類胡蘿卜素合成相關基因及其應用的制作方法

專利名稱：類胡蘿卜素合成相關基因及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于植物學領域，具體地說，本發明涉及類胡蘿卜素合成相關基因及其應用，具體地涉及CYP97A4基因，該基因參與植物在強光脅迫條件下的光保護、捕光復合物II的三聚體裝配及穩定等作用。本發明還公開了所述基因及其所編碼的蛋白酶的用途，尤其是在植物品種改良和雜交育種中用于改變植物的光保護性質。
背景技術：
類胡蘿卜素屬于四萜化合物，在自然界中廣泛存在于光能自養生物。類胡蘿卜素包括胡蘿卜素和葉黃素兩大類，前者是只含有碳和氫原子的多烯烴，后者是前者的含氧衍生物。根據含量的高低，植物葉片中主要的類胡蘿卜素成分是葉黃質(lutein)，β-胡蘿卜素(β-carotene)、紫黃素(violaxanthin)與新黃素(neoxanthin)。其中，葉黃質(Lutein)作為葉片器官中含量最高的類胡蘿卜素，對于光合系統捕光復合體亞基的裝配、穩定型維持以及光保護起到非常重要的作用。由于類胡蘿卜素種類的多樣性與復雜性，多種多樣的蛋白酶參與到合成代謝與分解代謝中。因此，為了有效地、有針對性地改變植物品種，本領域迫切需要開發與類胡蘿卜素合成有關的編碼基因、蛋白及其應用。

發明內容
本發明的目的在于提供一種與類胡蘿卜素合成相關的基因及其應用。本發明的另一目的是提供所述基因編碼的多肽及其用途。本發明的另一目的是提供一種改變植物中類胡蘿卜素組成成分的比例或含量、或提高植物抗強光脅迫的能力的方 法。在本發明的第一方面，提供了一種分離的CYP97A4多肽或其編碼基因的用途，所述用途任選自下組:(I)所述CYP97A4多肽或基因用于催化β，ε -類胡蘿卜素的β _環的羥化反應；和/或(2)所述CYP97A4多肽或基因用于改變植物中類胡蘿卜素組成成分的比例或含量；和/或(3)所述CYP97A4多肽或基因用于提高植物抗強光脅迫的能力。 在另一優選例中，所述的CYP97A4多肽選自下組:⑴具有SEQ ID NO:2氨基酸序列的多肽；(ii)將SEQ ID NO:2氨基酸序列經過一個或幾個(如1_10個)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的且具有催化類胡蘿卜素β_環的羥化反應功能的由(i)衍生的多肽。在另一優選例中，所述的CYP97A4多肽的編碼序列選自下組:(I)編碼如SEQ ID NO:2所述多肽的多核苷酸序列；
(2)如SEQ ID NO:1所示的多核苷酸序列；(3)與(I)或(2)所述的多核苷酸序列互補的多核苷酸。在本發明的第二方面，提供了一種提高植物抗高光脅迫能力，或提高植物捕光色素復合體II三聚體的裝配及穩定能力的方法，所述方法包括:提高所述植物中CYP97A4多肽的表達或活性。在另一優選例中，所述的抗高光脅迫能力為抗光氧化脅迫的能力。 在另一優選例中，所述方法包括:(I)提供攜帶表達載體的農桿菌，所述的表達載體含有CYP97A4多肽的編碼序列；(2)將植物細胞或組織或器官與步驟(I)中的農桿菌接觸，從而使表達CYP97A4多肽的DNA編碼序列轉入植物細胞，并且整合到植物細胞的染色體上；(3)選擇已轉入CYP97A4多肽編碼序列的植物細胞或組織或器官；(4)將步驟(3)中的植物細胞或組織或器官再生成植株。在另一優選例中，所述植物選自下組:水稻、大麥、玉米、楊樹、大豆，或葡萄。在本發明的第三方面，提供了一種提高植物中β，ε -類胡蘿卜素與β，β-類胡蘿卜素比例和含量的方法，所述方法包括:降低植物CYP97A4多肽的表達或活性。在本發明的第四方面，提供了一種提高植物中α -胡蘿卜素或α -隱黃質的含量的方法，所述方法包括:降低植物中CYP97A4多肽的表達或活性。在另一優選例中，所述方法為:特異性敲除或干擾CYP97A4多肽的編碼基因的表達；或特異性的抑制CYP97A4多肽的活性。在另一優選例中，特異性敲除或干擾CYP97A4多肽編碼基因的表達方式選自下組:RNA干擾法，MiRNA調控法，siRNA調控法，或其組合。 在另一優選例中，特異性抑制CYP97A4多肽的活性方法包括:表達CYP97A4的抗體或配體。應理解，在本發明范圍內中，本發明的上述各技術特征和在下文(如實施例)中具體描述的各技術特征之間都可以互相組合，從而構成新的或優選的技術方案。限于篇幅，在
此不再一一累述。


圖1顯示水稻CYP97A4-YFP蛋白熒光(圖1A左圖)與葉綠體自發熒光(圖1B左圖)完全重疊(圖1B右圖)，表明CYP97A4特異性定位在葉綠體內，圖1A是35S::CYP97A4-YFP融合蛋白構建，圖1C是對照35S::YFP空載體。圖2顯示水稻cyp97a4突變體由于β -環羥化功能缺失導致底物α -隱黃質(a -cry, a -cryptoxanthin)與 α -胡蘿卜素(α -car, a -carotene)的積累；圖 2A 為背景品種Nippon的葉片類胡蘿卜素成分結果；圖28為野生對照TosWT_97a4-l的葉片類胡蘿
卜素成分結果；圖2C為cyp97a4-l的葉片類胡蘿卜素成分結果。

圖3顯示互補實驗結果，為室外種植并取葉片抽提色素的HPLC圖譜，結果顯示，cyp97a4_l突變體苗(圖3A)中出現的兩個新的成分a-cry和a-car,在互補轉基因單株的葉片里消失(圖3B)，HPLC圖譜恢復為與野生型(圖3C) —致；圖3A為cyp97a4_l的葉片類胡蘿卜素成分分析結果；圖38為轉入互補載體的cyp97a4轉基因苗類胡蘿卜素成分結果；圖3C為背景品種Nippon的葉片類胡蘿卜素成分結果。圖4顯示藍綠溫和凝膠電泳分離各基因型類囊體膜中色素-蛋白復合體分析結果，突變體的捕光復合體II三聚體(LHCII trimer)減少，單體(LHCII monomer)增多(cyp97a4-l、4-2為突變體；TosWT_a4-l、4_2為野生型對照；Nippon背景品種)。圖5顯示強光脅迫條件下，cyp97a4突變體比對照組更敏感(左半圖為CK，右半圖為強光處理)(cyp97a4-l、4-2，4-3為突變體；TosWT_a4-l、4-2、4_3為野生型對照；Nippon背景品種)。突變體葉片出現光破壞現象，葉片損傷嚴重(圖5B、圖5D、圖5F)，而對照(圖5A、圖5C、圖5E)沒有明顯變化。各基因型水稻離體的葉片在強光照射一段時間后煮沸脫色，突變體(圖5H、圖5J、圖5L)的染色結果更深。圖6顯示在正常光照條件和強光照脅迫下，35S啟動子驅動過量表達CYP97A4的四個轉基因系0E_1 0E_4體內積累的ROS都明顯少于空載體對照(vector)，提高強光脅迫的耐受能力，圖6A為正常生長條件，圖6B為強光處理條件。
具體實施例方式本發明人通過 廣泛而深入的研究，獲得一種與類胡蘿卜素合成相關的基因CYP97A4，生化實驗結果表明，所述基因編碼的蛋白參與β，ε -類胡蘿卜素的β-環羥化反應，維持捕光復合體II的三聚體裝配及穩定，參與植物在強光脅迫條件下的光保護等生理過程。本發明還提供了所述基因及其編碼的多肽的用途，及其在植物品種改良中的作用。具體地，本發明人通過反向遺傳學方法，找到一個類胡蘿卜素β_環羥化酶，并得到了全長cDNA序列。該基因屬于細胞色素Ρ450家族的單加氧酶類。該基因含有Ρ450蛋白共有的兩個保守結構:結合血紅素的保守結構域以及含有蘇氨酸并結合氧分子的基序。高效液相色譜(HPLC)分析結果顯示此基因被敲除之后，與野生型相比，突變體體內存在的類胡蘿卜素，包括葉黃質、新黃素、紫黃素與β_胡蘿卜素的含量都顯著減少，葉黃質的底物
胡蘿卜素含量顯著提高，葉綠素a與葉綠素b的比值沒有變化。非變性蛋白電泳表明突變體光合系統中捕光復合體II三聚體形式含量降低，而單體形式相應增加。在強光下突變體的葉片更容易發生光破壞，而對照葉片并沒有發生明顯改變。化學染色結果顯示突變體葉片在光脅迫時會積累更多的活性氧物質(ROS)，從而導致了突變體敏感表型。由此可見，所述基因在水稻以及其他經濟作物中參與強光脅迫下光保護過程，具有廣泛的應用潛力。在本發明中，術語“CYP97A4蛋白”、“CYP97A4多肽”等可互換使用，指具有CYP97A4蛋白氨基酸序列(SEQ ID NO:2)的蛋白或多肽。在未特別指出時，術語“CYP97A4蛋白”包括野生型和突變型CYP97A4蛋白。如本文所用，“分離的”是指物質從其原始環境中分離出來(如果是天然的物質，原始環境即是天然環境)。如活體細胞內的天然狀態下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態中同存在的其他物質中分開，則為分離純化的。如本文所用，“分離的CYP97A4蛋白或多肽”是指CYP97A4蛋白基本上不含天然與其相關的其它蛋白、脂類、糖類或其它物質。本領域的技術人員能用標準的蛋白質純化技術純化水稻CYP97A4蛋白。基本上純的多肽在非還原聚丙烯酰胺凝膠上能產生單一的主帶。本發明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優選重組多肽。本發明的多肽可以是天然純化的產物，或是化學合成的產物，或使用重組技術從原核或真核宿主(例如，細菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細胞)中產生。根據重組生產方案所用的宿主，本發明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本發明的多肽還可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。本發明還包括CYP97A4蛋白的片段、衍生物和類似物。如本文所用，術語“片段”、“衍生物”和“類似物”是指基本上保持本發明的天然CYP97A4蛋白相同的生物學功能或活性的多肽。本發明的多肽片段、衍生物或類似物可以是:(i)有一個或多個保守或非保守性氨基酸殘基(優選保守性氨基酸殘基)被取代的多肽，而這樣的取代的氨基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的；(ii)在一個或多個氨基酸殘基中具有取代基團的多肽；(iii)成熟多肽與另一個化合物(比如延長多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽；(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前導序列或分泌序列或用來純化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根據本文的教導，這些片段、衍生物和類似物屬于本領域熟練技術人員公知的范圍。在本發明中，術語“CYP97A4蛋白”或“CYP97A4多肽”指具有類胡蘿卜素β _環羥化酶活性的多肽，其中一個序列如SEQ ID Ν0:2所示。該術語還包括具有與CYP97A4蛋白相同功能的、SEQ ID NO:2序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于):一個或多個(通常為1-50個，較佳地1 -30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數個(通常為20個以內，較佳地為10個以內，更佳地為5個以內)氨基酸。例如，在本領域中，用性能相近或相似的氨基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數個氨基酸通常也不會改變蛋白質的功能。該術語還包括CYP97A4蛋白或多肽的活性片段和活性衍生物。該多肽的變異形式包括:同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導突變體、在高或低的嚴謹度的條件下能與CYP97A4蛋白DNA雜交的DNA所編碼的蛋白。本發明還提供了其他多肽，如包含CYP97A4蛋白或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽夕卜，本發明還包括了 CYP97A4蛋白的可溶性片段。通常，該片段具有CYP97A4蛋白序列的至少約10個連續氨基酸，通常至少約30個連續氨基酸，較佳地至少約50個連續氨基酸，更佳地至少約80個連續氨基酸,最佳地至少約100個連續氨基酸。修飾(通常不改變一級結構)形式包括:體內或體外的多肽的化學衍生形式如乙酰化或羧基化。修飾還包括糖基化。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優化了溶解性能的多肽。在本發明中，“CYP97A4保守性變異多肽”指與SEQ ID NO:2的氨基酸序列相比，有至多10個，較佳地至多8個，更佳地至多5個，最佳地至多3個氨基酸被性質相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據表I進行氨基酸替換而產生。
表I
權利要求
1.一種分離的CYP97A4多肽或其編碼基因的用途，其特征在于，所述用途任選自下組: (1)所述CYP97A4多肽或基因用于催化β，類胡蘿卜素的β_環的羥化反應；和/或 (2)所述CYP97A4多肽或基因用于改變植物中類胡蘿卜素組成成分的比例或含量；和/或 (3)所述CYP97A4多肽或基因用于提高植物抗強光脅迫的能力。
2.如權利要求1所述的用途，其特征在于，所述的CYP97A4多肽選自下組: (i)具有SEQID NO:2氨基酸序列的多肽； (ii)將SEQID NO:2氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的且具有催化類胡蘿卜素β_環的羥化反應功能的由(i)衍生的多肽。
3.如權利要求1所述的用途，其特征在于，所述的CYP97A4多肽的編碼序列選自下組: (1)編碼如SEQID NO:2所述多肽的多核苷酸序列； (2)如SEQID NO:1所示的多核苷酸序列； (3)與(I)或(2)所述的多核苷酸序列互補的多核苷酸。
4.一種提高植物抗高`光脅迫能力，或提高植物捕光色素復合體II三聚體的裝配及穩定能力的方法，其特征在于，提高所述植物中CYP97A4多肽的表達或活性。
5.如權利要求4所述的方法，其特征在于，所述的抗高光脅迫能力為抗光氧化脅迫的能力。
6.如權利要求4-5任一所述的方法,其特征在于,該方法包括: (1)提供攜帶表達載體的農桿菌，所述的表達載體含有CYP97A4多肽的編碼序列； (2)將植物細胞或組織或器官與步驟(I)中的農桿菌接觸，從而使表達CYP97A4多肽的DNA編碼序列轉入植物細胞，并且整合到植物細胞的染色體上； (3)選擇已轉入CYP97A4多肽編碼序列的植物細胞或組織或器官； (4)將步驟(3)中的植物細胞或組織或器官再生成植株。
7.如權利要求4所述的方法，其特征在于，所述植物選自下組: 水稻、大麥、玉米、楊樹、大豆，或葡萄。
8.一種提高植物中β，ε -類胡蘿卜素與β，β-類胡蘿卜素比例和含量的方法，其特征在于，降低所述植物中CYP97A4多肽的表達或活性。
9.一種提高植物中α-胡蘿卜素或α-隱黃質的含量的方法，其特征在于，降低所述植物中CYP97A4多肽的表達或活性。
10.如權利要求8或9所述的方法，其特征在于，特異性敲除或干擾CYP97A4多肽的編碼基因的表達；或特異性的抑制CYP97A4多肽的活性。
全文摘要
本發明提供了類胡蘿卜素合成相關基因及其應用，具體地，所述的基因為CYP97A4，該基因參與植物在強光脅迫條件下的光保護、捕光復合物II三聚體裝配及穩定等作用。本發明還公開了該基因及其所編碼的多肽的用途，尤其是在植物品種改良和雜交育種中改變植物的光保護性質和類胡蘿卜素組成成分中的應用。
文檔編號C12P23/00GK103114120SQ20111036399
公開日2013年5月22日 申請日期2011年11月16日 優先權日2011年11月16日
發明者林鴻宣, 呂明珠, 晁代印, 高繼平, 單軍祥, 朱美珍, 施敏 申請人:中國科學院上海生命科學研究院