專利名稱：有效抑制流感病毒聚合酶活性的多肽的制作方法
技術領域：
本發明涉及能夠有效抑制流感病毒聚合酶活性的多肽。
背景技術：
流感病毒毎年都能造成大量的人員的死亡，最近發生的HlNl的全球流行對人類社會的生命及經濟財產造成了很大的損失，所以有效的抑制流感病毒的傳播對促進和保護人類的文明意義重大。現在使用的有效的流感藥物有Amantadine(金剛燒胺)、Oseltamivir (奧司他,)、Zanamivir (扎那米,)等，分別針對流感病毒的離子通道蛋白(M2)，及表面蛋白(NA) (2)。但是這些小分子藥物也存在一些問題，如抗性病毒的出現。所以，我們需要更多的手段來抑制流感病毒的傳播。流感病毒聚合酶是由3個蛋白(PB2、PBU PA)組成的異源三聚體復合物，是負責 流感病毒復制和轉錄的重要復合物(1，16，19)。病毒侵染細胞后，會利用宿主細胞的蛋白合成系統來合成自身的蛋白，包括新合成的PB2、PBl及PA蛋白。新合成的蛋白PBl和PA在細胞質內組裝成ニ聚體，再在核內和PB2組裝成具有完整功能的三聚體來行使轉錄和復制的功能(4)。流感病毒聚合酶在體內行使功能還需要NP蛋白的參與，NP主要參與RNA的結合，及與PB2，宿主因子的相互作用(12，13，16)。隨著對流感病毒聚合酶結構和功能認識的不斷深入，現在流感病毒聚合酶成為人們研制流感藥物的新的有效的靶點(2，6，17，20)。PA和PBl的組裝主要是由PA的C端和PBl的N端的1_25位氨基酸(下文中稱為PBk25,本文中對流感病毒聚合酶亞基的片段采用于此相似的命名方式)來參與的，該復合物的晶體結構已被解析(9，14);而PBl和PB2的組裝主要是由PBl的676-757位氨基酸(下文中稱為PBlc)和PB2的1-40位氨基酸(下文中稱為PB2n)來介導的，并有相關的晶體結構解析出來(15，18);上述兩個復合物的晶體結構都是非常好的多肽或小分子藥物的靶標。在進化上，流感病毒聚合酶結構和功能都非常的保守，針對流感病毒聚合酶的藥物相對于針對表面蛋白的藥物來講具有更好的廣譜性和耐藥性出，20)。對流感病毒聚合酶的功能研究用的最多的是流感病毒聚合酶的微型復制系統(minireplicon system),即在細胞中表達流感病毒聚合酶行使功能所需要的4個蛋白PB2、PBl、PA和NP，另外再表達ー個RNA報告基因，報告基因反向互補克隆在流感病毒保守的基因組RNA(vRNA)啟動子的5’端和3’端之間，報告基因最初會被細胞內的RNA聚合酶I復合物轉錄出ー個5’和3’端帶有流感病毒的啟動子的RNA(報告基因是反向互補的)，然后細胞內表達的流感病毒聚合酶會識別該啟動子RNA，從而復制出報告基因為正向克隆的mRNA，從而在細胞中翻譯出報告基因的蛋白產物(5)。簡單的講細胞中轉染表達RNA報告基因的載體后，只要細胞中有足夠的流感病毒聚合酶或流感病毒，就能在細胞中檢測到報告基因的表達(5，6，22)，這也是用來研究針對流感病毒聚合酶的藥物的很好的系統，當藥物能有效抑制流感病毒聚合酶活性的時候，報告基因的表達量就會低，反之會高。之前的研究發現PBV25能有效的抑制流感病毒的復制。該片段主要是通過阻斷PA和PBl的組裝來抑制流感病毒聚合酶的活性從而抑制了流感病毒的復制，這個片段及其應用已經申請專利(專利號PCT/EP2009/055632) (20)。由此也已看出，多肽藥物在流感病毒的防治尤其是高致病性流感病毒的防治領域具有廣闊的應用前景。
發明內容
基于對PBl和PB2組裝過程的認識，即PBl和PB2的組裝主要是由PBlc和PB2n來介導的，并參考PBlc與PB2n的復合物的晶 體結構(PDBID 2ZTT)，我們推測PBl的C端的731-757位氨基酸(下文中稱為PB1731_757，其氨基酸序列如SEQ ID NO. I所示)可能參與PBl和PB2組裝。細胞學實驗表明PB1731_757對流感病毒聚合酶的活性具有很好的抑制效果。病毒學實驗表明PBl731_75Ji流感病毒的復制具有很好的抑制效果。并且發現PB1731_757與已報道的對流感病毒聚合酶有抑制效果的片段PBV25 (其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示)在抑制病毒復制方面效果相當。因此，本發明的多肽PB1731_757作為ー種能夠有效抑制流感病毒的多肽藥物具有非常好的實用價值和應用前景。更具體地，本發明提供以下各項I. 一種用于抑制流感病毒聚合酶活性的多肽，它的氨基酸序列包含流感病毒聚合酶亞基PBl 731-757位的氨基酸(SEQ ID NO 1) 2.核苷酸序列，其編碼根據I的多肽。3.包含根據2的核苷酸序列的表達載體。4.包含根據3的表達載體的細胞。5. ー種使用根據I的多肽來抑制流感病毒聚合酶活性的方法，所述方法包括將根據3的載體提前轉染到之后會被病毒感染的人細胞中。6.根據I的多肽、根據2的核苷酸序列、根據3的表達載體或根據4的細胞在制備用于抑制流感病毒聚合酶活性的藥物中的應用。下面結合具體實施例對本發明作進ー步說明。
圖I. PBl731^757的相互作用對象及強度；圖2.多肽片段PB1731_757對流感病毒WSN33聚合酶活性的抑制效果(圖2A)以及對病毒WSN33復制的抑制效果(圖2B)。
具體實施例方式實施例I、片段PB1731_757的選擇依據PBlc和PB2n的晶體結構(PDB ID 2ZTT) (18)可以看出PBlc的第3個α螺旋與PBlc的第2個α螺旋和ΡΒ2η都非常靠近，很多殘基的側鏈有直接的相互作用。現有文獻中未曾提及PBlc的第3個α螺旋是否能単獨直接參與和PBlc或ΡΒ2η的相互作用，以及這個區域在PBlc和ΡΒ2η的組裝中有什么功能也不清楚。我們認為PBlc的第3個α螺旋可能與PBlc的第2個α螺旋或ΡΒ2η能相互作用。因此我們選取PBlc上第3個α螺旋(ΡΒ1736_755)并在N端和C端各延長了 5個和2個氨基酸，以保持α螺旋結構的穩定性，即以ΡΒ1731_757作為檢測對象，看該片段能否和PBlc或ΡΒ2η相互作用，及在體內過表達后看能否抑制流感病毒聚合酶的活性。
實施例2、檢測PB1731_757與PBlc或PB2n的相互作用用BiFc (雙分子熒光互補測定)的方法檢測PB1731_757與PBlc或PB2n的相互作用。BiFc的原理為將熒光蛋白在某些特定的位點切開，形成不發熒光的N和C端2個多肽，稱為N片段(N-fragment)和C片段(C-fragment)。這2個片段在細胞內共表達或體外混合時，不能自發地組裝成完整的熒光蛋白，在該熒光蛋白的激發光激發時不能產生熒光。但是，當這2個熒光蛋白的片段分別連接到I組有相互作用的目標蛋白上，在細胞內共表達或體外混合這2個融合蛋白時，由于目標蛋白質的相互作用，熒光蛋白的2個片段在空間上互相靠近互補，重新構建成完整的具有活性的熒光蛋白分子，并在該熒光蛋白的激發光激發下，發射熒光。簡言之，如果目標蛋白質之間有相互作用，則在激發光的激發下，產生該熒光蛋白的熒光。反之，若蛋白質之間沒有相互作用，則不能被激發產生相應的熒光蛋白的熒光(10，11，21)。在本實驗中，我們將YFP蛋白(黃色熒光蛋白)在154位點處分割為N端(1_154) 和C端(155-238)，克隆到載體pBiFCl和pBiFc3上(21)，引物如下表1，所構建的載體分別記為PYF-YN155和pYF-YC155，該質粒表達的片段分別簡記為YN和YC ;設計引物(見表I)，將編碼PB1731_757的核酸序列(SEQ ID NO. 3)、編碼PBlc和PB2n的核酸序列分別從模板pBD-PBl和pBD-PB2(來自于1996年在廣東的鵝體內分離的A型高致病性禽流感H5N1的基因，毒株名稱為A/Goose/Guangdong/l/96 (H5N1),關于質粒的來源參見文獻(9)和(18))中擴增出來，將PBlc和PB2n分別克隆到pYF_YN155上編碼YN片段的核酸序列的下游，表達的融合蛋白分別記為YN-PBlc和YN-PB2n，將PB1731_757構建在pYF_YC155上編碼YC片段的核酸序列的下游，表達的融合蛋白記為YC_PB1731_757，引物見表I ;載體的啟動子為GalI啟動子，該啟動子在有半乳糖誘導時會使下游基因表達，而在含有棉子糖的培養基中下游基因不會表達。表I分子生物學實驗所用酶切位點和引物
權利要求
1.一種用于抑制流感病毒聚合酶活性的多肽，它的氨基酸序列包含流感病毒聚合酶亞基 PBl 731-757 位的氨基酸(SEQ ID NO 1)
2.核苷酸序列，其編碼根據權利要求I所述的多肽。
3.包含根據權利要求2所述的核苷酸序列的表達載體。
4.包含根據權利要求3所述的表達載體的細胞。
5.ー種使用根據權利要求I所述的多肽來抑制流感病毒聚合酶活性的方法，所述方法包括將根據權利要求3所述的載體提前轉染到之后會被病毒感染的人細胞中。
6.根據權利要求I所述的多肽、根據權利要求2所述的核苷酸序列、根據權利要求3所述的表達載體或根據權利要求4所述的細胞在制備用于抑制流感病毒聚合酶活性的藥物中的應用。
全文摘要
提供了一種用于抑制流感病毒聚合酶活性的多肽，它的氨基酸序列包括流感病毒聚合酶亞基PB1 731-757位的氨基酸。
文檔編號C12N15/63GK102690335SQ20121015801
公開日2012年9月26日 申請日期2012年5月21日 優先權日2012年5月21日
發明者吳愛平, 張紅, 李春峰, 蔣太交 申請人:中國科學院生物物理研究所