專利名稱：一種奶山羊pitx2基因單核苷酸多態性的檢測方法及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于奶山羊核苷酸多態性技術領域，涉及ー種奶山羊PITX2基因單核苷酸多態性的檢測方法及其應用。
背景技術：
奶山羊在我國奶業建設中發揮著重要作用，然而，與奶牛的基礎研究與實踐應用相比，奶山羊該方面極其滯后，整體水平非常低，奶山羊中蘊含的、與泌乳性狀相關的潛在重要基因資源仍未得到有效挖掘和利用。近年來，我國優良奶山羊品種，如關中奶山羊，生產性能下降較快，退化嚴重，直接影響了我國奶羊業的發展。自“三聚氰胺”事件發生以后，我國羊奶制品在國內外開始走俏，社會對羊奶制品需求越來越大，從而形成了羊奶制品的極大需求與奶山羊種源不斷下降之間的矛盾。
泌乳性能屬于數量性狀位點(QTL)，由微效多基因控制，遺傳カ較低。為此，在奶山羊育種方面，不能僅靠傳統育種手段對這些泌乳性狀進行改良，還需要應用涉及DNA標記的現代育種技術，因為DNA標記具有多態性豐富、遺傳穩定、不受組織、生理發育階段及環境影響等諸多優點。此外，隨著基因組計劃的實施，DNA標記的種類與數目的增多，基因圖譜密度與精度在不斷提高。因此，DNA標記輔助選擇(MAS)方法，作為ー種具有廣闊應用前景的分子育種技術，將有利于奶山羊品種的遺傳改良。目前，利用DNA標記進行動物MAS育種的主要步驟如下首先，在DNA水平上快速確定與泌乳性狀密切相關的重要基因及其多態性；其次，建立基因多態與泌乳性狀的關聯分析，確定與泌乳性狀顯著關聯的DNA標記或SNP位點；最后，實現遺傳標記輔助選擇和實現早期診斷選擇。為此，在奶山羊MAS育種中，必須選擇正確、可靠的重要候選基因，并確定快速檢測基因多態性的有效方法并進行關聯分析，從而達到利用DNA標記進行標記輔助選擇的目的。為此，在奶山羊MAS育種中，必須選擇正確、可靠的重要候選基因，并確定快速檢測基因多態性的有效方法并進行關聯分析，從而達到利用DNA標記進行標記輔助選擇的目的。通常，重要候選基因是與泌乳性狀有關的重要基因，可能是結構基因、調節基因或是在生化代謝途徑中影響該性狀表達的基因。下丘腦-垂體-腎上腺(HPA)軸是哺乳動物ー個至關重要的生物調節系統。作為HPA軸的關鍵組成部分，腦垂體前葉腺體是哺乳動物生長發育、泌乳、生殖的控制中心。在哺乳動物HPA軸的垂體腺細胞的發育過程中，包括PITX2等關鍵轉錄因子直接影響垂體前葉腺體的發育，因為它們至少調控生長激素(GH)、催乳素(PRL)、促甲狀腺激素(TSH)、促黃體素(LH) /促卵泡素(FSH)和ACTH等五種不同類型細胞分泌至少六種重要功能激素。已有研究表明GH和PRL具有極其重要的生物學功能，它們的缺乏將導致動物形體矮小、性晚熟，泌乳期延遲，泌乳能力下降等表型，而且，GH和PRL基因突變與動物泌乳性狀顯著關聯，故這兩個基因被國際公認為影響動物泌乳性狀的重要基因。為此，將HPA軸相關轉錄因子基因作為影響泌乳性狀表達的重要候選基因，分析其遺傳變異與奶山羊泌乳性狀的關聯并應用于生產實踐，在理論和實踐上是完全可行的。作為HPA軸相關基因中的重要成員，同源異型結構域蛋白轉錄因子(PITX)類轉錄因子成員在基因活化、垂體發育中的的關鍵性作用，故將此類基因與泌乳性能進行關聯性研究。作為PITX家族的重要成員，同源異型結構域蛋白轉錄因子2 (PITX2)基因被分別定位在人類第4號染色體、小鼠第3號染色體、褐鼠第2號染色體、犬第32號染色體、野豬第8號染色體、牛第6號染色體，但山羊的相應信息尚無報道。序列比對結果表明，PITX2在人類、黒猩猩、狗、鼠、雞、斑馬魚、牛和野豬中的序列高度保守，在許多發育通路中發揮重要作用，包括影響腦垂體的器官發生，影響GH、PRL、TSH的表達從而影響動物的泌乳性能。作為遺傳多態性中最重要、最普遍的類型，單核苷酸多態性(SNP)就是指基因組DNA序列中由于單個核苷酸(A/T/C/G)的變化而引起的多態性，其變異形式主要有轉換、顛換、插入和缺失等。實驗研究表明PITX2是下丘腦核和中腦正常發育所必需的因子，敲除該蛋白的小鼠不能形成正常的胚胎，并在胚胎期死亡。PITX2蛋白在小鼠的多種組織中有表達，影響肌肉和垂體等正常發育，是左右不對稱發育的信號分子，對細胞増殖發揮重要調控作用。目前，關于PITX2基因多態性研究多見于人、小鼠等生物的體外表達分析，且常被作 為器官機能缺陷和重要的疾病預測相關的候選基因，而鮮見于家畜和家禽多態性分析。截至目前，中國奶山羊PITX2基因多態性領域的研究匱乏，基因位點的功能研究及其遺傳變異與泌乳性能(如產奶量、乳脂率、乳脂量、乳蛋白率、乳蛋白量、乳固體物含量等)的關聯研究仍是空白。
發明內容
本發明解決的問題是提供ー種奶山羊PITX2基因單核苷酸多態性的檢測方法，利用PCR-RFLP方法快速檢測奶山羊PITX2基因單核苷酸多態性(SNP)，并將其與奶山羊泌乳性狀進行關聯分析，驗證其作為奶山羊分子育種中輔助選擇的DNA標記，從而加快良種選
育速度。本發明是通過以下技術方案來實現ー種奶山羊PITX2基因單核苷酸多態性的檢測方法，以奶山羊基因組DNA或包含PITX2基因的DNA序列為模板，以PCR引物對P為引物，擴增奶山羊PITX2基因，然后利用限制性內切酶RsaI對PCR產物進行酶切，再對酶切后的擴增片段進行瓊脂糖凝膠電泳；根據電泳結果鑒定奶山羊PITX2基因第543位的單核苷酸多態性TT基因型表現為432bp —條條帶；TC基因型表現為432bp，320bp和112bp三條條帶；CC基因型表現為320bp和112bp兩條條帶；所述的引物對P為上游引物 tcgtccatga actgcatgaa aggc ；下游引物 aaaggaaggg aggtcagggt Cgtaat0所述的PCR擴增反應程序為95°C預變性 5min ;35 個循環(94°C變性 30s，55. 9°C退火 30s，72°C延伸 30s);72°C延伸IOmin0所述的瓊脂糖凝膠電泳為I. 0%瓊脂糖凝膠電泳。所述的奶山羊PITX2基因單核苷酸多態性的檢測方法，將奶山羊PITX2基因第543位SNP位點的TT和TC基因型作為有效DNA標記。所述的DNA標記為TT和TC基因型作為奶山羊泌乳性狀的標記輔助選擇育種中提高奶山羊乳脂含量同時降低乳糖含量、乳濃度的DNA標記。奶山羊PITX2基因第543位的單核苷酸多態性中的TT和TC基因型作為奶山羊泌乳性狀的標記輔助選擇育種中提高奶山羊乳脂含量同時降低乳糖含量、乳濃度的DNA標記的應用。與現有技術相比，本發明具有以下有益的技術效果本發明公開了與奶山羊泌乳性相關的功能基因PITX2第543位的核苷酸多態性，該核苷酸多態性能夠作為ー個分子遺傳標記以關中奶山羊基因組DNA池為模板，進行PCR擴增，并對PCR產物進行測序，測序后得到奶山羊PITX2基因的部分序列。與NCBI公布的 序列進行比較后，發現在第543位(內含子I的第110位)存在SNP。針對上述第543位的SNP，本發明還公開了其篩查和檢測方法，通過設計特定的引物，PCR擴增目的片段，然后用特定的限制性內切酶酶切鑒定，能夠簡單、快速、低成本、精確地檢測其單核苷酸多態性。本發明對關中奶山羊該SNP基因型進行了檢測和基因頻率分析，對上述SNP位點與奶山羊的泌乳性能(包括產奶量、乳脂率、乳脂量、乳蛋白率、乳蛋白量、乳固體物含量)進行關聯分析，結果表明TT和TC基因型作為在奶山羊泌乳性狀的標記輔助選擇育種中顯著提高奶山羊乳脂含量而同時又降低乳糖含量、乳濃度的有效DNA標記。此檢測方法在奶山羊的標記輔助選擇(MAS)育種中，有利于快速建立遺傳資源優良的奶山羊種群。該方法操作簡單、快速，成本低，而且檢測的精確度高，便于推廣應用。
圖I為奶山羊PITX2基因432bp片段的PCR擴增結果圖；圖2為奶山羊PITX2基因第543位CC和TT基因型個體的測序圖；圖3為RsaI PCR-RFLP方法檢測山羊PITX2基因第I內含子SNP(NC_007304:g. 543T>C or IVS1+110T>C)序列分析圖，其中帶框序列分別表示上下游引物序列，單個字母粗體且帶框的黃色標記位點表示SNP位點。圖4為RsaI PCR-RFLP方法檢測奶山羊PITX2基因第543位(內含子I第110位)SNP酶切電泳分型圖。
具體實施例方式下面結合具體的實施例對本發明做進ー步的詳細說明，所述是對本發明的解釋而不是限定。(一)試劑及其來源I.生化試劑與生物學試劑①Taq DNA聚合酶(購自MBI公司);②限制性內切酶RsaI(購自MBI公司);③dNTPs(購自MBI公司);④Marker D2000 (購自北京天根生化科技有限公司);⑤蛋白酶K (購自華美生物工程公司)。
2.普通試劑普通試劑從華美生物工程公司購買，為進ロ分裝產品檸檬酸、檸檬酸鈉、葡萄糖、Tris、EDTA、NaCl、Na0H、KCl、Na2HP04、KH2P04、Tris 飽和酚、氯仿、異戊醇、無水こ醇、醋酸鈉、十二烷基磺酸鈉(SDS )、溴化こ錠(EB )、溴酚藍、ニ甲基苯氰FF、瓊脂糖等。3.溶液與緩沖液所有溶液與緩沖液均采用去離子超純水配制。高壓滅菌條件為15bf/in(I. 034X IO5Pa), 25min。試劑配制方法均參考Sambrook等編著的《分子克隆實驗指南》。(I)樣品采樣所用溶液抗凝劑ACD :檸檬酸 0. 48g ;檸檬酸鈉I. 32g ;葡萄糖I. 47g。把它們定容于IOOmL水中，高壓滅菌。姆6mL新鮮血液中加入ImL的A⑶液。這ー抗凝劑優于EDTA，在血液貯存過程中能更好地保存高分子的DNA，經其抗凝的血液可以在0°C保存數天或_70°C長期保存。(2)血樣基因組DNA分離所用溶液①PBS緩沖液NaCl 8g，KCl 0. 2g，Na2HPO4
I.44g, KH2PO4 0.24§，加超純水至 1000111し調？11至7.4，高壓滅菌；@10% SDS : IOg SDS溶解于90mL的超純水中，68°C水浴溶解，用HCl調pH至7. 2，定容至IOOmL 0. 5mol/L EDTA EDTA 186. lg，溶于800mL的超純水中，用NaOH調pH至8. 0，定容至IOOOmL,高壓滅菌，4°C保存; lmol/L Tris Cl :121. 14g Tris，溶于 800mL 超純水中，HCl 調節 pH 至 8. 0，定容至 IOOOmL,高壓滅菌，4°C保存； 5mol/L NaCl NaC1292. 2g 溶于 IOOOmL 超純水中； DNA抽提緩沖液取 0. Smmol /T, EDTA 40mL, Immol /T, Tris Cl 10mT, !⑦ 5mmol/LNaCl 4mL, 10%SDS IOmL 定容至 IOOmL0 實際濃度為 200mmol/L EDTA, pH 8. 0 ； IOOmmoI/L Tris HCl, pH8. 0 ；200mmol/L NaCl，2% SDS ；RNase 20 u g/mL ; NaAc 緩沖液NaAc *3H20 20. 4g ;超純水40mL -M HAc 調 pH 至 7. 4 ;定容至 50mL ； TE 緩沖液=Tris Cl 緩沖液(pH 8. 0) IOmmol/L，EDTA緩沖液(pH 8.0)0. lmmol/L，高壓滅菌，4°C保存；⑩蛋白酶K :用超純水配成20mg/mL，_20°C保存；(3)組織樣DNA提取所用溶液除了基因組DNA提取時的公用溶液外，還配置以下試劑①2mol/L NaCl :11. 688g溶于水，定容至IOOmL，高壓滅菌；②組織DNA提取液(IOOmL) 1 mol/L Tris-Cl (pH 8.0)1 mL，0.5mol/L EDTA (pH 8. 0) 20mL,2mol/L NaCl5mL,定容至 10OmT,；(4)瓊脂糖電泳分析所用溶液①0.5XTBE緩沖液取10XTBE 50mL定容至IOOOmL !②上樣緩沖液0. 25%溴酚藍，0. 25% ニ甲苯青FF，40. 0% (w/v)蔗糖水溶液。(ニ)奶山羊PITX2基因部分DNA序列的克隆與DNA測序A、奶山羊樣品的采集及生產數據的收集提取DNA所用血樣(靜脈采血)和耳組織樣均采自658只健康且無血緣關系的2_4歲關中奶山羊，采自陜西省三原縣奶山羊育種場(2009年7月)。關中奶山羊奶產量數據來自育種場記錄；奶山羊乳脂含量(包括平均乳脂含量、晨乳乳脂含量和晚乳乳脂含量)、乳糖含量(包括平均乳糖含量、晨乳乳糖含量和晚乳乳糖含量)、乳濃度(包括平均乳濃度、晨乳乳濃度和晚乳乳濃度)、乳固體物含量(包括平均乳固體物含量、晨乳乳固體物含量和晚乳乳固體物含量)、乳非固體物含量(包括平均乳非固體物含量、晨乳乳非固體物含量和晚乳乳非固體物含量)均由MilkoScan FT120(F0SSCorporation, Denmark)儀器測量所得。其中，早奶為早晨5 :00獲得的奶樣,而晚奶為下午5 00獲得的奶樣。B、血樣基因組DNA的提取與分離(I)冷凍血樣(主要為血細胞)室溫解凍,轉移500 ii L至I. 5mLEppendorf管,加入等體積PBS液,充分混勻，12000r/min離心IOmin (4°C ),棄去上清液,重復上述步驟至上清液透明、沉淀呈淡黃色。(2)在離心管中加入DNA抽提緩沖液500 ii L，搖動，使血細胞沉淀脫離離心管管壁，37°C水浴lh。(3)加蛋白酶K至30iiL (20mg/mL)并混勻，55°C過夜至澄清，尚未澄清者，可補加10 y L蛋白酶K混勻繼續消化直至澄清；(4)將反應液冷卻至室溫，加Tris-飽和酚500 u L，溫和搖動離心管20min，使其充分混勻；4°C，12000r/min離心IOmin,將上清液轉入另一 I. 5mL離心管中，重復一次；(5)加氯仿500mL,充分混勻20min,4°C,12000r/min離心lOmin，將上清液轉入另一 I. 5mL離心管中；(6)加氯仿、異戊醇混合液(24 :l)500mL,充分混勻20min,4°C, 12000r/min離心IOmin,將上清液轉入另一 I. 5mL離心管中；(7)加0. I倍體積的NaAc緩沖液及2倍體積的冰冷的無水こ醇，混合轉動離心管 直至白色的絮狀沉淀析出，-20°C保存30 60min ； (8)4°C, 12000r/min離心lOmin，棄去上清液，用70%冰冷こ醇漂洗DNA沉淀2次；(9)4°C，12000r/min離心lOmin，棄去上清液，室溫下使こ醇揮發干凈；(10)干燥后的DNA溶于80 100 ii L的TE液，4°C保存直至DNA完全溶解，0. 8%瓊脂糖凝膠電泳檢測其質量，-80°C保存。C、組織樣品DNA的提取與分離(I)取奶山羊耳組織樣約IOmg的組織樣品，放于I. 5mL的離心管中，用小剪刀盡量剪碎；(2)加入600 u L組織提取液，10% SDS至終濃度為I %，蛋白酶K至終濃度為100 u g/mL，55. (TC消化過夜，最好保證組織樣較均勻地分布在組織提取液中；(3)將溶液冷卻至室溫，加入等體積的Tris飽和酚，蓋緊管蓋，緩慢地來回顛倒離心管，至少持續IOmin以上，12000r/min離心15min ; (4)取上清液,加入等體積的酹氯仿(I :I)，蓋緊管蓋，緩慢地來回顛倒離心管，至少持續IOmin以上，12000r/min離心15min ; (5)取上清液,加入等體積的氯仿異戊醇(24 :1 )，蓋緊管蓋，緩慢地來回顛倒離心管，至少持續IOmin以上，12000r/min離心15min ； (6)取上清液，加入2倍體積的冰冷無水こ醇和1/10體積的3mol/Lこ酸鈉，蓋緊管蓋，緩慢地來回顛倒離心管，直至出現白色絮DNA ；(7)挑出DNA，放進ー個I. 5mL的離心管中，加入500 u L 70%こ醇，蓋緊管蓋，緩慢地來回顛倒離心管，然后12000r/min離心3 5min，小心倒掉こ醇，將管倒置于吸水紙上；(8)再一次向離心管中加入500y L70%こ醇，蓋緊管蓋，緩慢顛倒，然后12000r/min離心3 5min，小心倒掉こ醇，將管倒置于吸水紙上；(9)待干燥后,加入60 u L滅菌超純水,4 °C保存過夜,待檢測。D、DNA 的純化(I) 500 ii L的DNA溶液中加入10%SDS使其終濃度為0. 1%，加入蛋白酶K至終濃度達到100 u g/mL ；(2) 5°C保溫IOh左右；(3)等體積苯酚氯仿:異戊醇(25 :24 :1)和氯仿分別抽提一次；(4) 12000r/min離心5min分相，吸取上層水相至另ー離心管中；(5)加入1/10體積3mol/L醋酸鈉和2倍體積冰冷無水こ醇沉淀DNA ; (6)倒掉液體，70%こ醇洗滌后涼干，加入60 u L滅菌超純水溶解，4°C待檢測。E、分光光度法檢測DNA用紫外光光度計測定DNA樣品在260nm、280nm處的OD值。計算DNA含量和OD26tl/OD280的比值，如OD26tZOD28tl比值小于I. 6，說明樣品中含有較多的蛋白質或酚，則應進行純化；若比值大于I. 8，則應該考慮去除RNA純化。根據如下公式計算DNA濃度DNA濃度(ng)=50XOD26tl值X稀釋倍數。DNA檢測完畢后，取出一定的量稀釋至50ng/iiL，存于-20°C備用，其余的存放于_80°C。F、DNA池的構建DNA檢測完畢后，從100個濃度為50ng/ u L的關中奶山羊DNA樣品中各取10 y L混合，構建關中奶山羊群體DNA池。G、引物的設計由于目前美國國立醫學圖書館(NCBI)網站上并未公布奶山羊PITX2基因的序列，為此，以NCBI上公布的牛PITX2基因(GenBank accession No. NC_007304)序列為參考，利用軟件Primer 5. 0設計了擴增奶山羊PITX2基因第I內含子的432bp片段的PCR引物對P，其引物對P的序列信息如下
上游引物F:5’-TCGTCCATGAACTGCATGAAAGGC-3’(nt220_243)(參考序列=GenBankAccession Number:NC 007304)下游引物5’-AAAGGAAGGGAGGTCAGGGTCGTAAT-3’(nt 626-651)(參考序列GenBank Accession Number:NC 007304)11、？0 克隆奶山羊？幾父2基因以構建好的關中奶山羊群體DNA池為模板，用上述設計的引物進行PCR擴增，PCR反應體系見表I。表IPCR反應體系
滅菌超純水(H2O)9. 2 y L
10XPCR 緩沖液(MBI，Fermentas)I. 25y L
MgCl2 (25mmol/L)0. 75y L
dNTPs (2. 5mmol/L)0. 2y L
上游引物(lOpmol/L)0.25 y L
下游引物(lOpmol/L)0.25 y L
Taq DNA 聚合酶(5U/y L)0. I y L
DNA 模板(50ng/y L)0. 5y L
總體積12.5yLPCR反應的程序如下95°C預變性5min，35個循環(94 °C變性30s，55. 9 °C退火30s，72°C延伸 30s) ;72°C延伸 IOmin0奶山羊PITX2基因432bp片段的PCR擴增結果圖如圖I所示，其中泳道2_8為不同個體的 432bp PCR 擴增產物；泳道 I 為 Marker=D2000, Ladder 分別是 2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp 和 IOObp)I、PCR產物純化和DNA池測序PCR擴增完成之后進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，然后進行PCR產物的切膠回收及純化在紫外燈下從瓊脂糖凝膠上切下含目的片段的凝膠，放入I. 5mL離心管中，然后用PCR產物回收純化試劑盒(北京天根生物公司)純化PCR產物，按照試劑盒說明書操作。把以關中奶山羊DNA池為模板的PCR純化產物送南京金斯瑞有限公司進行雙向測序。對奶山羊PITX2基因第I內含子432bp片段的測序峰圖進行分析，其中在同一位點有兩個不同峰表示發生了單核苷酸突變。具體的測序圖如圖2所示，帶框的字母C或T表示該位點為C或T等位基因(NC_007304:g. 543C或NC_007304: g. 543T);綠線代表A堿基的測序峰，紅線代表T喊基的測序峰，監線表C喊基的測序峰,黑線代表G喊基的測序峰)。具體的432bp的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. I所示，該序列對多態性進行了體現。
然后利用Blastn軟件和BioXM(2. 6)軟件對T等位基因和C等位基因的相應序列進行序列比對和酶切位點分析，發現T>C的突變(NC_007304:g. 543T>C)存在RsaI多態性，其分析結果如圖3所示，圖3為RsaI PCR-RFLP方法檢測山羊PITX2基因第I內含子110位SNP(NC_007304:g. 543T>C或IVS1+110T>C)序列分析圖，其中帶框序列分別表示上下游引物序列，單個字母粗體且帶框的黃色標記位點表示SNP位點。這表明篩查到了奶山羊PITX2基因的I個SNP，在其第543位為T或C的單核苷酸多態性，可表示為T>C。并且該多態性能夠通過PCR-RFLP方法檢測。(三)奶山羊PITX2基因543位T>C多態性的RsaIPCR-RFLP分析A、多態位點分析當奶山羊PITX2基因第543位發生T>C突變時，即T突變為C，原來GTAT序列相應地變成GTAC，從而增加了 RsaI限制性內切酶識別序列，能被限制性內切酶RsaI所切割。B、PCR反應條件PCR擴增體系和反應條件分別如前面所述，其中模板使用奶山羊個體基因組DNA，
2.5ul PCR擴增產物用I. 0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，可以清晰的看到432bp的條帶。C、PCR產物酶切(RsaI)及RFLP檢測對PCR擴增產物首先分別進行RsaI酶切，然后根據瓊脂糖凝膠電泳結果判定該位點的單核苷酸多態性。酶切RsaI酶切體系(20ii L):10ii L 奶山羊個體 DNA PCR 產物，2. 0 ii LlOXbuffer緩沖液(含BSA)，I. Oii L (濃度IOU/iiL)的RsaI限制性內切酶，7 y L滅菌超純水(H2OX37°C恒溫水浴或空氣浴中消化6h。瓊脂糖凝膠電泳分型制作I. 0%的瓊脂糖凝膠，IOOV電壓下電泳，當分子量不同的DNA片段分離清晰吋，EB染色，用BIO-RAD Gel Doc 2000凝膠成像分析系統照相分析，人工進行判型。檢測結果如圖4所示，其中，泳道I為Marker(D2000)，Ladder大小分別是2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp 和 IOObp;泳道 7、12、13、14 和 15 為 TT 基因型;泳道 2、3、4、5、6、8、9、10、11和16為TC基因型；泳道17和18為CC基因型。奶山羊PITX2基因PCR擴增產物的SNP位點所在序列為GTAT時，不能被限制性內切酶RsaI識別，432bp的基因片段不被切為121bp、109bp兩條帶，僅表現I條帶；當上述該位點發生T>C的突變時(即GTAC)，能被限制性內切酶RsaI識別，432bp的基因片段被切為121bp、109bp兩條帶；由于山羊為二倍體動物，當發生T>C突變時，可形成不同的基因型，分別為TT、TC和CC，可以通過其酶切后的電泳圖來進行判別TT基因型表現為432bp —條帶，TC基因型表現為432bp、320bp、112bp三條帶，CC基因型表現為320bp和112bp兩條帶。(四)DNA標記在關中奶山羊群體多態性中的診斷應用A、群體多態性中的診斷利用上述的SNP檢測方法對所有關中奶山羊的DNA樣品分別進行PCR-RFLP的基因型鑒定。B、SNP位點的頻率統計分析基因型頻率是指ー個群體中某一性狀的各種基因型之間的比率。Paa = NAA/N，其中 Paa代表某一位點的AA基因型頻率；Naa表示群體中具有AA基因型的個體數；N為檢測群體的總數量。基因頻率是指ー個群體中某一基因對其等位基因的相對比率。計算的公式可以寫成PA= (2Nm + NAal + NAa2 + NAa3 + NAa4 +......+ NAan) /2N式中，Pa表示等位基因A頻率，Naa表示群體中具有AA基因型的個體數量，NAai表示群體中具有Aai基因型個體數量，al — an為等位基因A的n個互不相同的復等位基因。所涉及的等位基因為T和C，所以具體的基因頻率計算公式為Pt= (2Ntt+Ntc) /2NPc= (2Ncc+Ntc) /2N式中，PT，Pc分別表示等位基因T和C的頻率，Ntt, Ntc和Ncc分別表示TT、TC和CC基因型的個體數量，N表示總群體數目。如表2所示的基因頻率分布，關中奶山羊PITX2基因RsaI位點SNP中的T等位基因頻率為0. 953，C等位基因頻率為0. 047，符合等位基因頻率大于0. 01 (I. 0%)的SNP的定義，故本位點屬于單核苷酸多態位點。表2關中奶山羊PITX2_RsaI位點等位基因頻率及基因型頻率
樣本S 基_型和基_頻率觀察值等位基因頻率
TT(Ptt) TC(Ptc) CC(Pcc) T(Py) C(Pc)
658 一 601(0.913) _ 52(0.079) 一 5(0.008) ——0.953 __ 0.047 —(五)奶山羊PITX2基因SNP位點的基因效應關聯分析A、基因型數據限制性內切酶RsaI識別的基因型(TT、TC和CC)。B、生產數據關中奶山羊奶產量、乳脂含量(包括平均乳脂含量、晨乳乳脂含量和晚乳乳脂含量)、乳糖含量(包括平均乳糖含量、晨乳乳糖含量和晚乳乳糖含量)、乳濃度(包括平均乳濃度、晨乳乳濃度和晚乳乳濃度)、乳固體物含量(包括平均乳固體物含量、晨乳乳固體物含量和晚乳乳固體物含量)、乳非固體物含量(包括平均乳非固體物含量、晨乳乳非固體物含量和晚乳乳非固體物含量)。C、關聯分析模型
先對數據進行描述分析，確定是否存在離群值，再利用最小ニ乘分析對數據校正；根據數據特征，應用SPSS (18.0)軟件分析各基因型間的生產性狀效應。在對基因型效應進行分析時采用了固定模型Yijk= U +Aj+Gj+ (AG) ^+em,其中Yuk為泌乳性狀的觀察值，U為總體均值，Ai為年齡效應，Gj為基因型效應，(AG)ij為年齡和基因型的交互效應，eijk為隨機誤差。由于所有實驗動物(關中奶山羊)都由同一養殖場提供，且均為初產胎次，因此農場效應和胎次效應不予考慮。結果表明(見表3):關中奶山羊TT基因型晨乳乳脂含量和晚乳乳脂含量均顯著高于TC基因型和CC基因型(P〈0. 05)，而且TC基因型個體晨乳乳脂含量和晚乳乳脂含量均顯著高于CC基因型個體(P〈0. 05)，即TT和TC基因型個體乳脂含量均顯著高于其他基因型。這結果掲示，T等位基因對乳脂含量具有顯著的正遺傳效應，表明TT和TC基因型可以作為ー個提高奶山羊乳脂含量的候選DNA遺傳標記。另ー方面，CC基因型個體晨奶乳糖含量(％)和晚奶乳糖含量(％)顯著地優于TT基 因型和TC基因型(P〈0. 001或P=O. 018)，而TT基因型和TC基因型個體之間差異不顯著；同吋，CC基因型個體晨奶乳濃度(％)和晚奶乳濃度(％)極顯著地優于TT基因型和TC基因型(P〈0. 001)，而TT基因型和TC基因型個體之間差異不顯著。即CC基因型個體乳糖含量和乳濃度均顯著高于其他基因型。這些結果說明T等位基因對乳糖含量(％)和乳濃度(％)具有顯著的負向遺傳效應，表明TT和TC基因型可以作為一個顯著降低奶山羊乳糖含量(％)和乳濃度(％)的有效DNA遺傳標記。因此，在分析中國本土奶山羊PITX2基因內含子I的單核苷酸多態性(SNP)的基礎上并通過性質關聯分析，結果表明該位點的多態性中，(IVS1+110T>C)的TT基因型和TC基因型可以作為顯著提高奶山羊乳脂含量而降低乳糖含量、乳濃度的有效DNA標記，從而應用于分子育種。表3關中奶山羊Pl位點(PITX2_RsaI) SNP與泌乳性能的關聯分析
權利要求
1.一種奶山羊PITX2基因單核苷酸多態性的檢測方法，以奶山羊基因組DNA或包含PITX2基因的DNA序列為模板，以PCR引物對P為引物，擴增奶山羊PITX2基因，然后利用限制性內切酶RsaI對PCR產物進行酶切， 再對酶切后的擴增片段進行瓊脂糖凝膠電泳；根據電泳結果鑒定奶山羊PITX2基因第543位的單核苷酸多態性TT基因型表現為432bp —條條帶；TC基因型表現為432bp，320bp和112bp三條條帶；CC基因型表現為320bp和112bp兩條條帶； 所述的引物對P為 上游引物tcgtccatga actgcatgaa aggc ； 下游引物 aaaggaaggg aggtcagggt Cgtaat0
2.如權利要求I所述的奶山羊PITX2基因單核苷酸多態性的檢測方法，其特征在于，所述的PCR擴增反應程序為 95°C預變性 5min ;35 個循環(94°C變性 30s，55. 9°C退火 30s，72。。延伸 30s);72°C延伸IOmin0
3.如權利要求I所述的奶山羊PITX2基因單核苷酸多態性的檢測方法，其特征在于，所述的瓊脂糖凝膠電泳為I. 0%瓊脂糖凝膠電泳。
4.如權利要求I所述的奶山羊PITX2基因單核苷酸多態性的檢測方法，其特征在于，將奶山羊PITX2基因第543位SNP位點的TT和TC基因型作為有效DNA標記。
5.如權利要求4所示的奶山羊PITX2基因單核苷酸多態性的檢測方法，其特征在于，所述的DNA標記為 TT和TC基因型作為奶山羊泌乳性狀的標記輔助選擇育種中提高奶山羊乳脂含量同時降低乳糖含量、乳濃度的DNA標記。
6.奶山羊PITX2基因第543位的單核苷酸多態性中的TT和TC基因型作為奶山羊泌乳性狀的標記輔助選擇育種中提高奶山羊乳脂含量同時降低乳糖含量、乳濃度的DNA標記的應用。
全文摘要
本發明公開了一種奶山羊PITX2基因單核苷酸多態性的檢測方法，該方法以奶山羊基因組DNA或包含奶山羊PITX2基因的DNA序列為模板，利用PCR引物對P為引物，擴增奶山羊PITX2基因；通過限制性內切酶RsaI對其進行酶切，再根據瓊脂糖凝膠電泳對酶切產物進行片段大小分離，利用凝膠成像系統分析其片段大小，從而確定奶山羊PITX2基因第543位的SNP。該SNP位點的TT基因型和TC基因型可作為顯著提高奶山羊乳脂含量，而同時又顯著降低乳糖含量、乳濃度的有效DNA標記。
文檔編號C12N15/11GK102808018SQ20121015394
公開日2012年12月5日 申請日期2012年5月17日 優先權日2012年5月17日
發明者藍賢勇, 趙海諭, 潘傳英, 姜興武, 陳宏 , 雷初朝 申請人:西北農林科技大學