專利名稱：PTD-Apoptin融合蛋白原核分泌表達的構建方法及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于微生物領域,具體地涉及一種PTD-Apoptin融合蛋白分泌表達系統的構建及其應用。
背景技術：
現今，腫瘤的治療仍是一項難題。因此，尋找并制備出對腫瘤細胞選擇性強、 作用性強的制劑是目前腫瘤治療藥物的研究方向。從雞貧血病毒中分離出的νρ 3基因 (Apoptin)可誘導人腫瘤細胞或轉化細胞等非正常細胞的凋亡作用，而對正常的二倍體細胞無作用。Apoptin誘導腫瘤細胞的凋亡不需要腫瘤抑制基因ρ53的表達，且不受凋亡因子 Bcl-2的抑制作用，顯示出了 Apoptin作為一種抗腫瘤制劑的應用前景。為了使Apoptin有效地進入腫瘤細胞，需要構建具有穿膜能力的藥物分子。利用原核表達體系可獲得大量蛋白分子。然而，原核表達體系的胞質表達多以包涵體形式存在， 包涵體屬變性蛋白，一般不具有活性，需要復性才能恢復活性，但是包涵體復性效率低，對于需求量大的蛋白往往達不到要求，而且包涵體復性時只有極少數蛋白折疊為天然狀態， 限制其活性。因此，避開包涵體復性過程，實現蛋白以有活性的可溶狀態表達，并大量分泌到雜蛋白種類和含量都少的大腸桿菌周質空間中，這是現在亟待解決的問題。
發明內容
本發明的目的是構建具有誘導腫瘤細胞凋亡并可以穿過細胞膜的融合蛋白 PTD-Apoptin,表達時以可溶狀態分泌到大腸桿菌的周質空間中，保留了穿膜功能和特異性誘導腫瘤細胞凋亡功能，無需復性，且融合蛋白分泌到周質空間后，融合蛋白含量占周質空間總蛋白的80%。本發明采用的技術方案是=PTD-Apoptin融合蛋白的構建方法如下
1)人工合成兩端帶有及聖7I和及^7 I粘性末端的PTD序列的正、負鏈，將正鏈和負鏈混合，制備成5’端帶有I、3’端帶有I粘性末端的PTD雙鏈序列；
2)將得到的PTD雙鏈序列插入到分泌表達質粒pET22b(+)飽BamHI /EcoR I位點，構建出表達PTD的分泌表達質粒pET22b (+) -PTD ；
3)擴增Apoptin序列；
4)將Apoptin序列用I和I限制性內切酶酶切，酶切產物用凝膠回收試劑盒回收，將回收后的酶切片段插入到分泌表達質粒pET22b(+)-PTD的及^7 I /Sal I位點，構建出表達融合蛋白PTD-Apoptin的分泌表達質粒pET22b (+)-PTD-Apoptin ；
5)將分泌表達質粒pET22b(+) -PTD-Apoptin轉入大腸桿菌BL21感受態細胞中，得到重組大腸桿菌；
6)將重組大腸桿菌接種于LB培養基中，搖瓶培養過夜，再將培養后的菌液以5%接種量接種于2 X YT培養基中進行搖瓶擴大培養，當菌液吸光度值達到O. 6時，在20°C條件下用
I.2 mM IPTG誘導10h，之后4°C 6000rpm離心IOmin收集菌體細胞；7)將收集的菌體細胞重懸于含有20%的蔗糖、pH為8、濃度為30mM的30mLTris-HCl 中，加入PH為8，濃度為O. 5M的EDTA至EDTA終濃度為1禮，加入磁力攪拌棒，室溫下緩慢攪拌IOmin ；4°C 6000rpm離心10 min收集細胞,去除上清液；
8)將收集的細胞重懸于30mL冰凍的濃度為5mM的MgSO4中，緩慢攪拌懸液IOmin ； 4°C 6000rpm離心10 min收集上清，即為PTD-Apoptin融合蛋白。按上述的方法獲得的PTD-Apoptin融合蛋白在制備治療抗腫瘤藥物中的應用。本發明的有益效果是①本發明采用人類免疫缺陷病毒(HIV-I)的蛋白轉導結構域(PTD)與Apoptin融合,有助于Apoptin跨膜進入腫瘤細胞。②本發明中，周質、上清和沉淀中有大量的目的蛋白表達，由于大腸桿菌周質空間中的雜蛋白含量少，目的蛋白含量大，有利于下游的分離純化。本發明優化了表達條件，避開了包涵體復性過程，使目的蛋白以可溶狀態大量分泌到大腸桿菌周質空間中。③本發明將PTD-Apoptin序列連接到含有信號肽序列的pET22b (+)載體上，構建原核分泌表達載體pET22b (+) -PTD-Apoptin,經 IPTG誘導，將表達的目的蛋白分泌到大腸桿菌周質空間中，滲透法提取周質空間蛋白，剩余細胞組分經超聲破碎后，分離上清和沉淀，進行SDS-PAGE分析。將周質空間中PTD-Apoptin 融合蛋白與胃癌823細胞共、孵育，MTT法檢測融合蛋白對胃癌823細胞的抑制作用。結果顯示，重組PTD-Apoptin蛋白可以分泌至大腸桿菌周質空間中，且以可溶狀態存在，對胃癌 823細胞的最大抑制率為82. 95%。分泌表達的重組PTD-Apoptin蛋白具有生物活性。本發明所構建的具有誘導腫瘤細胞凋亡的可以穿過細胞膜的融合蛋白，表達時以可溶狀態分泌到大腸桿菌的周質空間中，保留了穿膜功能和特異性誘導腫瘤細胞凋亡功能，無需復性，且融合蛋白分泌到周質空間后，融合蛋白含量占周質空間總蛋白的80%，雜蛋白含量極少。
圖I是分泌表達質粒pET22b (+) -PTD的構建過程示意圖。圖2是分泌表達質粒pET22b(+)-PTD-Apoptin的構建過程示意圖。圖3是PTD雙鏈電泳圖中，M DL2000 Marker ；1 PTD 雙鏈。圖4是pET22b (+) -PTD質粒電泳圖中，M :DL10000 Marker ；1 :pET22b (+)-PTD 質粒；2 :pET22b (+)-PTD 質粒。圖5是Apoptin基因PCR產物電泳圖中，M DL2000 Marker ；1 :對照組；2 :擴增產物。圖6是pET22b (+) -PTD-Apoptin重組質粒PCR驗證電泳圖中，M DL2000 Marker ；1 :重組質粒PCR擴增產物；2 :對照組。圖7是pET22b(+)-PTD-Apoptin重組質粒酶切鑒定電泳圖中，M DL10000 Marker ；1 :重組質粒酶切產物；2 :重組質粒酶切產物。圖8 是 PTD-Apoptin 表達的 SDS-PAGE 檢測；
圖中，I :pET22b(+)-PTD-Apoptin 未誘導對照組上清；2 :pET22b (+)-PTD-Apoptin 未誘導對照組沉淀；3 :蛋白分子量標準；4 pET22b (+) -PTD-Apoptin:誘導時間為IOh的周質； 5 :pET22b(+)-PTD-Apoptin 誘導時間為 IOh 的上清；6 :pET22b (+)-PTD-Apoptin 誘導時間為IOh的沉淀。圖9是48h時不同濃度PTD-Apoptin融合蛋白對胃癌823細胞的抑制作用。
具體實施例方式實施例I PTD-Apoptin融合蛋白的構建與分泌表達方法 (一)材料與方法
1、材料T4DNA連接酶、限制性內切酶及麗YI ,EcoR I和I、質粒小量提取試劑盒、凝膠回收試劑盒均為TaKaRa公司產品；IPTG (異丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷)、MTT (噻唑藍)、DMSO (二甲基亞砜)購自SIGMA。2、方法
2.I PTD序列制備
根據弓I物設計的方法人工合成PTD序列，在PTD序列正鏈5 ’端引入酶切位點BamH I 的部分識別位點，3’端引入I的部分識別位點；在PTD序列負鏈5’端引入酶切位點 EcoR I的部分識別位點，3’端引入I的部分識別位點。退火形成鏈條鏈后，所引入的限制性內切酶識別位點會形成粘性末端。將人工合成的含有及 # I和I粘性末端的正鏈和負鏈混合，95°C 5min，然后自然降溫至室溫，使正負兩條鏈退火結合，制備成PTD雙鏈序列。2. 2 pET22b (+) -PTD 的構建
將原核分泌表達載體pET22b(+)分別用及_7 I和及^7 I限制性內切酶進行分步酶切，酶切產物用凝膠回收試劑盒回收，將回收后的酶切片段與人工合成的PTD序列16°C連接過夜，構建質粒pET22b (+) -PTD。2. 3 Apoptin 基因的 PCR 擴增
根據Apoptin基因的核苷酸序列設計2條引物。上、下游引物的5’端分別引入酶切位自、EcoR I ,Sal I和保護堿基。
上游引物為5’ -CGGAATTCGATGAACGCTCTCC-3’
下游引物為 5’ -GCGTCGACTTACAGTCTPTDACGCCTT-3，
以質粒pET30a-Apoptin為模板進行PCR擴增得到Apoptin全序列。PCR擴增條件為 940C 5min 預變性，94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 3min，共 30 個循環，72°C延伸 10 分鐘。2.4 PTD-Apoptin原核分泌表達載體的構建
將原核分泌表達載體pET22b(+)-PTD分別用及^7 I和I限制性內切酶進行分步酶切，酶切產物用凝膠回收試劑盒回收，將回收后的酶切片段與Apoptin基因16°C連接過夜，構建重組質粒pET22b(+)-PTD-Apoptin。取連接產物轉化疋coli DH5 α菌株，挑取陽性克隆搖瓶培養，保存菌種并提取重組質粒進行PCR驗證與及麗Y I ,Sal I酶切驗證。將PCR 與酶切驗證正確的陽性質粒送上海生工生物公司進行核酸序列測定。2.5 PTD-Apoptin融合基因的原核分泌表達誘導與鑒定
將測序正確的原核分泌表達質粒pET22b(+)-PTD-Apoptin轉化疋coli BL21 (DE3)菌株，將陽性分泌表達菌株接種于含Amp的LB的液體培養基中，37°C培養過夜；將培養后的菌液以5%的接種量接種于含Amp的2XYT的液體培養基中，37°C培養至OD6tltl為O. 6，加IPTG 至終濃度為I. 2mM，20°C誘導培養10h。在同等條件下以未誘導pET22b (+)-PTD-Apoptin做對照。6000rpm離心lOmin，收集菌體細胞。2.6周質組分蛋白提取
將收集的菌體細胞重懸于含有20%的蔗糖、pH為8、濃度為30mM的30mL Tris-HCl中， 加入pH為8，濃度為O. 5M的EDTA至EDTA終濃度為ImM，加入磁力攪拌棒，室溫下緩慢攪拌IOmin ；4°C 6000rpm離心10 min收集細胞，去除上清液。將收集的細胞重懸于3OmL冰凍的濃度為5 mM的MgSO4中，緩慢攪拌懸液IOmin ;4°C 6000rpm離心10 min收集上清，SP 為PTD-Apoptin融合蛋白。2. 7 MTT法檢測胃癌細胞的凋亡率
將對數生長期的胃癌823細胞接種于96孔細胞培養板，每孔接種約5 X IO3細胞O. ImL, 37°C、5% CO2培養箱中培養6 12小時。細胞貼壁后且鋪板率約70°/Γ80%時，分別加入含有 PTD-Apoptin蛋白濃度為9. 375 μ g/mL和11. 25 μ g/mL的樣品，每一濃度設3個平行組，空白對照組加入等體積的培養液，于37°C、5% CO2培養箱中培養48小時。每孔加入5mg/mL 的MTT ΙΟμ ，在37°C、5% CO2培養箱中孵育3h，孵育結束后吸出上清，然后每孔加入ΙΟΟμ DMSO (二甲基亞砜)5 lOmin，溶解紫色結晶，用酶標儀測定490nm處吸光值。計算細胞抑制率，并以蛋白不同濃度和細胞抑制率作圖。細胞抑制率=1 —[(實驗組OD平均值-背景組OD平均值)/ (空白對照組OD平均值-背景組OD平均值)]X 100%。(二)結果 I. PTD序列制備
將人工合成的含有及 # I和及^7 I粘性末端的正負鏈混合，95°C 5min，然后自然降溫至室溫，使正負兩條鏈退火結合，結果見圖3，由圖3可以看出，在IOObp以下約30bp處有目的條帶，說明PTD雙鏈合成成功。2. pET22b(+)-PTD 的構建
將原核分泌表達載體pET22b(+)分別用及_7 I和及^7 I限制性內切酶進行分步酶切，酶切產物用凝膠回收試劑盒回收，將回收后的酶切片段與人工合成的PTD序列16°C連接過夜，構建質粒pET22b(+)-PTD，結果見圖4，由圖4可見，在4000bp附近出現條帶，說明 pET22b (+) -PTD 構建成功。3. Apoptin基因的猶得
以質粒pET30a-Aptptin為模板進行PCR擴增，結果見圖5，從圖5可見，目的條帶 Apoptin小片段出現在250-500bp之間，而對照組無目的條帶出現，說明PCR擴增成功得到 Apoptin 基因。4. PTD-Apoptin原核分泌表達載體的驗證
將回收后的PCR產物與原核分泌表達載體pET22b(+)分別用及 " I和fel I限制性內切酶進行酶切，將回收的酶切片段連接，構建重組質粒pET22b (+) -PTD-Apoptin,連接產物轉化大腸桿菌；挑取陽性克隆擴大培養，提取重組質粒進行PCR與酶切驗證，結果見圖6和圖7。從圖6和圖7可見，在250-500bp之間出現目的條帶，說明原核分泌表達載體 pET22b (+) -PTD-Apoptin 構建成功。5. PTD-Apoptin 融合基因在 E. coli BL21 (DE3)菌株中的表達
將測序結果正確的原核分泌表達質粒pET22b (+) -PTD-Apoptin轉入大腸桿菌BL21(DE3)中，以終濃度為1.2mM IPTG誘導表達，20°C誘導10h，在同等條件下以未誘導 pET22b (+) -PTD-Apoptin做對照。離心，收集菌體，獲得周質組分，超聲破碎剩余組分，對表達產物進行SDS-PAGE檢測。結果見圖8。由圖8可見，周質、上清和沉淀在20KDa處有條帶，符合預期分子量，對照組在預期分子量處無條帶，說明融合蛋白成功表達并分泌至大腸桿菌周質空間中。6. MTT法檢測胃癌823細胞的抑制率
加入PTD-Apoptin融合蛋白孵育24h后，通過熒光顯微鏡觀察，與對照組相比，細胞數量明顯減少，說明加入融合蛋白對細胞增長有抑制作用。繼續孵育至48h后觀察發現細胞發生皺縮，加入MTT后孵育3h，DMSO溶解紫色結晶，用酶標儀測定0D·，分析數據后得出 隨著加入融合蛋白濃度的升高，細胞存活率越低。孵育48h后IC5tl約為279Pg/mL。與對照組相比，不同濃度的融合蛋白對胃癌細胞均有顯著的抑制作用0° < O. 01)。胃癌細胞與融合蛋白孵育48h后，最大抑制率為82. 95%，結果見表I和圖9。表I 48h時不同濃度PTD-Apoptin融合蛋白對胃癌823細胞的抑制作用
權利要求
1.PTD-Apoptin融合蛋白的構建方法，其特征在于方法如下 1)人工合成兩端帶有及聖7I和及^7 I粘性末端的PTD序列的正、負鏈，將正鏈和負鏈混合，制備成5’端帶有I、3’端帶有I粘性末端的PTD雙鏈序列； 2)將得到的PTD雙鏈序列插入到分泌表達質粒pET22b(+)飽BamHI /EcoR I位點，構建出表達PTD的分泌表達質粒pET22b (+) -PTD ； 3)擴增Apoptin序列； 4)將Apoptin序列用I和I限制性內切酶酶切，酶切產物用凝膠回收試劑盒回收，將回收后的酶切片段插入到分泌表達質粒pET22b(+)-PTD的及^7 I /Sal I位點，構建出表達融合蛋白PTD-Apoptin的分泌表達質粒pET22b (+)-PTD-Apoptin ； 5)將分泌表達質粒pET22b(+) -PTD-Apoptin轉入大腸桿菌BL21感受態細胞中，得到重組大腸桿菌； 6)將重組大腸桿菌接種于LB培養基中，搖瓶培養過夜，再將培養后的菌液以5%接種量接種于2 X YT培養基中進行搖瓶擴大培養，當菌液吸光度值達到O. 6時，在20°C條件下用I.2 mM IPTG誘導10h，之后4°C 6000rpm離心lOmin，收集菌體細胞； 7)將收集的菌體細胞重懸于含有20%的蔗糖、pH為8、濃度為30mM的30mLTris-HCl中，加入PH為8，濃度為O. 5M的EDTA至EDTA終濃度為1禮，加入磁力攪拌棒，室溫下緩慢攪拌IOmin ；4°C 6000rpm離心10 min收集細胞,去除上清液； 8)將收集的細胞重懸于30mL冰凍的濃度為5mM的MgSO4中，緩慢攪拌懸液IOmin ；4°C 6000rpm離心10 min收集上清，即為PTD-Apoptin融合蛋白。
2.按照權利要求I所述的方法獲得的PTD-Apoptin融合蛋白在制備治療抗腫瘤藥物中的應用。
全文摘要
本發明涉及PTD-Apoptin融合蛋白的分泌表達載體的構建方法及其應用。將PTD-Apoptin序列連接到pET22b(+)分泌表達載體上，構建原核分泌表達載體pET22b(+)-PTD-Apoptin，經IPTG誘導，將表達的目的蛋白分泌到大腸桿菌周質空間中，滲透法提取周質空間蛋白，剩余細胞組分經超聲破碎后，分離上清和沉淀，進行SDS-PAGE分析。將周質空間中PTD-Apoptin融合蛋白與胃癌823細胞共孵育，MTT法檢測融合蛋白對胃癌823細胞的抑制作用。采用本發明的方法重組PTD-Apoptin蛋白可以分泌至大腸桿菌周質空間中，且以可溶狀態存在，分泌表達的重組PTD-Apoptin蛋白具有生物活性，對胃癌823細胞的最大抑制率為82.95%。
文檔編號C12N15/70GK102703489SQ201210158339
公開日2012年10月3日 申請日期2012年5月22日 優先權日2012年5月22日
發明者劉雪梅, 崔劍, 李其久, 賁松彬, 陳長蘭 申請人:遼寧大學