一種生產二元酸的菌株及其發酵方法

專利名稱：一種生產二元酸的菌株及其發酵方法
一種生產二元酸的菌株及其發酵方法技術領域
本發明屬于微生物發酵領域，具體地說，是關于一種生產二元酸的菌株及其發酵方法。
背景技術：
長鏈二元酸(LCDA ;也稱為長鏈二羧酸和長鏈二酸)包括化學式HOOC(CH2)nCOOH的二元酸，其中η > 7。長鏈二元酸可以用來生產各種產品和中間品，例如生產聚酰胺，也稱尼龍，用于電纜的皮層和牙刷絲；用于生產的共聚酰胺粘合劑和聚酯膠黏劑和高性能涂料； 用于制造汽車輪轂的GMA粉末涂料交聯劑；用于在金屬加工業和工業冷卻系統中使用的防銹劑；用于制造合成潤滑油，例如汽車潤滑油；用于制造各種的個人護理產品以及家庭用品，例如香水和家用清潔劑。
本領域存在多種長鏈二元酸的化學合成方法，但使用化學方法工藝復雜且大部分得到的是長鏈二元酸與短鏈二元酸的混合物。因此，用這些方法生產長鏈二元酸時需要進一步純化步驟。本領域熟知有幾種酵母菌在以烷烴或脂肪酸作為碳源時可以生產長鏈二元酸。酵母對烷烴和脂肪酸進行新陳代謝時有三個生物化學過程烷烴至脂肪酸的alpha氧化，脂肪酸至alpha-, omega- 二元酸的omega氧化以及脂肪酸至CO2和水的降解型beta-氧化。
相對于非生物轉化方法，生產二元酸的生物轉化方法具有多種潛在優勢。其中主要在于使用可再生的原料作為起始材料以及生產二元酸過程中不產生有害化學副產物的能力。使用生物方法的另一重要優勢在于這種方法可容易地調節以利用相同生物催化劑和相同設備生產多種二元酸。因為現有化學合成法合成僅適于生產單種二元酸，不同二元酸合成將需要針對各二元酸開發新的合成方案。另一方面，酵母生物催化劑可以利用相同設備、培養基和步驟生產各種長度的二元酸，不同之處僅在于給酵母提供不同碳原子長度的底物。
雖然可以利用各種技術來提高現有的酵母例如熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)發酵二元酸的產量，但還可以通過提供新的假絲酵母菌株以生產更高產量的長鏈二元酸，包括十二碳二元酸、十三碳二元酸、十四碳二元酸、十五碳二元酸和十六碳二元酸。發明內容
本發明的一個目的是提供新的菌株和利用這些菌株生產一種或多種長鏈二元酸的方法。使用該高轉化率的假絲酵母來生產長鏈二元酸可以完全取代多步合成的化學法， 而且產量高，能耗低，起始原材料可以不采用石化原材料，雖然該材料也可用于本發明中。
本發明提供了一株新的清酒假絲酵母菌CAT H430,以及使用CAT H430生產二元酸的方法。
在本發明的一些實施例中，CAT H430在標準的500mL搖瓶中、按照下面所述的發酵條件下，可以產生至少100g/L的十二碳二元酸。在本發明的另一些實施例中，CAT H430 在標準的IOL發酵罐中、按照下面所述的發酵條件下，可以產生至少100g/L的十二碳二元酸，且達到90%以上的重量轉化率(w/w，烷烴轉換為二元酸的重量百分比)。在本發明的其他一些實施例中，CAT H430在標準的200M3發酵罐中、按照下面所述的發酵條件下，可以產生至少100g/L的十二碳二元酸，且達到90%以上的重量轉化率(w/w，烷烴轉換為二元酸的重量百分比)。在本發明的一些實施例中，CAT H430可以生產的二元酸的化學式為 H00C (CH2)nCOOH,其中η彡2。在本發明的一些實施例中，二元酸可以是丁二酸、戊二酸、己二酸、庚二酸、辛二酸、壬二酸、癸二酸、i^一碳二元酸、十二碳二元酸、十三碳二元酸、十四碳二元酸、十五碳二元酸、十六碳二元酸、十七碳二元酸、十八碳二元酸，或其組合物。
在本發明的一些實施例中，提供了用于生產二元酸的方法，所述方法包括以下步驟
a)、在含有至少一種氮源和至少一種有機底物的培養基中培養清酒假絲酵母CAT H430 ;和b)、從步驟a)中得到的培養液中回收二元酸。
在本發明的一些實施例中，所述的至少一種有機底物，從如下物質中選擇具有4 到22個碳原子的烷烴，具有4到22個碳原子的羧酸(例如具有10到22個碳原子的脂肪酸)，具有I到12個碳原子的醇與具有10到22個碳原子的脂肪酸經酯化反應得到的脂肪酸烷基酯。在本發明的一些實施例中，所述的二元酸可以是丁二酸、戊二酸、己二酸、庚二酸、 辛二酸、壬二酸、癸二酸、i^一碳二元酸，十二碳二元酸、十三碳二元酸、十四碳二元酸、十五碳二元酸、十六碳二元酸、十七碳二元酸、十八碳二元酸，或其組合物。
本發明的其他目的和優勢可以在下文展現，也有可能在實施過程中得到展現。本發明的目的和優勢通過技術特征及其結合得到，特別能從權利要求中體現這點。
應理解，上文的總體描述和下文的具體描述僅僅是對本發明的解釋和示范，不應被認為是對本發明的限制。



圖1為清酒假絲酵母CAT H430的篩選流程圖。
具體實施方式
生物保藏信息
清酒假絲酵母CAT H430 (Candida sake CAT H430)根據《布達佩斯協議》于2011 年12月29日保藏在中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，地址中國武漢，武漢大學，保藏編號為 M2011489。
長鏈二元酸(LCDA ;也稱為長鏈二羧酸和長鏈二酸)包括化學式HOOC(CH2)nCOOH 的二元酸，其中η彡7。LCDA的例子包括i^一碳二元酸(H00C(CH2)9C00H，1，9-九碳二羧酸或1，11-1^一碳二元酸，本發明中標記為“DC11”)，十二碳二元酸(H00C(CH2)ltlCOOH, 1，10-十碳二羧酸或1，12-十二碳二元酸，本發明中標記為“DC12”)，十三碳二元酸 (H00C(CH2)nC00H,l, 11-^^一碳二羧酸或I, 13-十三碳二元酸，本發明中標記為“DC13”)， 十四碳二元酸(HOOC(CH2) 12C00H，1，12-十二碳二羧酸或1，14-十四碳二元酸，本發明中標記為“DC14”)，十五碳二元酸(HOOC(CH2) 13C00H，1，13-十三碳二羧酸或I, 15-十五碳二元酸，本發明中標記為“DC15”)，十六碳二元酸(H00C(CH2)14COOH, I，14-十四碳二羧酸或1，16-十六碳二元酸，本發明中標記為“DC16”)，十七碳二元酸(H00C(CH2)15COOH, 1，15-十五碳二羧酸或1，17-十七碳二元酸，本發明中標記為“DC17”)，十八碳二元酸 (H00C(CH2)16C00H,1, 16-十六碳二羧酸或1，18-十八碳二元酸，本發明中標記為“DC18”)。
清酒假絲酵母CAT H430在不同的發酵過程中可以產生各種二元酸，尤其是長鏈二元酸。在本發明的一些實施例中，長鏈二元酸生產過程是在含有至少一種氮源和至少一種有機底物的培養基中培養清酒假絲酵母CAT H430。在本發明的一些實施例中，所述的至少一種有機底物可以是具有4到22個碳原子的烷烴，具有4到22個碳原子的羧酸(例如具有10至22個碳原子的脂肪酸)，具有從I到12個碳原子的醇與具有10到22個碳原子的脂肪酸經酯化反應得到的脂肪酸烷基酯。
本發明所述的菌株CAT H430是從山東省濱州市郊區勝利油田采集的樣品中分離得到的。首先，將所采集得到的所有樣品用O. 7%NaCl溶液稀釋1000倍；稀釋得到的樣品經過培養，并分離得到單菌落；測試分離得到的單菌落的產長鏈二元酸的能力；得到一株產長碳鏈二元酸含量最高的菌株，并命名為清酒假絲酵母CAT H400 ;并以此菌株作為出發菌進行誘變篩選，誘變方法主要是紫外線和亞硝酸鹽誘變。CAT H430就是經過誘變處理CAT H400后得到的誘變菌株。
清酒假絲酵母CAT H430可以在不同的培養基中生長，其中一種所述的培養基是 Yro培養基，“Yro培養基”為一種水溶液培養基，其包含如下成分20g/L葡萄糖，i0g/L酵母提取液，和20g/L蛋白胨。所述YPD培養基通過水與IN氫氧化鈉溶液將pH調節至7. 0-7. 5 制備。將該培養基在121°C下滅菌20min。所述的“YH)培養基”再添加培養基重量2%的瓊脂，就可以得到YPD固體培養基，該培養基在室溫下成凝膠狀，且同樣適宜培養CAT H430。
另一適于培養本發明菌株CAT H430的培養基為“種子培養基”,其是一種水溶液培養基，包含如下成分10-30g/L蔗糖，1. 5-10g/L玉米漿液，l-10g/L酵母提取液，4_12g/L KH2PO4,0. 5-5g/L脲，和0-30ml/L十二烷。所述培養基用水制備，并在121°C下滅菌20m in。 尿素單獨滅菌，110°C下滅菌15分鐘，冷卻后與滅過菌的其他成分混合，作為種子培養基使用。
另一適于培養本發明菌株CAT H430的培養基為“發酵培養基”,其是一種水溶液培養基，包含如下成分l-10g/L玉米漿液，l-10g/L酵母提取液，5-12g/LKH2P04，0_3g/L氯化鈉，4-12g/L硝酸鉀，10-40g/L蔗糖，O. 5_3g/L脲，和150_300mL/L單一烷烴或者混合烷烴。所述培養基用水與IN氫氧化鈉溶液將pH調節至7. 5-7. 8。將該培養基在121°C下滅菌20min。尿素單獨滅菌，110°C下滅菌15分鐘，冷卻后與滅過菌的其他成分混合，作為發酵培養基使用。
另一適于培養本發明菌株CAT H430的培養基為“生產發酵培養基”,其是一種水溶液培養基，包含如下成分5-12g/L KH2PO4,0-3g/L氯化鈉，4_12g/L硝酸鉀，10-40g/L葡萄糖，O. 1-0. 5g/L檸檬酸，O. 1-0. 5g/L CaCl2，其他金屬鹽，如ZnSO4, CuSO4等。所述培養基用水配制。將該培養基在121°C下滅菌20min。
根據本發明，菌株CAT H430可用于各種發酵工藝中。在本發明的一些實施例中， CAT H430采用的500mL發酵搖瓶工藝，其包括如下步驟
用接種環將菌株CATH430在試管斜面中已滅菌的YH)固體培養基上均勻鋪展開。
將該斜面置于溫度為29_30°C下培養CAT H430菌株2天。
然后將該斜面培養物上的部分菌種(譬如三分之一斜面培養菌種)接種到裝在 500mL搖瓶中的30mL滅菌種子培養基中，并在溫度為29_30°C下培養36-48小時，搖床速度為200_250rpm,搖動的幅度為2. 5-3. 5cm。
然后將種子發酵的肉湯接種至裝在500ml發酵瓶中的滅菌發酵培養基里。該培養物在溫度為29-30 °C下培養90-120小時，搖床速度為200_240rpm，搖動的幅度為 2. 5-3. 5cm，培養過程中用IN氫氧化鈉溶液調節將pH維持在7. 0-8. O之間。該步驟結束后可以測定該發酵肉湯中的二元酸濃度。
在本發明的另一些實施例中，CAT H430采用的IOL發酵工藝，其包括如下步驟
(I)在含有種子培養基的種子罐中、29°C培養條件下制備CAT H430種子液。所述的種子罐參數可以是總體積10L，攪拌速度約為400-500rpm，通氣量約為O. 2-1. OMVh,罐壓(表壓)約為O. 08-0.1MPa，培養時間約為15-24小時；
(2)將CAT H430種子液接種到含有發酵培養基的發酵罐中。所述的發酵罐可以是總體積約為10L，攪拌速度約為500-800rpm，通風量約為O. 2-1. 0M3/h，罐壓(表壓)約為 O. 08-0.1MPaJI^P 40%的液堿用于控制發酵液的pH ;發酵起始時的pH約為6. 0-6. 4，發酵的最初18小時內控制pH高于4. 0-4. 5，發酵18小時后直至發酵結束，控制pH在7. 0-8. O 之間。在發酵周期為15-20小時時第一次批加烷烴；之后當發酵液中烷烴含量低于5%時再批加烷烴。發酵過程中，通過補加葡萄糖來控制發酵過程中的beta氧化；總發酵周期約為 140-180 小時。
在本發明的另一些實施例中，CAT H430采用的200M3發酵工藝，其包括如下步驟
(I)在含有種子培養基的種子罐中、29°C培養條件下制備CAT H430種子液。所述的種子罐參數可以是總體積20M3，攪拌速度約為100-250rpm，通氣量約為O. 2-0. 5vvm，罐壓(表壓)約為O. 08-0.1MPa，培養時間約為15-24小時；
(2)將CAT H430種子液接種到含有生產發酵培養基的發酵罐中。所述的發酵罐可以是總體積約為200M3，攪拌速度約為100-150rpm，通氣量約為O. 2-0. 5vvm，罐壓(表壓)約為O. 08-0.1MPaJI^P 40%的液堿用于控制發酵液的pH ;發酵起始時的pH約為6. 0-6. 4，發酵的最初18小時內控制pH高于4. 0-4. 5，發酵18小時后直至發酵結束，控制pH在7. 0-8. O 之間。在發酵周期為15-20小時時第一次批加烷烴；之后當發酵液中烷烴含量低于5%時再批加烷烴。發酵過程中，通過補加葡萄糖來控制發酵過程中的beta氧化；總發酵周期約為 140-180 小時。
在本發明中，測定培養液中的二元酸濃度，可以采用本領域技術人員熟知的技術， 例如中國專利ZL95117436. 3。具體來說，用鹽酸溶液調節發酵液的pH到3. 0，然后加入 IOOmL乙醚用于萃取發酵液中的二元酸；再采用蒸發以去除乙醚，得到二元酸粉末；將得到的二元酸粉末溶解在乙醇中，并用O. lmol/L的NaOH溶液滴定，最終得到發酵液中的二元酸滴定量。
在本發明的一些實施例中，每個實施例都詳細的描述了各種發酵條件。在一個非限制性的實例中，發酵培養基中可以含有蛋白胨、酵母提取物、酵母氮源、磷酸二氫鉀、 蔗糖。在本發明的另一些實施例中，用于維持CAT H430生長的培養基中，含有(a)含有 10-60g/L葡萄糖的玉米糖漿；(b)由l_15g/L玉米漿和l-10g/L啤酒酵母提取物所組成的有機氮源；(C)無機氮源；(d)磷酸鹽；(e)可選的微量元素；(f)酵母培養物；(g)可以被酵母轉化為二元酸的底物，如美國專利US6004784中所述。
在本發明的一些實施例中，清酒假絲酵母CAT H430的二元酸轉化率分別可以達到至少80%、至少85%、至少90%。在本發明的某些實施例中，CAT H430可以生產的二元酸可以是i^一碳二元酸、十二碳二元酸、十三碳二元酸、十四碳二元酸、十五碳二元酸、十六碳二元酸、十七碳二元酸、十八碳二元酸中的一種或多種。在本發明的一些實施例中，CAT H430生產的二元酸是十二碳二元酸。
在本發明的一些實施例中，清酒假絲酵母CAT H430的二元酸產量分別是至少 95g/L、至少 100g/L、至少 110g/L、至少 120g/L、至少 130g/L、至少 140g/L、至少 150g/L、至少160g/L。在本發明的某些實施例中，CAT H430可以生產的二元酸可以是i^一碳二元酸、十二碳二元酸、十三碳二元酸、十四碳二元酸、十五碳二元酸、十六碳二元酸、十七碳二元酸、十八碳二元酸中的一種或多種。在本發明的一些實施例中，CAT H430生產的二元酸是十二碳二元酸。
在本發明的一些實施例中，清酒假絲酵母CAT H430生產的二元酸化學式是 H00C(CH2)nC00H，其中6彡η彡2。在本發明的一些實施例中，二元酸可以是丁二酸、戊二酸、己二酸、庚二酸、辛二酸，或是其組合物。
在本發明的一些實施例中，清酒假絲酵母CAT Η430生產的二元酸是長鏈二元酸， 其化學式是H00C(CH2)nC00H，其中η彡7。在本發明的一些實施例中，二元酸可以是壬二酸、癸二酸、i^一碳二元酸、十二碳二元酸、十三碳二元酸、十四碳二元酸、十五碳二 元酸、 十六碳二元酸、十七碳二元酸、十八碳二元酸，或是其組合物。
在一些實施例中，生產二元酸包括以下步驟，在包含至少一種氮源和至少一種有機底物的培養基中培養清酒假絲酵母CAT H430，然后從發酵液中回收二元酸；在一些實施例中，發酵液的有機反應底物為具有4到22個碳原子的烷烴，具有4到22個碳原子的羧酸 (例如具有10到22個碳原子的脂肪酸)以及具有10到22個碳原子的脂肪酸與具有I到12 個碳原子的醇類制得的脂肪酸脂。在一些實施例中，得到的二元酸是丁二酸、戊二酸、己二酸、庚二酸、辛二酸、壬二酸、癸二酸、i^一碳二元酸、十二碳二元酸、十三碳二元酸、十四碳二元酸、十五碳二元酸、十六碳二元酸、十七碳二元酸、十八碳二元酸，或是其組合物。
培養基的選擇對于菌株發酵是非常重要的。實施例中所描述的培養基是本發明能利用的培養基的一部分。一般來說，本發明的培養基包含了適于微生物發酵的所有的有機或無機氮源。無機氮源包括硝酸鹽、氨水、液氨、銨鹽、亞硝酸鹽中的一種或多種，其中，硝酸鹽例如硝酸鉀、硝酸鈉，銨鹽例如硫酸銨、氯化銨、硝酸銨、醋酸銨以及類似物。有機氮源包括酵母膏、玉米漿、牛肉膏、豆柏水解液、蛋白胨、尿素、氨基酸、肽中的一種或多種。有機底物可以是至少一端末端為甲基的具有9個碳原子以上的脂肪族化合物。例如，烷烴、烯烴、 炔烴、羧酸及其酯類和芳烴。優選地，底物為具有9到22個碳原子的烷烴，具有9到22個碳原子的脂肪酸及其對應的具有10到22個碳原子酯基的脂肪酸烷基酯。更優選地，底物為十二烷烴，十三烷烴，十四烷烴，油酸，油酸甲酯，棕櫚酸甲酯，棕櫚油酸甲酯，肉豆蘧酸甲酯中的一種或多種。
本發明還公開了適合發酵的輔助碳源，包括葡萄糖、果糖、麥芽糖、甘油和醋酸鈉中的一種或多種。在一些實施例中使用的是葡萄糖。輔助碳源添加在清酒假絲酵母菌株中，解決了由于beta-氧化途徑被阻止或抑制導致的底物氧化所需的能量不足的問題。葡萄糖以底物一定的比例添加，菌株在對底物進行alpha, omega-氧化生成alpha, omega- 二元酸時，不再需要beta-氧化以提供氧化所需能量。
使用上述生物基的方法生產的二元酸可以替代化學法生產的二元酸用于產品的制造。例如用生物基的二元酸生產聚酯，聚酰胺，抽絲制成紡織纖維，電纜的皮層以及牙刷絲；用于制造共聚酰胺膠粘劑、聚酯膠粘劑以及高性能涂料；用于制造汽車輪轂的GMA粉末涂層交聯劑；用于在金屬加工業和工業冷卻系統中使用的金屬防腐劑；用于制造合成潤滑油，例如汽車潤滑油；用于制造各種的個人護理產品以及家庭用品，例如香水和家用清潔劑。
前面的一般性描述和下面的詳細描述都僅僅是為了對本發明的示范和解釋，而不能認為是對本發明的限制。而且本發明不限于所提到的幾個實施例。在實施例中所提到的技術方案不是對本發明的限制，本發明的保護范圍應以權利要求的為準。
除非明確的指出，否則本發明中每個數值區間的最大值與最小值之間的中間值， 至少大于所述區間最小值十分之一。同時，本發明也包含文中公開的其他中間值。此外，本發明所涵蓋的數值區間包含不處于本發明所列舉的最小值與最大值之間的任何數值，除非該數值被明確排除。
除非明確定義，本發明中的科技術語應理解為本領技術人員一般理解的含義。本領域的技術人員應該認識到與說明書中公開的方法、材料、設備相似的方法、材料、設備也可以在本發明中運用。進一步地，所有本說明書提到的公開文獻視為已經包含在本說明書中。
在本發明中，除非特別指出，在組分、反應 條件、濃度等參數中使用“大約”來修正數值。因此在說明書和權利要求書中的數值參數是一個近似值，取決于本發明所期望的性能。至少，不應認為是對本發明權利要求保護的等同原則應用的限制。至少，每個參數的數值運用四舍五入，根據記載的有效數字的位數來確定。雖然在具體實施例中的數值盡可能做到準確，但是由于實驗測試方法的系統誤差必然導致任何數據都會有一定的誤差。
下面的實施例進一步說明本發明。這些實施例僅僅用來說明本專利，展示這些實施方案的有益效果。這些實施例不構成對本專利的限制。
實施例1、CAT H430菌株的篩選過程
CAT H430菌株是由CAT H400誘變得到的，CAT H400菌株是從中國山東省勝利油田采集的樣本中分離得到的。具體的來說，首先將從勝利油田采集的樣本用O. 7%NaCl溶液稀釋1000倍，然后接種在含有YPD培養基的平板上。所有的樣品在28-30°C培養。挑選平板上的菌落，然后接種到500mL標準搖瓶發酵以篩選出生產二元酸產量最高的菌株。其中一株二元酸產量達到10g/L的菌株被編號為CAT H400，并以該菌株作為后面的鑒定和誘變菌株。
實施例2、CAT H400菌株的鑒定
2.1、形態
形態(生長在馬鈴薯葡萄糖瓊脂上的菌落)乳白色、黃油狀、橢圓形-卵形、芽殖。
2. 2、碳源和氮源的利用
利用公知的微生物鑒定方法進行營養物利用實驗。在特定培養基中加入下列氮源或碳源，菌體培養2天或3天后，以是否生長為判斷條件，判斷陰性與陽性，結果如下
表1、CAT H400菌株的碳源和氮源的利用

添加N-乙酰葡糖胺為碳源、氮源生長為(+ );在37°C下生長為(_)；
添加脲酶生長為(_)。
綜上所述，鑒定該菌株CAT H400為清酒假絲酵母(Candida sake)。
實施例3、CAT H430菌株的誘變和篩選方法
I JfCAT H400菌株用甘油試管保藏，保存在低溫冰箱中。從甘油試管中取出一支，在室溫下解凍，然后接入裝有50mL YPD培養基的500mL搖瓶中，于29 °C旋轉搖床中培養 20-24h，轉速為 210rpm。
2、為了準備用于誘變的菌株懸浮液，在15mL的無菌離心管中加入上述IOmL的YPD 培養液，2000rpm離心2分鐘，倒去上清液，用O. 85%的生理鹽水離心洗滌3次。倒去上清液，加入2. 5%的無菌氯化鋰10mL，制得菌株懸浮液。
3、稱取O. 08mg的NTG誘變劑加入15mL無菌離心管中，并加入IOmL O. 85%的生理鹽水,混勻。
4、將步驟3及4中的各IOmL液體混合,加入90mm的放有15mm*3mm攪拌子的無菌平皿中，蓋好上蓋。按同樣方法處理再制備2塊無菌培養皿。把三個無菌培養皿放磁力攪拌器上分別攪拌處理10、15、20分鐘。
5、每個無菌培養皿分別按以下方法處理將上述的處理液取IOmL加入15mL無菌離心管中，2000rpm離心2分鐘，倒去上清液，用O. 85%的生理鹽水離心洗滌3次。
6、倒去上清液，用O. 85%的生理鹽水進行逐級梯度稀釋。每稀釋度吸取O. 15mL菌液進行平板涂布。涂布后的平板放培養箱倒置在29°C下培養3-4天。
7、挑取培養成熟的單菌落接種到入15*150mm試管斜面，放培養箱于29°C下培養2 天。
8、斜面培養成熟后取三分之一斜面菌體接入裝有IOmL發酵培養基的250mL搖瓶中，在旋轉搖床中29°C下培養4天，轉速為210rpm。剩余斜面放4°C冰箱冷藏。同時搖床每層放有6瓶裝有對照菌株的搖瓶，而且均勻的放在6個不同的位置。
9、發酵過程最后一步，用移液槍將O. 05mol的酚酞試劑(濃度1%)加到每個搖瓶培養基中。隨機或者根據菌株長勢選取其中10瓶以及前面所提的6瓶對照菌株。
10、將這16個搖瓶稱重記錄,然后用O. 2N堿溶液滴定。達到滴定終點后,再次將這16個搖瓶稱重并記錄。
11、計算對照菌株的搖瓶平均耗堿量及篩選菌株的耗堿量，確定所要篩選菌株的耗堿水平，一般比初篩對照菌株耗堿量提高10%以上。
12、將O. 2N的堿溶液和O. 05mol的酚酞試劑(濃度1%)加到每個對比菌株的搖瓶中得到中和瓶中的酸需要的堿量。將此堿量的O. 2N的堿溶液和O. 05mol的酚酞試劑(濃度 1%)加到其他搖瓶中。如果搖瓶變為紅色證明突變的菌株產酸量小于對比菌株。搖瓶繼續震蕩5分鐘。5分鐘后檢查藥品是否變色，所有變色的搖瓶全部去除。繼續給沒有變色的搖瓶堿溶液滴定，然后給這些搖瓶稱重，計算耗堿量。
13、按照發酵搖瓶耗堿量的多少確定進行再次復篩的菌株。一般100株搖瓶初篩菌株中選取5株耗堿量聞的菌株進行復篩。
14、選取復篩菌株對應的初篩斜面，上述接初篩后剩余的三分之二斜面，再鏟取五分之一斜面菌體轉接斜面F2，放培養箱29°C下培養2天。剩余斜面繼續放冰箱冷藏。
15、培養成熟的斜面菌體整支全部接入裝有30mL種子培養基的500mL搖瓶中，在旋轉搖床中29°C下培養44-48h，轉速為210rpm。同時將對照菌株的I支甘油管菌液也全部接入I個種子搖瓶中。
16、培養成熟后的種子液吸取3ml加入裝有15mL發酵培養基的500mL搖瓶中，在旋轉搖床中29°C下培養110h，轉速為210rpm。
17、經多次篩選得到高產二元酸的菌株，編號為CAT H430。
實施例4、在500mL搖瓶中使用CAT H430生產長鏈二元酸
以CAT H400菌株為對照，將CAT H430使用500mL搖瓶發酵，發酵條件和十二碳二元酸、十三碳二元酸和十四碳二元酸的平均產量如表2所示。
表2、500mL搖瓶中發酵CAT H430生產二元酸的平均產量
權利要求
1.一種生產二元酸的菌株，其特征在于，所述菌株為清酒假絲酵母CCTCCNo. M2011489。
2.如權利要求1所述的菌株的發酵方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟a)、在含至少一種氮源和至少一種有機底物的培養基中培養清酒假絲酵母CCTCCNo. M2011489 ;和b)、從步驟a)中得到的培養液中回收二元酸。
3.如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述氮源為有機氮源或者無機氮源。
4.如權利要求3所述的方法，其特征在于，所述有機氮源為酵母膏、玉米漿、牛肉膏、豆柏水解液、蛋白胨、尿素、氨基酸、肽中的一種或多種；所述無機氮源為硝酸鹽、氨水、液氨、銨鹽、亞硝酸鹽中的一種或多種。
5.如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述培養基中還包括輔助碳源，優選地，所述輔助碳源為葡萄糖、果糖、麥芽糖、甘油、醋酸鈉中的一種或多種。
6.如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述有機底物選自具有4到22個碳原子的烷烴、具有4到22個碳原子的羧酸、具有I到12個碳原子的醇與具有10到22個碳原子的脂肪酸經酯化反應得到的脂肪酸烷基酯。
7.如權利要求6所述的方法，其特征在于，所述有機底物選自具有9到22個碳原子的烷烴、具有9到22個碳原子的脂肪酸及其對應的具有10到22個碳原子酯基的脂肪酸烷基酷。
8.如權利要求7所述的方法，其特征在于，所述有機底物為十二烷烴、十三烷烴、十四烷烴、油酸、油酸甲酯、棕櫚酸甲酯、棕櫚油酸甲酯、肉豆蘧酸甲酯中的一種或多種。
9.如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述二元酸為丁二酸、戊二酸、己二酸、庚二酸、辛二酸、壬二酸、癸二酸、i^一碳二元酸、十二碳二元酸、十三碳二元酸、十四碳二元酸、十五碳二元酸、十六碳二元酸、十七碳二元酸、十八碳二元酸中的一種或多種。
10.如權利要求1所述的清酒假絲酵母CCTCCNo. M2011489生產二元酸的應用。
全文摘要
本發明公開了一種生產二元酸的菌株及其發酵方法，所述菌株為清酒假絲酵母CCTCC No.M2011489。所述方法包括以下步驟a)在含至少一種氮源和至少一種有機底物的培養基中培養清酒假絲酵母CCTCC No.M2011489；和b)從步驟a)中得到的培養液中回收二元酸。使用本發明的高轉化率的假絲酵母生產長鏈二元酸可以完全取代多步合成的化學法，而且產量高，能耗低，起始原材料可以不采用石化原材料。
文檔編號C12N1/16GK102994402SQ20121016589
公開日2013年3月27日 申請日期2012年5月25日 優先權日2012年3月9日
發明者劉馳, 廖錦繡, 汪江林, 秦海斌, 李乃強 申請人:上海凱賽生物技術研發中心有限公司, 山東凱賽生物科技材料有限公司, 上海凱賽生物科技有限公司, 凱賽生物產業有限公司