專利名稱：一株反硝化聚磷菌蠟樣芽孢桿菌H-hrb01及篩選方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物工程、環境工程技術領域，涉及一種反硝化聚磷菌株，同時提供這種菌株的篩選方法和應用。
背景技術：
隨著“水體富營養化”問題的日漸突出，污水排放標準的日趨嚴格，如何經濟、高效的去除氮磷污染成為水體污染防治領域的研究熱點。生物脫氮除磷工藝因其經濟、環保等優點而得到了廣泛應用，但其本身也存在一些問題亟待解決，如脫氮和除磷過程存在底物競爭和污泥齡等矛盾，使得生物脫氮除磷工藝的去除效能難以提高。反硝化聚憐菌(denitrifyingphosphorus removal bacteria, DPB)以 N03—N 作為電子受體吸收磷，在缺氧條件下同時實現脫氮和除磷的雙重目的。反硝化除磷菌在缺氧條件下，利用硝酸鹽作為電子受體氧化胞內貯存的PHB，并從環境中攝磷，實現同時反硝化和過量攝磷。與傳統的脫氮除磷相比，反硝化除磷技術在保證脫氮除磷效果的同時，可減少系統對COD和氧氣的消耗，污泥產量也可降低。到目前為止，反硝化聚磷菌株主要集中在Pseudomonas菌屬和Rhodococcus菌屬，菌種較為單一，且研究多集中在降解基因和降解機理方面，實際應用研究有限。
發明內容
本發明的目的是從自然界篩選出具有高效反硝化除磷效能的菌株Bacilluscereus H_hrb01，為污水生物脫氮除磷工藝的生物強化提供高效的菌制劑，對氮、磷等污染物進行生物處理。本發明的技術解決方案是一種反硝化聚磷菌蠟樣芽孢桿菌H-hrbOl，其特征在于菌株為Bacillus cereus H_hrb01,保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期為2012年3月27日，保藏號為CGMCC NO. 5939。菌株Bacillus cereus H_hrb01是穩定運行的SBR反應器缺氧段末的活性污泥中分離得到，具體篩選步驟如下
取SBR反應器運行穩定時某周期缺氧段末的活性污泥作為分離用泥，將所取活性污泥制成菌懸液，加入到反硝化培養基中，待培養基凝固后倒置培養皿于30°C恒溫培養箱中培養2 3天后，選取不同形態、菌落清晰的典型菌落，標記并挑取單個菌落在反硝化固體培養基上進行三區劃線分離，重復3 4次至菌落特征一致的單菌落，最后挑取單一菌落，轉接到準備好的試管斜面上以備用，所有操作均在無菌條件下進行；對己分離出來的菌株在富磷培養基中進行吸磷試驗，同時輔助進行硝酸鹽還原產氣試驗及異染顆粒染色(亞甲基藍染色法)和PHB顆粒染色(蘇丹黑染色法)檢驗；對于硝酸還原性為陽性并產氣，菌體內又含有聚磷顆粒或PHB顆粒，在好氧或缺氧條件下能過量吸磷的細菌即為試驗所需的反硝化聚憐囷種屬。
反硝化培養基配制如下檸檬酸鈉5. Og/L, K2HPO4 I. Og/L, KH2PO4 I. Og/L,MgSO4 ·7Η20 O. 2g/L, KNO3 2. Og/L,瓊脂 15g/L，用 NaOH 或者 HCl 調節培養基 pH 值至 7. 2，121°C高壓蒸汽滅菌20min。富磷培養基配制如下(PO廣-P為 8mg/L) =CH3COONa · 3H20 3. 23g/L, KH2PO4 35mg/L, NH4Cl 305. 52mg/L, MgSO4 · 7H20 91. 26mg/L, CaCl2 · 2H20 25. 68mg/L, PIPES buffer8. 5g/L,微量元素2ml/L，瓊脂15g/L，用NaOH或者HCl調節培養基pH值至7. 2，121 °C高壓蒸汽滅菌20min。微量元素的組成如下(IL)=FeCl3 O. 90g, H3BO3 O. 15g，KI O. 18g，CuSO4 · 5H200. 03g, MnCl2 · 4H20 0. 06g, ZnSO4 · 7H20 0. 12g, CoCl2 · 7H20 0. 15g, Na2MoO4 · 2H20 0. 06g,EDTA 10.OOg0該菌株H-hrbOl為革蘭氏陽性桿菌，內生芽孢，兼性厭氧，接觸酶陽性，氧化酶陰性，在pH 5. 0-11.0U0-45°C條件下生長，菌株寬度為I. 0_1· 2 μ m，長為3-5 μ m，無鞭毛； H-hrbOl桿菌在固體培養基上生長為白色不規則菌落，表面光滑，邊緣呈波浪狀，能以多種有機物為碳源，具有良好的反硝化除磷效能，能在污水污染物生物降解中應用，可用于污水生物脫氮除磷工藝。通過擴增該菌株的16S rDNA,得到了長度為1518 bp的16S rDNA序列。PCR 引物采用細菌通用引物 BA101F 5，-TGGCGGACGGGTGAGTAA-3，和 BA534R5’-ATTACCGCGGCTGCTGCTGCTGG-3’。用 PCR 儀進行擴增反應。PCR 反應體系(25 μ L)2. 5μ L10XPCR Buffer,2y L dNTPs (濃度為 2. 5mmol/L)，2 種引物各 0· 5 μ L，0· 5 μ L DNA 模板，0. 5μ L rTaq DNA聚合酶(5U/μ L)，無菌去離子水18. 5 μ L。PCR擴增程序為95 °C預變性5min，94°C變性lmin，58°C復性30s，72°C延伸3min，共30個循環，最后72°C延伸10min，l%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色后紫外檢測。通過程序進行同源性比較，表明該菌株與臘樣芽孢桿菌(Bacillus sp.)的相似性為99%,本發明提供的臘樣芽孢桿菌屬H_hrb01桿菌屬于芽孢桿菌屬。本發明所達到的有益效果是本發明提供的菌株Bacillus cereus H_hrb01能以多種有機物為碳源，有極強的反硝化菌磷能力，將菌株cereus Η-hrbOl投加到SBR生物強化裝置,反應器出水各項指標均優于未投加菌株cereus H-hrb01的對照系統，投加菌株cereus H-hrb01的反應器經16天的運行,對污水中COD、氨氮和可溶性磷的去除率分別達到93. 90%, 97. 70%和96. 25%。
圖I是菌株Bacillus cereus H-hrbOl的透射電鏡觀察圖。圖2是菌株Bacillus cereus H-hrbOl的個體和群體原子力照片。圖3是菌株H-hrbOl的生長曲線。圖4是菌株H-hrb01對COD的降解凈化效能。圖5是菌株H-hrb01對氨氮的降解凈化效能。圖6是菌株H-hrbOl對可溶性磷的降解凈化效能。
具體實施方式
下面結合附圖對本發明作進一步說明。
具體實施方式
一取SBR反應器運行穩定時某周期缺氧段末的活性污泥作為分離用泥。將所取活性污泥制成菌懸液，加入到反硝化培養基中，待培養基凝固后倒置培養皿于30°C恒溫培養箱中培養2 3天后，選取不同形態、菌落清晰的典型菌落，標記并挑取單個菌落在平板培養基上進行三區劃線分離，重復3 4次至菌落特征一致的單菌落，最后挑取單一菌落，轉接到準備好的試管斜面上以備用，所有操作均在無菌條件下進行。對己分離出來的菌株在富磷培養基中進行吸磷試驗，同時輔助進行硝酸鹽還原產氣試驗及異染顆粒染色(亞甲基藍染色法)和PHB顆粒染色(蘇丹黑染色法)檢驗。對于硝酸還原性為陽性并產氣，菌體內又含有聚磷顆粒或PHB顆粒，在好氧或缺氧條件下能過量吸磷的細菌即為試驗所需的反硝化聚磷菌種屬。反硝化培養基配制如下檸檬酸鈉5. Og/L, K2HPO4 I. Og/L, KH2PO4 I. Og/L,MgSO4 ·7Η20 O. 2g/L, KNO3 2. Og/L,瓊脂 15g/L，用 NaOH 或者 HCl 調節培養基 pH 值至 7. 2，121°C高壓蒸汽滅菌20min。
富磷培養基配制如下(PO廣-P為 8mg/L) =CH3COONa · 3H20 3. 23g/L, KH2PO4 35mg/L, NH4Cl 305. 52mg/L, MgSO4 · 7H20 91. 26mg/L, CaCl2 · 2H20 25. 68mg/L, PIPES buffer
8.5g/L,微量元素2ml/L，瓊脂15g/L。用NaOH或者HCl調節培養基pH值至7. 2。121°C高壓蒸汽滅菌20min。微量元素的組成(IL)=FeCl3 O. 90g，H3BO3 O. 15g，KI O. 18g，CuSO4 · 5H20 0. 03g，MnCl2 · 4H20 0. 06g, ZnSO4 · 7H20 0. 12g, CoCl2 · 7H20 0. 15g, Na2MoO4 · 2H20 0. 06g, EDTA
10.OOg0菌株H-hrbOl為革蘭氏陽性桿菌，內生芽孢，兼性厭氧，接觸酶陽性，氧化酶陰性，在ρΗ5· 0-11. O、10-45O條件下生長，菌株寬度為I. 0-1. 2 μ m，長為3-5 μ m，無鞭毛；H-hrbOl桿菌在固體培養基上生長為白色不規則菌落，表面光滑，邊緣呈波浪狀，能以多種有機物為碳源，具有良好的反硝化除磷效能，可用于污水生物脫氮除磷工藝。
具體實施方式
二
通過擴增該菌株的16S rDNA,得到了長度為1518 bp的16S rDNA序列。PCR 引物采用細菌通用引物 BA101F 5，-TGGCGGACGGGTGAGTAA-3，和 BA534R5’-ATTACCGCGGCTGCTGCTGCTGG-3’。用 PCR 儀(GeneAmp, PCR System 9700)進行擴增反應。用 PCR 儀(GeneAmp, PCR System 9700)進行擴增反應。PCR 反應體系(25 μ L):2. 5 μ L10XPCR Buffer,2y L dNTPs (濃度為 2. 5mmol/L)，2 種引物各 O. 5 μ L，O. 5 μ L DNA 模板，0. 5yL rTaq DNA聚合酶(5U/μ L)，無菌去離子水18. 5 μ L。每次PCR反應中設置陰性樣品作為參照，即以無菌超純水代替DNA模板。PCR擴增程序針對16S rRNA全序列的PCR擴增程序為95°C預變性5min，94°C變性lmin, 58°C復性30s，72°C延伸3min，共30個循環，最后72°C延伸10min，l%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色后紫外檢測。通過程序進行同源性比較，表明該菌株與蠟樣芽孢桿菌sp.)的相似性為99%，序列如下所示。I attagagttt gatcctggct caggatgaac gctggcggcg tgcctaatac atgcaagtcg 61 agcgaatgga ttaagagctt gctcttatga agttagcggc ggacgggtga gtaacacgtg
121 ggtaacctgc acataagact gggataactc cgggaaaccg gggctaatactggataatat181 tttggacctc atggttcaaa attgaaaggc ggcttcggct gtcacttatg gatggacccg241 cgtcgcatta gctagttggt gaggtaacgg ctcaccaagg caacgatgcg tagccgacct301 gagagggtga tcggccacac tgggactgag acacggcccagactcctacgggaggcagca361 gtagggaatc ttccgcaatg gacgaaagtc tgacggagca acgccgcgtgagtgatgaag421 gctttcgggt cgtaaaactc tgttgttagg gaagaacaag tgctagttga ataagctggc481 accttgacgg tacctaacca gaaagccacg gctactacgt gccagcagcc gcggtaatac541 gtaggtggca agcgttatcc ggaattattg ggcgtaaagc gcgcgcaggt ggtttcttaa601 gtctgatgtg aaagcccacg gctcaaccgt ggagggtcat tggaaactgggagacttgag661 tgcagaagag gaaagtggaa ttccatgtgt agcggtgaaatgcgtagagatatggaggaa721 caccagtggc gaaggcgact ttctggtctg taactgacac tgaggcgcgaaagcgtgggg781 agcaaacagg attagatacc ctggtagtcc acgccgtaaa cgatgagtgc taagtgttag841 agggtttccg ccctttagtg ctgaagttaa cgcattaagc actccgcctg gggagtacgg901 ccgcaaggct gaaactcaaa ggaattgacg ggggcccgcacaagcggtggagcatgtggt961 ttaattcgaa gcaacgcgaa gaaccttacc aggtcttgac atcctctgat aaccctagag1021 atagggcttc tccttcggga gcagagtgac aggtggtgca tggttgtcgt cagctcgtgt1081 cgtgagatgt tgggttaagt cccgcaacga gcgcaaccct tgatcttagt tgccatcatt1141 aagttgggca ctctaaggtg actgccggtg acaaaccggaggaaggtggggatgacgtca 1201 aatcatcatg ccccttatga cctgggctac acacgtgcta caatggacgg tacaaagagc1261 tgcaagaccg cgaggtggag ctaatctcat aaaaccgttc tcagttcgga ttgtagactg1321 caactcgcct acatgaagct ggaatcgcta gtaatcgcgg atcagcatgc cgcggtgaat1381 acgttcccgg gccttgtaca caccgcccgt cacaccacga gagtttgtaa cacccgaagt1441 cggtggggta acctttttgg agccagccgc ctaaggtggg acagatgatt ggggtgaagt1501 cgtaacaagg taaccaat具體實施方式
三
制備菌株cereus H-hrbOl的休眠細胞將培養好的菌株cereusH-hrbOl于8000 r/min,4°C下離心10 min,用磷酸緩沖液洗漆3次,用同樣的緩沖液重懸該沉淀，使得休眠細胞濃度為10 mg/ ,于4°C凍存，備用，即制得菌株feci/AAs· cereusH-hrbOl的休眠細胞。
具體實施方式
四
菌株Bacillus cereus H_hrb01生長曲線測定。按照測定細菌生長曲線的標準方法對菌株cereus H-hrbOl的生長曲線進行測定,每隔2h取培養液,采用光電比池法，在600nm波長處測定菌液的OD6tltl(Optical Density),然后經O. 22 μ m微孔濾膜過濾,檢測濾液PO廣-P, pH值等指標。獲得菌株cereus H-hrbOl生長曲線如圖3所示。從圖3中可以看出，菌株cereus H-hrbOl的生長曲線比較典型,潛伏期較短,為2h左右，這可能是因為菌株feci/AAs· cereus H-hrbOl的活性較強,且接種前后的培養條件相似，接入后在較短時間內即可適應新的環境。菌株的對數生長期約為14 16h，18h以后開始進入穩定期和衰亡期。從圖中還可得知菌株接入培養液中后就開始吸磷，但主要發生在對數生長期，在這個時期，微生物生長代謝最旺盛，吸磷量隨著對數期菌株的生長而逐漸增多。吸磷率在菌株進入穩定期后達到最大，接著出現了釋磷現象，但釋磷量很小。
具體實施方式
五菌株ifeciBiAs cereus H-hrbOl脫氮除磷效能測定將菌株cereus H_hrb01按照具體實施方案三方法處理后投加到人工廢水中混合后進入SBR生物強化裝置。采用連續投菌方式，在每日某周期初始的進水時投加菌株，并保持反應系統內的MLSS在3000mg/L以上。在污泥培養的全過程當中，均按照周期檢測進水和出水的COD、NH4+-N、和P0/—-P指標。同時，在同樣的運行條件下進行不投加反硝化聚磷菌的不進行生物強化的SBR啟動的對照試驗，獲得結果如下
a . COD的去除菌株cereus H-hrbOl對COD的降解效能如圖4所示。從圖4中可以看出，進水COD濃度在300 420mg/L之間波動。反應器運行的第一天出水COD濃度為88mg/L,投加菌株cereus H-hrbOl后反應器出水COD濃度降至22mg/L左右，而未投加菌株的對照反應器出水COD濃度則為45mg/L左右。反應器運行第13 16天，投加菌株cereus H-hrbOl反應器的出水COD濃度平均值(23. 72mg/L)明顯高于對照出水COD濃度平均值(45. 35mg/L),兩者的COD平均去除率分別為93. 90%和88. 35%，相對增幅達5. 55%，說明投加菌株cereus H-hrbOl的系統對污水中所含有機污染物處理效果優于未經生物強化的對照反應器。
b.氨氮的去除菌株cereus H_hrb01對氨氮的去除效能如圖5所示。從圖5中可以看出，進水NH/-N濃度在60 80mg/L之間波動。反應器運行的第一天出水NH4+-N濃度為31. 64mg/L,經投加菌株cereus H-hrbOl后反應器出水NH4+_N濃度降至0. 56mg/L,在反應器運行第13 16天,投加菌株cereus H-hrb01的反應器出水NH/-N濃度平均值(I. 65mg/L)明顯低于于對照出水NH4+_N濃度平均值(3. 70mg/L)，兩者的NH4+-N平均去除率分別為97. 70%和94. 88%，相對增幅達2. 82%，說明投加菌株BaciIlus cereus H-hrbOl的系統對污水中所含氨氮的處理效果較好。c.可溶性磷的去除菌株cereus H-hrb01對可溶性磷的去除效能如圖6所示。從圖6中可以看出，進水Ρ043_-Ρ濃度在8 12. 18mg/L之間波動。反應器啟動運行的第一天出水PO廣-P濃度為8. 42mg/L,經投加菌株cereus H-hrbOl后反應器出水Ρ043_-Ρ濃度降至0. 24mg/L左右。在反應器啟動第13 16天，投加菌株cereus H-hrb01的反應器出水Ρθ/__Ρ濃度平均值(0. 39mg/L)明顯低于對照出水Ρθ/__Ρ濃度平均值(I. 91mg/L)，兩者的Ρ043_-Ρ平均去除率分別為96. 25%和81. 64%，相對增幅高達
14.61%,說明經投加菌株cereus H-hrb01的系統對污水中所含磷酸鹽的處理效果明顯提升。結合反應器對C0D、氮和磷的去除情況可知，由于投加了菌株cereusH-hrbOl，出水各項指標均優于未投加菌株的對照組，尤其是對磷的去除和反硝化功能方面，投加菌株cereus H-hrbOl的系統經過短時間的啟動運行獲得了極好的脫氮除憐效果。
權利要求
1.一種反硝化聚磷菌臘樣芽孢桿菌H-hrbOl,其特征在于菌株為Bacillus cereusH-hrbOl，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期為2012年3月27 日，保藏號為 CGMCC NO. 5939。
2.根據權利要求I所述的芽孢桿菌H-hrbOl，其特征在于經鑒定為革蘭氏陽性桿菌，內生芽孢，兼性厭氧，在pH 5.0-11.0、10-45°C條件下生長，菌株寬度為I. 0_1. 2 μ m，長為3-5 μ m,無鞭毛；H-hrb01桿菌在固體培養基上生長為白色不規則菌落，表面光滑，邊緣呈波浪狀。
3.根據權利要求I或2所述反硝化聚磷菌蠟樣芽孢桿菌H-hrbOl的篩選方法，其特征在于菌株Bacillus cereus H_hrb01是穩定運行的SBR反應器缺氧段末的活性污泥中分離得到，具體篩選步驟如下 取SBR反應器運行穩定時某周期缺氧段末的活性污泥作為分離用泥，將所取活性污泥制成菌懸液，加入到反硝化培養基中，待培養基凝固后倒置培養皿于30°C恒溫培養箱中培養2 3天后，選取不同形態、菌落清晰的典型菌落，標記并挑取單個菌落在反硝化固體培養基上進行三區劃線分離，重復3 4次至菌落特征一致的單菌落，最后挑取單一菌落，轉接到準備好的試管斜面上以備用，所有操作均在無菌條件下進行；對己分離出來的菌株在富磷培養基中進行吸磷試驗，同時輔助進行硝酸鹽還原產氣試驗及異染顆粒染色(亞甲基藍染色法)和PHB顆粒染色(蘇丹黑染色法)檢驗；對于硝酸還原性為陽性并產氣，菌體內又含有聚磷顆粒或PHB顆粒，在好氧或缺氧條件下能過量吸磷的細菌即為試驗所需的反硝化聚憐囷種屬； 反硝化培養基配制如下檸檬酸鈉5. Og/L, K2HPO4 I. Og/L, KH2PO4 I. Og/L,MgSO4 ·7Η20 O. 2g/L, KNO3 2. 0g/L,瓊脂 15g/L，用 NaOH 或者 HCl 調節培養基 pH 值至 7. 2，12111C高壓蒸汽滅菌20min ； 富磷培養基配制如下(PO廣-P 為 8mg/L) =CH3COONa · 3H20 3. 23g/L, KH2PO4 35mg/L, NH4Cl 305. 52mg/L, MgSO4 · 7H20 91. 26mg/L, CaCl2 · 2H20 25. 68mg/L, PIPES buffer8. 5g/L,微量元素2ml/L，瓊脂15g/L，用NaOH或者HCl調節培養基pH值至7. 2，121 °C高壓蒸汽滅菌20min ；微量元素的組成如下(IL) =FeCl3 0. 90g, H3BO3 0. 15g，KI 0. 18g，CuSO4 · 5H20 0. 03g，MnCl2 · 4H20 0. 06g, ZnSO4 · 7H20 0. 12g, CoCl2 · 7H20 0. 15g, Na2MoO4 · 2H20 0. 06g, EDTA10. OOg0
4.根據權利要求I所述的反硝化聚磷菌蠟樣芽孢桿菌H-hrbOl，其特征在于菌株Bacillus cereus H_hrb01在污水生物脫氮除磷工藝中的應用。
全文摘要
一種反硝化聚磷菌蠟樣芽孢桿菌屬H-hrb01桿菌，屬于生物工程、環境工程技術領域，經鑒定屬于蠟狀芽孢桿菌屬，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期為2012年3月27日，保藏號為CGMCC NO.5939，蠟樣芽孢桿菌屬菌株H-hrb01能以多種有機物為碳源，具有良好的反硝化除磷效能，可用于污水生物脫氮除磷工藝，將菌株H-hrb01進行活化培養后，投加到人工廢水中混合后進入SBR生物強化裝置，反應器出水各項指標均優于未投加菌株的對照系統，對污水中COD、氨氮和可溶性磷的去除率分別達到93.90%，97.70%和96.25%。
文檔編號C12N1/02GK102827787SQ20121015319
公開日2012年12月19日 申請日期2012年5月17日 優先權日2012年5月17日
發明者馬放, 張曉昕, 李昂, 孫移鹿, 張斯 , 杜叢, 龐長瀧, 崔迪 申請人:哈爾濱工業大學宜興環保研究院