專利名稱：A、o和c型口蹄疫病毒的試劑盒及使用方法
技術領域：
本發明涉及一種對牛和豬以及相關牛和豬的產品是否感染特定的傳染病進行檢測的試劑盒，以及這種試劑 盒的使用方法。確切講是本發明是一種檢測牛和豬以及相關牛和豬的產品是否感染A、0或C型口蹄疫病毒的試劑盒，以及這種試劑盒的使用方法。
背景技術：
口蹄疫(Foot and mouth disease, FMD)是一種由口蹄疫病毒(Foot and mouthdisease virus,FMDV)引起的危害牛、羊等偶蹄動物的嚴重的急性熱性高度接觸性傳染病。由于其傳播速度快，不易控制和消滅，嚴重危害世界動物貿易，被世界衛生組織列為必須上報傳染病之一。口蹄疫病毒屬于微核糖核酸病毒科(picornaviridas)中的口蹄疫病毒屬(aphthavirus)。共包括 A、C、O、Asia I、SAT I、SAT II 及 SAT III 型 7 個血清型，各血清型之間無交叉保護力。FMDV的病毒粒子直徑20-25nm，為正二十面體結構，近似圓形；基因組為全長8500(nt)的正鏈RNA,包括一個開放閱讀框(open reading frame, 0RF),5’ -非編碼區(5，-Untraslated Region, 5，-UTR)和 3，-非編碼區(3，-Untraslated Region,3’-UTR) ;0RF編碼病毒多聚蛋白，依賴于自身編碼的蛋白酶(L、2A、3C)及少數的宿主因子，在經過3級裂解后，形成4種病毒結構蛋白(VP4、VP2、VP3和VPl)和9種非結構蛋白(Lab、Lb、2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D);四種結構蛋白各60分子構成病毒顆粒，VPl靠近由五個原粒組成病毒表面的小洞，VP2和VP3位于遠端，VP4則完全位于衣殼里面。盡管目前國內外對口蹄疫的病原學、血清分型、診斷做了大量的研究，但口蹄疫病毒幾乎遍及世界各地，口蹄疫對偶蹄類經濟動物的威脅眾所周知，它的發病率和造成的經濟至今仍為各類傳染病之首。2004年，臺灣爆發的口蹄疫導致了 600萬頭豬被屠宰，直接和間接經濟損失到120億美元。在畜牧獸醫方面，它也威脅著多種家畜和很多野生動物的繁衍和生存。0型和A型口蹄疫基本呈世界性分布，Asia I在我國曾經流行，到目前已經60年沒有發生，科研人員傾向于其可能已經在中國滅絕，SAT I、SAT II及SAT III型主要存在于非洲，C型口蹄疫流行范圍相對較小，但對我國威脅較大。由于口蹄疫血清亞型眾多，毒力相差很大，所以在臨床癥狀差別較大。尤其口蹄疫與豬水泡病、水泡性口炎等類似癥狀的病毒，在臨床上很難區分，而且臨床癥狀和病理變化因感染動物的種類、年齡、病程長短及感染毒株毒力等不同而有所差別，可能缺乏特征病癥，這給口蹄疫的診斷和防治帶來極大困難。因此，單靠臨床診斷難以定性。快速簡單的實驗室診斷方法是確診口蹄疫唯一有效地途徑。隨著分子生物學技術的快速發展，口蹄疫診斷技術的研究不斷取得新的進展，為口蹄疫病毒核酸序列分析創造了條件。為了確定口蹄疫是否在某一地區存在，檢測動物血清抗體的方法并非完全可靠，還必須通過通過病原學檢測以確診病原的存在，一般檢測方法為生物學實驗、血清型診斷技術和分子生物學技術等診斷技術，但是這些方法有的敏感性不高、有的特異性不強、有的檢出率較低，即使病毒分離技術被認為是檢測口蹄疫的金標準，但其確認結果至少需要7天，檢測周期太長，并且這些技術普遍費用太高，存在二次散毒的隱患，一般基層很難開展此項工作。同時，O型和A型口蹄疫近年在我國流行比較普遍，而C型口蹄疫在我國周邊亞洲地區具有流行史，因此建立一種快速診斷C型、O型和A型口蹄疫的診斷技術，完成對O型和A型口蹄疫的快速診斷以及對C型口蹄疫病毒進行監控，防止其傳入我國具有重要意義。
發明內容
本發明提供一種快速、簡便、靈敏和經濟的檢測試劑盒及使用方法，且這種方法用于檢測臨床樣品時，可以區分動物所感染的是A、0和C型口蹄疫病毒。本發明的試劑盒中至少有三對引物組成，其中的兩對引物分別是第一對引物是用于擴增A型口蹄疫目的基因的引物，其中上游引物5-CATCTA CGA GGC TGT CAA G-3下游引物5-TAGGGT GGA AAC CGA ACT-3第二對引物是用于擴增C型口蹄疫目的基因的引物，其中上游引物5-GAACTA CGG AGG CGA GAC G-3下游引物5-TGGTGC GGT GTA TGG GAG-3第三對引物是用于擴增0型口蹄疫目的基因的引物，其中上游引物5-GACCATACAGGAGAAGTT-3下游引物5-CCCATCGCAGGTAAAGTG-3 本發明中所使用的其他試劑可以從市場中直接購置。本發明的方法從待檢動物的器官拭子或OP液或血液或病死動物的組織中提取其全基因組RNA，以RNA為模板，以試劑盒中的特異性A、0和C型口蹄疫的引物進行多重RT-PCR，對得到的產物進行電泳，根據電泳圖譜分析被檢動物是否感染有A、0和C型口蹄疫病毒。本發明中從待檢動物的器官拭子或OP液或血液或病死動物的組織，用生理鹽水稀釋或研磨成I : 5的乳懸液，全基因組RNA提取的方法采用Trizol法。本發明較經典的病毒分離、單RT-PCR和血清型分型方法快捷。本發明可以相當方便地一次性鑒定出屬于A、0型以及C型口蹄疫哪一種病毒感染，可以及時快捷的對疫病情況及區域、環境做出及時快捷的反應，以最短的時間做出正確的處理辦法，這對及時撲滅或阻斷傳染病的傳播具有積極的意義。另外，本發明采取的提取全基因組RNA提取的Trizol法具有快速、簡單、成本低和所需試劑少的特點，特別適于小樣品的提取。因此，本發明具有廣泛的市場應用前景。
圖I為本發明與標準樣進行的特異性檢測的電泳圖，從左至右依次為M，DNA分子量標準 DL-2000 (marker 條帶的大小依次為 2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、IOObp)；泳道I為A、0型和C型口蹄疫多重RT-PCR檢測結果；泳道2為0型口蹄疫標準樣品RT-PCR檢測結果；泳道3為C型口蹄疫標準樣品RT-PCR檢測結果；泳道4為A型口蹄疫標準樣品RT-PCR檢測結果；泳道5為陰性對照。圖2為臨床樣品評估的電泳圖。從左至右依次為M，DNA分子量標準DL-2000 (marker 條帶的大小依次為 2000bp、IOOObp、750bp、500bp、250bp、100bp);泳道1 為
建立的A、0和C型口蹄疫多重RT-PCR檢測水泡性口炎病毒的結果；泳道3為建立的A、0和C型口蹄疫多重RT-PCR檢測豬水泡病病毒的結果；泳道4為建立的A、0和C型口蹄疫多重RT-PCR檢測Asial型口蹄疫病毒的結果；泳道5陰性對照；泳道6為建立的A、O和C型口蹄疫多重RT-PCR檢測A、O和C型口蹄疫病毒的結果。
具體實施例方式以下是本發明的實施例及對比檢測情況。實施例〈一〉A、0和C型口蹄疫多重RT-PCR檢測試劑盒的使用方法1A、0和C型口蹄疫的核酸提取 無菌采集待檢動物的器官拭子或OP液或血液或病死動物的組織，制成I : 5的乳懸液，用Trozol法提取其全基因組RNA，以RNA為模板，以試劑盒中的特異性A、0和C型口蹄疫的引物進行多重RT-PCR，對得到的產物進行電泳，根據電泳圖譜分析被檢動物是否感染有A、0和C型口蹄疫病毒。2 多重 RT-PCR 反應本試劑盒參照Genbank登錄的A、0和C型口蹄疫編碼區基因的序列，設計并合成三對引物。引物序列見如下表I:表I本試劑盒涉及多重RT-PCR擴增的引物及片段的大小
靶基因引物名稱引物序列產物長度
A 型 FMDVA 型上游5-CAT CTA CGA GGC TGT CAA G-3518bp
A 型下游5-TAG GGT GGA AAC CGA ACT-3
O 型 FMDVO 型上游5-GACCATACAGGAGAAGTT-3136bp
O 型下游5-CCCATCGCAGGTAAAGTG-3
C 型 FMDVC 上游5- GAA CTA CGG AGG CGA GAC G-3319bp
C 下游5-GAG GGT ATG TGG CGT GGT-3以提取的FMDV的RNA為模板，在50 y L反應體系中加入FMDV的RNA各2 y L，10 u mol/L 的上下游引物各 I. 2 ii L，2. 5mmol/L 的 dNTP 2u L,5U Taq 聚合酶(NipponGene), 10 X緩沖液5 y L，加無菌的雙蒸水至50 y L。PCR反應程序如下94°C，2min，然后是循環程序94°C 30s, 55°C lmin，72°C 50s，36個循環。最后72延伸lOmin。PCR反應在BIOMRTRA擴增儀中進行。實施例〈二 >FMDV多重RT-PCR方法的特異性和敏感性試驗IFMDV多重RT-PCR的敏感性試驗I. 1A、0型和C型FMDV的定量
A、0 型和 C 型 FMDV 提取的病毒 RNAl 2、I 4、I 8、I 16 和 I : 32 分別進
行稀釋。I. 2結果檢測PCR產物反應產物進行瓊脂糖凝膠電泳。然后用溴化乙錠染色，BIO-RAD凝膠成像儀中照相并分析，電泳結果見圖1，從圖中可以看出A、0型和C型FMDV的多重RT-PCR可以特異的檢出病毒目的基因。2. FMDV多重RT-PCR的特異性試驗2. 10型、A型FMDV和豬水泡病病毒的提取和多重RT-PCRT反應分別用經過RT-PCR鑒定過的0型、A型FMDV和豬水泡病病毒中提取的RNA作為A、0和C型口蹄疫的多重PT-PCR的反應模板，以健康豬的血液提取的RNA作為陰性對照模 板。然后程序按照實施例〈一〉中的A、0和C型口蹄疫的多重PT-PCR體系和條件進行反應，反應產物用瓊脂凝膠電泳檢測。 2. 2特異性結果分析0型、A和C型FMDV與豬水泡病病毒、水泡性口炎病毒等病毒的RT-PCR方法交叉反應結果見圖2。圖中1-4道分別是水泡性口炎病毒、Asia I型FMDV、豬水泡病病毒的核酸和健康豬血清的RNA。從圖中可以看見上述三種病毒與A、0和C型口蹄疫的多重PT-PCR方法無交叉反應。健康豬血液中提取的RNA的反應結果也為陰性。上述結果表明本實驗所建立的A、0和C型口蹄疫的多重PT-PCR方法與上述三種在臨床癥狀表現相似的病毒無交叉反應。3A、0和C型口蹄疫的多重PT-PCR臨床樣品檢測3. I臨床樣品的準備共包括137份臨床樣品為單個PCR和ELISA共同診斷為A、0和C型口蹄疫陽性的血清和組織樣品。3. 2多重RT-OCR檢測結果對上述142個A、0和C型口蹄疫陽性的臨床樣品用所建立的多重RT-PCR方法檢測，檢測結果見表2，從表中可以看出，多重RT-RCR方法對142個A、0和C型口蹄疫為陽性的臨床樣品的檢出率為96. 8 %，總體上與單個PCR的檢出率基本相同，尤其檢測0型口蹄疫病毒檢出率與單個PCR相同，檢出率為100%，同時比ELISA檢出率要高5個百分點。4 結論上述試驗證明所建立的A、0和C型口蹄疫的多重PT-PCR方法方法具有敏感性高、特異性強、快速、實驗設備簡單和操作容易等特點，適合于實驗室和臨床對A、0和C型口蹄疫的快速診斷。表2多重PCR檢測方法的敏感性比較
權利要求
1.一種用于檢測A、0和C型口蹄疫病毒的試劑盒，其特征是試劑盒至少有三對引物組成，其中的三對引物分別是 第一對引物是用于擴增A型口蹄疫目的基因的引物，其中 上游引物5-CAT CTA CGA GGC TGT CAA G-3 下游引物5-TAG GGT GGA AAC CGA ACT-3 第二對引物是用于擴增C型口蹄疫目的基因的引物，其中 上游引物5-GAA CTA CGG AGG CGA GAC G-3 下游引物5-TGG TGC GGT GTA TGG GAG-3 第三對引物是用于擴增O型口蹄疫目的基因的引物，其中 上游引物5-GACCATACAGGAGAAGTT-3 下游引物5-CCCATCGCAGGTAAAGTG-3。
全文摘要
本發明公開一種檢測牛和豬以及相關牛和豬的產品是否感染A、O或C型口蹄疫病毒的試劑盒，以及這種試劑盒的使用方法。本發明的試劑盒中至少有三對用于擴增A型口蹄疫目的基因的引物、擴增C型口蹄疫目的基因的引物和用于擴增O型口蹄疫目的基因的引物組成。
文檔編號C12Q1/70GK102703607SQ20121015697
公開日2012年10月3日 申請日期2012年5月18日 優先權日2012年5月18日
發明者丁耀忠, 劉永生, 周建華, 張 杰, 陳豪泰, 馬麗娜 申請人:中國農業科學院蘭州獸醫研究所