATAGACTC TATGTGCAGC TAAAATAGCA1170
:
Met Glu Giù Val Val Val Leu Ile Val Gly Ala Gly Pro Ala Gly Leu
151015
Ala Thr Ala Ala Cys Val Ser Gin Phe Ser Ile Pro Tyr Val Ile Val
202530
Glu Arg Glu Asn Cys Ser Ala Ser Leu Trp Arg Asn Arg Thr Tyr Asp
354045
Arg Leu Lys Leu His Leu Ala Arg Glu Phe Cys Glu Leu Pro His Met
505560
Pro Tyr Pro Ala Asp Thr Pro Thr Tyr Ile Pro Lys Asn Thr Phe Val
65707580
Lys Tyr Val Asp Asp Tyr Ile Glu Cys Phe Ala Ile His Thr Arg Tyr
859095
Leu Thr Val Val Glu Ser Ser Thr Tyr Asp Phe Asn Gly Lys Tyr Trp
100105110
Ser Ile Met Ala His Asp Met Ala Lys Cys Lys Ile Val Asn Tyr Arg
115120125
Ala Lys Phe Leu Val Val Ala Ser Gly Glu Asn Ser Val Glu Asn Ile
130135140
Pro Val Val Pro Gly Leu Glu Asn Phe Pro Gly Val Ala Ile His Ser
145150155160
Ser Cys Tyr Lys Ser Gly Ile Asp Tyr Ser Gly Arg Asn Val Leu Val
165170175
Ile Gly Ser Gly Asn Ser Gly Met Glu Ile Ala Tyr Asp Leu Ala Ser
180185190
His Gly Ala Asn Thr Ser Ile Ile Ile Arg Ser Pro Ile His Val Met
195200205
Thr Lys Glu Leu Ile Arg Leu Gly Met Thr Leu Val His Tyr Leu Pro
210215220
Leu Lys Met Ile Asp Gly Leu Leu Leu Met Met Ala Asn Ala Val Phe
225230235240
Gly Asp Leu Ser Arg His Gly Ile Thr Arg Pro Glu Lys Gly Pro Phe
245250255
Val Leu Lys Ser Glu Thr Gly Arg Ser Ala Val Ile Asp Val Gly Thr
260265270
Ile Gly Leu Ile Lys Lys Asp Lys Ile Lys Val His Gly Arg Ile Thr
275280285
Lys Ile Lys Gly Lys Thr Ile Glu Phe Glu Gly Gly Lys Glu Ala Ser
290295300
Phe Asp Alalie Val Phe Ala Thr Gly Tyr Lys Ser Thr Thr Asn Ser
305310315320
Trp Leu Lys Asn Asp Glu Asp Met Leu Asn Ser Asp Gly Val Pro Lys
325330335
Lys Glu Phe Pro Asn His Trp Lys Gly Ala Asn Gly Leu Tyr Cys Ala
340345350Gly Leu Gly Arg Arg Gly Leu Ala Gly He Ala Met Asp Ala Lys Asn355360365He Ala Asn Asp He Lys Arg Ser He Asp Ser Met Cys Ser370380本發明提供了小麥新 型生長素合成基因TaYUCCAl在其它植物中應用的方法，可以改變轉基因植物株型。步驟為(a)利用如上述的TaYUCCAl基因，將其cDNA序列置于pR0K2載體的CaMV 35S啟動子之后，構建植物表達載體pR0K2-TaYUCCAl。對于單子葉植物如小麥、水稻、玉米等的轉化用的載體的構建，可以采用類似的方法將cDNA序列置于本領域人員熟知的Ubi等組成型啟動子或組織特異型啟動子之后，構建植物表達載體。(b)采用本領域熟知的方法如農桿菌介導的方法將構建的表達載體導入植物細胞，得到轉基因植株。本發明涉及一種植物表達載體，包含有權利要求I所述的核苷酸序列SEQ.ID. NO. 2，用于改變植物株型，尤其是株高、葉型等。本發明涉及將上述植物表達載體導入植物細胞中，導入方法都是本領域人員熟知的，這些方法包括但不僅限于農桿菌介導的轉化法、基因槍法、電擊法、顯微注射法、脂質體介導法、PEG介導的轉化法、花粉管通道法等，得到株型改變的轉基因植物。本發明人根據擬南芥(YUCCA1-11)、水稻(OsYUCCAl-7)和小麥的EST序列設計引物，利用聚合酶鏈式反應(PCR)、反轉錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)、基因克隆等技術，從小麥(Triticum aestivum)中分離出編碼合成生長素的TaYUCCAl基因序列。進一步構建植物表達載體，轉化模式植物擬南芥。與野生型植物相比，轉基因植物株型改變，表現下胚軸加長、株聞提聞、頂端優勢增強、葉柄伸長和葉片細長卷曲等生長素含量提聞的癥狀。本發明所用選擇標記基因為新霉素磷酸轉移酶基因，可進一步包括其它選擇標記基因和報告基因。基于擬南芥生長速度快、生長周期短、遺傳轉化效率高、基因組已經測序、已經作為生物學研究的模式植物等優點，在下述實施例中以擬南芥為例對本發明進行了詳細的說明，但本發明中TaYUCCAl基因及含有該基因的植物表達載體也可以用于生產其它株型改變的轉基因植物，包括用于形態改變的植物的器官、組織、細胞及其種子和后代。本發明對采用浸花法獲得的T2代轉基因擬南芥進行形態分析發現，轉基因擬南芥中TaYUCCAl的過量表達能顯著改變其株型。可將該基因轉化小麥、水稻、玉米、棉花等農作物、需要改變株型的花卉植物或其它植物，改變其株型，提高其產量和品質，具有重大的經濟價值和社會效益。
圖I.小麥 TaYUCCAl 的基因組 DNA 擴增電泳圖。M, Marker DL2000 ；A, TaYUCCAl的基因全長片段。圖 2.小麥 TaYUCCAl 的 cDNA 擴增電泳圖。M，Marker DL2000 ；B, TaYUCCAl 的 cDNA全長片段。
圖3.小麥中TaYUCCAl氨基酸序列與幾種其它植物的YUCCA氨基酸序列的聚類結果。它們在GenBank中的注冊號及其物種來源分別為0sYUCCAl (水稻，BAD68007)、0sYUCCA2 (水稻，AAU43964)、0sYUCCA3 (水稻，BAD87432)、0sYUCCA4 (水稻，BAB32703)、0sYUCCA5 (水稻，ABA99096)、0sYUCCA6 (水稻，BAC80117)、0sYUCCA7 (水稻，CAE76085)、YUCCAl (擬南芥，At4g32540)、YUCCA2(擬南芥，At4gl3260)、YUCCA3 (擬南芥，Atlg04610)、YUCCA4(擬南芥，At5gll320)、YUCCA5(擬南芥，At5g43890)、YUCCA6 (擬南芥，At5g25620)、YUCCA7 (擬南芥，At2g33230)、YUCCA8 (擬南芥，At4g04610)、YUCCA9 (擬南芥，Atlg04180)、YUCCA 10 (擬南芥，Atlg48910)、YUCCAlI (擬南芥，Atlg21430)、ZmSPIl (玉米，ACI43575)。圖4.小麥中TaYUCCAl氨基酸序列與幾種其它植物的YUCCA氨基酸序列的聚類結果。它們在GenBank中的注冊號及其物種來源分別為0sYUCCA4(水稻，BAB32703)、YUCCA 10 (擬南芥，Atlg48910)、YUCCAlI (擬南芥，Atlg21430)、ZmSPIl (玉米，ACI43575)。圖5.構建的植物表達載體示意圖。
圖6.部分轉基因植株的 PCR 鑒定結果。M =Marker DL2000 ；CK+ :pR0K2_TaYUCCAl質粒作為陽性對照；CK-:非轉基因對照；1_5 :轉基因擬南芥各株系。圖7 :過量表達TaYUCCAl的轉基因擬南芥可以提高株高，葉片細長卷曲。A :示轉基因擬南芥生長50天時株高可達60厘米；B :示生長20天時的野生型擬南芥，葉片橢圓形；C :示生長20天的轉基因擬南芥，葉片細長卷曲。
具體實施例方式以下結合具體實施例，對本發明進行詳細說明。實施方式(一)小麥新型生長素合成基因TaYUCCAl基因序列I.小麥基因組DNA的提取利用CTAB法從小麥三葉期幼苗中提取小麥DNA ；2. TaYUCCAl基因序列的獲得根據擬南芥(YUCCA1-11)、水稻(OsYUCCAl-7)和小麥的EST序列，設計一對引物正向引物TaYUCCAlF2 5，-TGATGGAGGAGGTCGTAGTT-3’ ；反向引物TaYUCCAR2 5 ’ -TTTTAGCTGCACATAGAGTC-3 ’。以小麥基因組DNA為模板進行PCR反應獲得TaYUCCAl基因。50 反應體系中含第一鏈 cDNA 產物 l、25ii I 的 LA GC Taq DNA 聚合酶緩沖液 GC buffer IUu I I Ommol/L的dNTP、分別加IiU 50iimol/L的上游引物和下游引物、0. 5iil LA GC Taq DNA聚合酶，其余用滅菌雙蒸水補齊。反應程序為950C 3min ;然后運行 35 個循環94°C lmin,50°C lmin,72°C°C 2min ;最后于72°C 延伸 5min。反應完畢后，通過瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產物，得到約1.5kb的條帶(圖1)，按照TaKaRa公司的DNA片段凝膠回收試劑盒說明純化回收該片段。取回收的PCR產物4 yl與克隆載體PMD18-T連接，操作步驟按照TaRaKa公司產品pMD18_T Vector說明書進行。然后將連接產物轉化大腸桿菌DH5 a感受態細胞，在含有氨芐青霉素^Omg/L)、X-gal和IPTG的LB固體培養基上培養過夜。挑取白色菌落至含有氨芐青霉素的LB液體培養液中培養8h，進行菌液PCR鑒定。將正確的菌樣堿法小量提取質粒DNA，質粒PCR和酶切鑒定正確后進行序列測定。3.同源檢索利用BLAST軟件將分離出的全長TaYUCCAl序列與GenBank中的序列進行比較。實施方式(二)小麥新型生長素合成基因TaYUCCAl基因cDNA序列的克隆1. RNA 的提取用 Roche Applied Science 公司 Tripure Isolation Reagent 總RNA提取試劑盒提取小麥三葉期幼苗總RNA2. cDNA第一鏈的合成按照EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix 試劑盒說明書進行。在0. 2ml離心管中加入試劑
Total RNA5. 0 n I
01igo(dT)l81.0 nl
2XES Reaction Mix10. 0 u I
ES Reverse Transcriptase I. 0 uI
Rnase-free Water to20. 0 U I輕輕混勻，稍離心后，42°C保溫50min，70°C加熱15min。然后_20°C保存備用。3. cDNA全長序列的獲得根據擬南芥(YUCCA1-11)、水稻(OsYUCCAl-7)和小麥的EST序列，設計一對引物正向引物TaYUCCAlF2 5，-TGATGGAGGAGGTCGTAGTT-3，；反向引物TaYUCCAR2 5 ’ -TTTTAGCTGCACATAGAGTC-3 ’。以上述的cDNA為模板進行PCR反應獲得TaYUCCAl基因cDNA序列。50 反應體系中含第一鏈cDNA產物4 ill、25 ill的LA GC Taq DNA聚合酶緩沖液GC buffer IUu I
IOmmo I/L的dNTP、分別加Iul 50 u mol/L的上游引物和下游引物、0. 5u I LA GC Taq DNA聚合酶，其余用滅菌雙蒸水補齊。反應程序為950C 3min ;然后運行 35 個循環94°C lmin,50°C lmin,72°C lmin30sec ;最后于72°C 延伸 5min。反應完畢后，過瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產物，得到約I. 2kb的條帶(圖2)，按照TaKaRa公司的DNA片段凝膠回收試劑盒說明純化回收該片段。取回收的PCR產物4 yl與克隆載體PMD18-T連接，操作步驟按照TaRaKa公司產品pMD18_T Vector說明書進行。然后將連接產物轉化大腸桿菌DH5 a感受態細胞，在含有氨芐青霉素^0mg/L)、X-gal和IPTG的LB固體培養基上培養過夜。挑取白色菌落至含有氨芐青霉素的LB液體培養液中培養8h，進行菌液PCR鑒定。將正確的菌樣堿法小量提取質粒DNA，質粒PCR和酶切鑒定正確后進行序列測定。4.同源檢索利用BLAST軟件將分離出的全長TaYUCCAl的cDNA序列與GenBank中的序列進行比較。將TaYUCCAI編碼的氨基酸序列與已知的來自擬南芥、水稻、玉米(Maize ZmSPIl)的YUCCA基因編碼的氨基酸序列進行聚類分析表明，TaYUCCAl與擬南芥的YUCCA10和YUCCA11有較高的同源性(圖3)。該結果表明這個基因為生長素合成基因YUCCA在小麥中的同源基因。TaYUCCAl的氨基酸序列與水稻0sYUCCA4 (BAB32703)、擬南芥YUCCA10(Atlg48910)、YUCCA 11 (Atl g21430)和玉米 ZmSPIl (ACI43575)序列類比分析表明，這幾個序列見有多個保守的位點(圖4)。5. TaYUCCAl基因內含子分析根據實施方式(一)和實施方式(二)中分別獲得的基因序列以及cDNA序列進行比較，分析內含子的信息。實施方式(三)小麥新型生長素合成基因TaYUCCAl的序列見SEQ. ID. NO. USEQ.ID. NO. 2 和 SEQ. ID. NO. 3。實施方式(四)表達載體pR0K2_TaYUCCAl的構建(I)根據分離出的TaYUCCAl基因的cDNA核苷酸序列，設計引物正向引物TaYUCCAlFl :5’ -CGGGGATCCTGATGGAGGAGGTCGTAGTT-3 (下劃線為 BamHI切點)；反向引物TaYUCCAlRl :5’ -CGGGGTACCTTTTAGCTGCACATAGAGTC-3’(下劃線為 KpnI切點)。以小麥三葉期幼苗的總RNA反轉錄得到的cDNA為模板，進行PCR反應。(2)取PCR產物4 ill與pMD19-T Simple載體連接，操作步驟按照TaKaRa公司產品PMD19-T Simple Vector說明書進行，然后將連接產物轉化大腸桿菌DH5 a感受態細胞，在含有氨芐青霉素^Omg/L)、X-gal和IPTG的LB固體培養基上培養過夜。挑取白色菌落至含有氨芐青霉素的LB液體培養液中培養8h，進行菌液PCR鑒定。將正確的菌樣堿法小量提取質粒DNA，質粒PCR和酶切鑒定正確后進行序列測定。(3)以步驟⑵所得的質粒用限制性內切酶BamH I和Kpa I進行雙酶切，回收酶切片段，與用相同酶切并回收的PR0K2表達載體連接。連接體系如下
目的 TaYUCCAl 片段 DNA3. 0 u I 酶切回收的載體PR0K2片段5.0 Ul
IOXT4連接酶緩沖液1.0 Ul
T4連接酶1.0 Ul混勻后于16°C連接過夜。連接產物轉化大腸桿菌DH5 a感受態細胞，在含有卡那霉素(50mg/L)的LB固體培養基上培養過夜。對生長的菌落進行PCR鑒定和測序鑒定。構建成功植物表達載體pR0K2-TaYUCCAl (圖5)。(4)將構建好的表達載體pR0K2_TaYUCCAl轉化農桿菌GV3101感受態細胞，本發明采用的是凍融法轉化農桿菌。實施方式(五)轉基因植物的獲得(I)野生型擬南芥(Columbia生態型)種子播種于浸透1/2MS培養液的育苗基質中，4°C下春花2-3天。然后轉入光照培養箱中23°C下光照培養，16h光照/8h黑暗。(2)挑取攜帶重組質粒的農桿菌單菌落接種于含50mg/L卡那霉素的YEB液體培養基中，28°C，250rpm，振蕩培養約48小時，至對數生長后期。(3)離心收集菌體，沉淀用滲透液(1/2 MS培養液中含5%蔗糖，0.02% Silwet、L-77)懸浮，菌液OD6tltl在0. 8左右。(4)將未授粉的擬南芥花序浸入滲透液中，浸泡50sec，用塑料薄膜覆蓋整個托盤并適留通氣孔后，在弱光下培養，24h后取下薄膜，于室溫中繼續培養。收獲種子。(5)將收獲的種子在篩選培養基(1/2MS鹽，1%蔗糖，pH5. 7，0. 8%瓊脂，卡那霉素50mg/L)上篩選，培養得到抗性植株。(6)根據TaYUCCAl序列設計一對引物正向引物TaYUCCAlF2 5，-TGATGGAGGAGGTCGTAGTT-3’ ；反向引物TaYUCCAR2 5 ’ -TTTTAGCTGCACATAGAGTC-3 ’。
提取野生型及抗性植株的基因組DNA，進行常規聚合酶鏈式反應鑒定(圖6)。(7)將T3代純合株系種子于燒透1/2MS培養液的育苗基質缽上培養。觀察植株表型變化。實驗證實，轉基因擬南芥表現下胚軸加長、株高提高、頂端優勢增強、葉柄伸長和葉片細長卷曲等生長素含量提高的癥狀(圖7)。可將該基因轉化小麥、玉米、棉花、花卉等農作物，改變植物的株型，提高產量和品質，具有重大的經濟價值和社會價值。應當理解的是，對本領域普通技術人員來說，可以根據上述說明加以改進或變換，而所有這些改進和變換都應屬于本發明所附權利要求的保護范圍。
權利要求
1.一種小麥生長素合成基因TaYUCCAl，其特征在于，其基因核苷酸序列如SEQ.ID. NO. I所示；其cDNA的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 2所示；其氨基酸序列如SEQ. ID. NO. 3所示。
2.根據權利要求I所述的小麥生長素合成基因TaYUCCAl，其特征在于，該基因選自小麥。
3.根據權利要求I所述的一種小麥生長素合成基因TaYUCCAl的應用，其特征在于，該基因在擬南芥中過量表達，能改變轉基因擬南芥的株型，如下胚軸加長、株聞提聞、頂端優勢增強、葉柄伸長和葉片細長卷曲等生長素含量提高的癥狀。
4.一種植物表達載體,包含有權利要求I所述的核苷酸序列SEQ. ID. NO. 2。
全文摘要
本發明公開了一小麥生長素合成基因TaYUCCA1，其基因核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示；其cDNA的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示；其氨基酸序列如SEQ.ID.NO.3所示。將該基因的全長cDNA序列置于CaMV 35S啟動子之后，構建植物表達載體pROK2-TaYUCCA1，轉化擬南芥，使該基因在擬南芥中過量表達。實驗證實，與野生型擬南芥相比，轉基因擬南芥表現下胚軸加長、株高提高、頂端優勢增強、葉柄伸長和葉片細長卷曲等生長素含量提高的癥狀。如將該基因轉化小麥、水稻、玉米等農作物、需要改變株型的花卉植物或其它植物，改變其株型，提高其產量和品質，具有重大的經濟價值和社會效益。
文檔編號C12N15/29GK102660556SQ201210146830
公開日2012年9月12日 申請日期2012年5月14日 優先權日2012年5月14日
發明者封德順, 尹娜, 王洪剛, 馬信 申請人:山東農業大學