專利名稱：玉竹微衛星dna分子標記的制作方法
技術領域：
本發明涉及分子標記技木，具體涉及ー種玉竹微衛星分子遺傳標記。
背景技術：
微衛星(Microsatellite)又稱作短串連重復(ShortTandem Repeats, STRs)、簡單重復序列(Simple Sequence Repeat, SSRs)、簡單序列長度多態性(SSLP)。是指一類遍布于生物基因組中的由幾個核苷酸對(稱為核心序列，一般為I 6bps)為重復單位組成的簡單串聯重復。其重復次數在同一物種不同的遺傳型間是高度可變的，但這段重復的兩端卻是相對保守的單拷貝序列，據此設計引物，即可通過PCR技術分析核心序列重復次數的變異，在不同的遺傳型間檢測到多態。根據重復單元的構成，微衛星DNA序列被分為3種 類型單一型(pure),復合型(compound)和間斷型(interrupted)。例如單ー型ATATATATATATATATATATATAT復合型ATATATCACACACACACACAC間斷型ATATATCAATATATCA ATATATA作為ー種分子標記，微衛星DNA具有以下特點廣泛分布于真核生物的基因組中，據估計每6 kb長度中就有I個微衛星位點；核心序列的重復次數在個體間呈高度變異性，多態性信息容量高呈共顯性，遵循盂德爾法則遺傳；選擇中性等等。基于以上特點，微衛星DNA被廣泛用于植物遺傳圖譜的構建、基因定位、品種鑒定和種質保存、數量性狀基因的分析、輔助育種、構建指紋圖譜、遺傳多祥性及物種進化與親緣關系等方面的研究。玉竹又名尾參，玉參，鈴鋯菜，地管子和甜根草，隸屬于百合科(Liliaceae L.)黃精屬(Polygonatum Mill.),為多年生草本植物,喜陰生,廣泛分布于歐亞大陸溫帶地區。玉竹地下莖可入藥，在我國其藥用歷史已逾兩千多年。傳統中醫學認為玉竹性甘、微寒、歸肺、胃經、能養陰潤肺，益胃生津用于燥熱傷陰，熱傷胃陰之癥。現代研究證明玉竹含多糖和多種提取物，在延緩衰老，增強免疫力，抑制腫瘤，促進淋巴細胞轉化等方面具有一定效果。由于民間濫挖嚴重，加之野生藥材周期長，玉竹野生資源日益枯竭。實際上，玉竹藥源較為復雜，微衛星有助于鑒定玉竹品系，并區分出玉竹偽品。同時，玉竹在栽培馴化過程出現了一系列問題，如繁殖系數低，利用微衛星標記對玉竹分子育種的研究尚且很少。
發明內容
本發明解決的技術問題分離克隆玉竹的微衛星DNA分子標記，建立玉竹衛星DNA技術體系并用這些分子標記進行玉竹遺傳多祥性，黃精屬屬植物遺傳關系的研究，以及進行黃精屬種質鑒定。本發明解決技術問題的技術方案玉竹微衛星DNA分子標記，包括玉竹微衛星(CT) η富集文庫的構建，微衛星序列陽性克隆的篩選及測序，得到55個含有微衛星重復序列的克隆。得到9個多態性高的微衛星分子標記Pol、Po2、Po3、Po4、Po5、Po6、Po7、Po8、Po9 ；Pol為360個核苷酸，Po2為471個核苷酸，Po3為447個核苷酸，Po4為408個核苷酸，Po5為463個核苷酸，Po6為497個核苷酸，Po7為424個核苷酸，Po8為509個核苷酸，Po9為342個核苷酸。
圖I :Pol位點的特異性引物擴增24個玉竹的DNA的銀染PAGE圖。圖2 Po2位點的特異性引物擴增24個玉竹的DNA的銀染PAGE圖。圖3 Po3位點的特異性引物擴增24個玉竹的DNA的銀染PAGE圖。圖4 Po4位點的特異性引物擴增24個玉竹的DNA的銀染PAGE圖。
圖5 Po5位點的特異性引物擴增24個玉竹的DNA的銀染PAGE圖。圖6 Po6位點的特異性引物擴增24個玉竹的DNA的銀染PAGE圖。圖7 Po7位點的特異性引物擴增24個玉竹的DNA的銀染PAGE圖。圖8 Po8位點的特異性引物擴增24個玉竹的DNA的銀染PAGE圖。圖9 Po9位點的特異性引物擴增24個玉竹的DNA的銀染PAGE圖。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明作詳細的說明。實施例I :玉竹微衛星DNA富集文庫的構建I)基因組的提取與酶切用Doyle J 介紹的 CTAB 法(Doyle J. DNA protocols for plants-CTAB totalDNA isolation [A]· In Hewitt GM, Johnston A (eds. ), Molecular Techniques inTaxonomy [M]. Berlin: Springer, 1991, 283-293)提取基因組。用限制性內切酶 Sau3AI酶切基因組。2%的瓊脂糖凝膠電泳后，在紫外光下切下300-900 bp的DNA片段。用膠回收試劑盒回收。2)加接頭將膠回收純化后的產物加入接頭oligo A(5，-GGCCAGAGACCCCAAGCTTCG-3，)oligo B (5， -P04-GATCCGAAGCTTGGGGTCTCTGGCC-3，)，在T4 DNA Ligase作用下于16°C水浴連接過夜。3 ) PCR檢測接頭連接以oligo A為引物，以連接產物為模板進行PCR擴增，(50 μ I反應體系如下25μ I GoTaq Green Master Mix, 5 μ I 引物 oligo A, 5 μ I 連接產物，加水補至 50 μ I。PCR反應程序94°C預變性5分鐘，94°C變性50秒，56°C退火一分鐘，72°C延伸2分鐘，變性、退火、延伸三個步驟循環25次，最后72°C充分延伸10分鐘。在2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后，PCR產物用純化試劑盒進行純化。4)磁珠富集將純化后的DNA片段變性形成單鏈之后與含生物素的微衛星探針雜交，形成“微衛星探針包含微衛星的基因組DNA單鏈”復合體。將雜交液加入已處理好的磁珠，室溫靜置30分鐘。將離心管放在磁力架上，吸去上清，依次用6 X SSC, 2 X SSC, I X SSC在60°C下洗兩次，最后用O. I X SSC室溫下洗一次。加入TE緩沖液，在PCR儀上95°C變性15分鐘，收集上清。重復兩次。5) PCR 富集以磁珠富集產物為模板，oligo A為引物進行PCR擴增，25 μ I反應體系如下，12. 5 μ I GoTaq Green Master Mix, I. 5 μ I 引物oligo A, 2. 5 μ I 富集后的DNA,カロ水補至25 μ I。PCR反應程序如下94°C預變性3分鐘，94°C變性35秒，60°C退火性35秒，72°C延伸I分鐘，變性、退火、延伸三個步驟循環25次，最后72°C充分延伸12分鐘。PCR產物在2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后，用純化試劑盒進行純化。6)感受態細胞的制備 挑取平板上E. coli DH-5a單菌落，接種于5 ml的不含Amp的LB培養基中，37°C振蕩培養過夜。取I ml培養液于50 ml的LB液體培養基中，37°C振蕩培養，2 4 h至對數期。測OD (0. 2 0. 6)。將培養液分裝至EP管中(每管I. 5 ml菌液)，水浴10 15min。在4°C離心,4000 rpm, 10 min (先降溫后再離心)棄上清。棄上清后三管并一管，冰浴30 min (第一管加入0. I mol/L, I ml事先冰中預冷的CaC12，混勻，吸出至第二管，如此將三管并一管)。取出后梯度離心，4°C，4000 rpm，5 8 min。棄上清。加入200 μ I預冷甘油(15%) /CaCl2 (0. I Μ)混勻，_80°C保存。7)連接轉化取PCR富集后的純化產物連接入TA克隆載體(pMD19-T Simple Vector)，16°C水浴連接2-3小吋。取出凍存管，冰上復蘇10 min ;將10 μ I的連接產物加入200 μ I感受態細胞中，混勻，冰浴30 min ;42°C水浴熱休克90 s ;冰浴2 min，加入600 μ I LB培養基，37°C振蕩培養I. 5 h ;取70 μ I培養液，滴入LB/Amp/X-gal/IPTG平板上并涂布均勻(X-Gal需避光)；將平板37°C正向放置培養0. 5h，然后于37°C烘箱中倒置培養過夜。經過12 h的培養，待平板上的菌落大小適中，取出平板于4°C放置使藍斑充分顯現。用滅過菌的牙簽挑取平板上白色單克隆菌落，置于96深孔板中(深孔板事先加入了 400 μ I的含Amp抗性的LB/Amp培養基)。當白色單菌落挑取結束后，用不干膠將孔板蓋好后于37°C，225rpm振蕩培養4 h08)陽性克隆的篩選以連接轉化所得的菌液為模板，利用引物oligo A和引物(CT)12-行PCR擴增。15 μ I PCR 反應體系包括rTaq 酶 0. 375 U, 10X Buffer I. 5 μ I, dNTP 0.2 μ M, MgCl21.5 μ Μ，引物0.4 μ M (oligo Α，(CT)12),水，模板。反應程序94 °C預變性3分鐘，94 °C變性50秒，56°C退火35秒，72°C延伸I分鐘，變性、退火、延伸三個步驟循環30次。最后72°C充分延伸12分鐘。I. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。9)陽性克隆測序及引物設計選取擴增片斷長度在300-900 bp含陽性克隆的菌液，送生エ生物(上海)有限公司測序，共得到51條含有微衛星DNA的序列。利用軟件Primer Premier 5. O根據微衛星DNA兩端的序列來設計引物。10)篩選有多態性的引物
用上述的CTAB法提取玉竹的基因組。用設計好的引物(表I)擴增基因組。反應程序94°C預變性4分鐘，94°C變性45秒，相應的退火溫度30秒，72°C延伸35秒，變性、退火、延伸三個步驟循環35次。最后72°C充分延伸8分鐘。I. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR產物用PAGE電泳進行檢測。共得到9個有多態性的微衛星標記。Pol、Po2、Po3、Po4、Po5、Po6、Po7、Po8、Po9 ；Pol為360個核苷酸，Po2為471個核苷酸，Po3為447個核苷酸，Po4為408個核苷酸，Po5為463個核苷酸，Po6為497個核苷酸，Po7為424個核苷酸，Po8為509個核苷酸，Po9為342個核苷酸。11)結果分析使用Cervus3. O軟件計算期望雜合度和觀察雜合度。使用Genepop3. 4軟件計算哈代-溫伯格以及連鎖不平衡的值，以此來描述9個玉竹微衛星DNA多態位點的特征。由附圖1-12可看出，本發明的9個微衛星序列的長度在供試的21個玉竹中都出現的多祥性，由此可見，本發明的這9個微衛星標記能用于研究玉竹的遺傳多祥性，黃精屬植物種間和居群間的變異和進化關系，具有很高的重復性，是ー種可靠有效的分子標記。表I引物特性表 位點基序弓}物序列退火溫度(gC) _
Fol (GA).,Pol-F CM CTA AGG AM GTG CTC TTC TM C56
Pol R CTC TAC CTA TGA GTG GTG CTA AAC Po2 (TCCh(TC) lb Po2-F TTG AGA TTA GAC TTT At TGG GTG57
Po2 R TGA ATA (11 GCC TTA GM ATG CG Po3 (GA)bPo3 F CTT CM CGT GM GTG AGG GTG63
Po) Ii CIG (TA TTT ΓΓΤ CkT ATC TGT AT Pol (Cd)..PoJ I- \W iTT GGA ΛΤ(； ΛΤ
權利要求
1. 一種玉竹微衛星DNA分子標記，其特征在于所述微衛星標記的標號分別為Pol、Po2、Po3、Po4、Po5、Po6、Po7、Po8、Po9 ； 其核苷酸序列分別為 Pol gatcacatgc cgatagttcc tcggtcacct agcatattta gtgtcagtct tctagctggc60gaataaaaac actaagtcga aatgaactaa ggaaagtgct cttctaactg tgagagagag120agagagagag agagagagag agagagagag agatgttggt ccatccctca tggtgtactg180tggatttcat tttgcgctct ctagctaatt ggattttagt cagatttttc tagttagttt240agcaccactc ataggtagag ctgtaaaatg aactgagttt tggagtgttt gtgttcgttc300aataatttac acgagtttaa atttagctga ttctatatga acccaaacaa atactcaatt360Po2 gatcacagat catgatctgg tcaaccagaa acccccgtgt ctgaccctga ggatacagat60accctctgcc tggtcacagg acctgggttg gttggccaga cagtgcccag gtcgaccccg120acctattttg ggctgttatt ggttttcttt ggtgttagta ggttttgttg gtttcttatt180gggtttttga cttatataac tataacctac ttcatctaag gtttagattt gttttgtttt240attttggatg gttgagatta gactttaggt gggtgtttcc ctatatatac catctccaaa300ccctagaacc cattcctcct cctcctcctc tctctctctc tctctctctc tctctctctt360gagcaactct ctttaagagc tagggcagag aatttagggg aagatttggg atttttgctg420 aggttttctt cgtggatttg caagcttcgc atttctaagg caagtattca t471 Po3 gatcatgcat atttgtttat agctagcttc ccatcaacgt acgtccgttg catttgattt60gattttcaaa gtattaggac ttgaacgtga agtgagggtg ggaactggga actaggactc120ggatgagaga gagagagaga gagagagaga gagagagaga gagagagaga tatgctgcag 180gaacttgtgg ataaatagag atatgtgtgg cactctctca ttgattatac ttagttcact240ctctcgaaac gccacagaga tagacaaagg cttgattgtt agatcagcat acagatggca300agaaatggca gcggttatgc ttgctagttt ggtgagtggt gagacatttt gtcctctctg360gccgtcgtac ttgctataaa gacgacgtgg aaaggcccga ccacgagaat gccgaccgca 420 tcgtttttcg acgataatgt tgttttt447 Po4 gatcacgaac ttggaagctt cgactttggt gattgttgga gtgagctaca aattgaagag60ggtgggtttg cttgagctca tgaataagag gaagggagga gcttggcttt ctcttgaaaa120aggaatgaga atgaaaagag agagaggggg aggaattgtt tttatcaagg gggcatggtg180cattaaatgc ttggaatgat ggagtgctgg gtattaaatg gaggagggag agagagagag240agagagagag agagagagag agagagagag agagagagag agagagagtg atgggacttt 300tctcatccat gaatgagaca aagttaacaa gagggatgtt aacaattcaa actggtaaaa360 cacatgagtg aaccaaacca gtccacgaat cgcagtaatt cgactgtg408 Po5 gatcttgtgc caacctcgct attaaactcc ttctttagct cgtaacaaca ccattgctct60tccactactc aatctacgcc ttcactgtgt ccctactttc tagcctcacc ttctctctct120ctctctctcc ctctctctct ctctctctct ctctctctct ctctctcttc cgttcgcctc180cgggcatttc tttagccacc cggcctccct ttccgccttc cgggctactc tttacctccg240agctatggtt acttcttaca agctggcttt cgggccctcg tttagcactt ttagtgcttt300tagccttcag gcttagcttc ggttactttc acgagttgac tctcgggtcc tcgtttagca360cttttagtgc ttttagcatt cgtacttgct ttccagcctc gcaagagcaa aggaggtgct420 gccaaatttt ctgctgatac tagactgcag cctaactaca atg463Po6 gatcaacatc tccctcacct ttttgcagtg gtttccaagg gcctaaggcc caatctttcg60ctggctcagt gaagttaagc ccaagcttgt ctttttgcag tggtttccat atgtgaagtt120aagcccaagc ttgtcaacat ctccctaata tatatagccc aatctatgta ggcctgccta180gtgggctgaa ttatcctacc acattactcg ctcatattcc accaattccg tatgtggact240gattcagcac cacccaaaac ccgacacgcc tccttcgctt ctccaccaca tccacctcca300cgtgtcggtt tcccccctcc cttctctgtt tcaatattaa ctcctttttc tgtccgaaac360aaaacccatc tcttttctct ctctctctct ctctgtgtgt gttcagtgtt caaggtctca420acaaagagag tagcaatggc gacttcttct tcttcttctt cgactagtcc gctgctgaag480tacgagctgg atatcgt497Po7 gatcatcggc atcgtcgtca agagggatgg agagcgtctc tctcgccttc ggacgctgat60agcagagaga cccatcgatg gagcaacaaa ggaaaacaac caacaaaatc acaacgaaac120 gaagattact tgcttcttcc atcatgaatg agtatgaagt ttaatgtgga atactgtgag180agagagagag agagagagag agagagagag agagagagag agagagagag agagaggaga240gataatggag gctgcaggca caatttataa tgtggtattt acaaagaaag aaagaaatta300gattttttga gcgtttgatt tgaaaaaaat tgcaacactc tctccttcta tctcttccta360catttgcatg cccatttagt tttcggtttg ggacacgagg gggccttcat aagttgactc420gtgt424Po8 gatcatccgg aatcctgcta gttggccttg gattggaccg gtgtccgtta ccggatccaa60tattgatatc tgtacccgtt tctgtgttta atatagtgga ttgttaattt gaactgtgtt120aatacagttt cctcttgtct ttgatggcat ggcaagagcc ccaccttcct ttgtctaatc180aaagccccat ccccttgcat ttaatacttg ttattcactc tctctctctc tctctctctc240tctctctctc ccatttttta cctcctccct tcccttctct ctttctcttc tcatcttcaa300agagcaacct aagggaagca agagaacacc accacaccaa gagctcttcc aagcctcccc360ttgctccggt gaacactccg gtaagctccg gccgagctcc gacgaactta ggcgagtgcc420atgctttcct tagcctacgg actgtaaatt gtgagctcac gagttcaaga aatctctctt480taaaagagaa gccttaaggg ctattaatt509Po9 cccttaagcc ctcattgctg cccctgacca agccctcgtc tcgccggccg accggtcagc60tgagtaatgg ccaacctggt tagtcgaccg acctcctgct cccaatagag cgccgcctct120ctctctctct ctctctctct ctctctctct ctcttttcaa atttccccac actccgctta180attcttctcc taactccctg tcactcccta actctcccta attcccaccc taactccctc240tatctctctc actttctctc ctaactctct cgatctcgcc tctaacctat ctgagctccg300gacaactggc atctccacca tattctcttt cactcctcca tt342。
2.根據權利要求I所述的一種玉竹微衛星DNA分子標記，其特征在于所述的Pol、Po2、Po3、Po4、Po5、Po6、Po7、Po8、Po9九個位點的引物序列為Pol-F GAA CTA AGG AAA GTG CTC TTC TAA CPol-R CTC TAC CTA TGA GTG GTG CTA AACPo2-F TTG AGA TTA GAC TTT AGG TGG GTGPo2-R TGA ATA CTT GCC TTA GAA ATG CGPo3-F CTT GAA CGT GAA GTG AGG GTGPo3-R CTG CCA TTT CTT GCC ATC TGT ATPo4-F ATG CTT GGA ATG ATG GAG TGC TPo4-R GAT TCG TGG ACT GGT TTG GTT CPo5-F CTA CGC CTT CAC TGT GTC CCTPo5-R CTC GGA GGT AAA GAG TAG CCP06-FGCT TCT CCA CCA CAT CCA CCTP06-R GTC GCC ATT GCT ACT CTC TTT GTPo7-FGAG CAA CAA AGG AAA ACA ACC AACPo7-R GTG TCC CAA ACC GAA AAC TAA ATGP08-F AGT TTC CTC TTG TCT TTG ATG GP08-R GCA CTC GCC TAA GTT CGT CPo9-F GCA CTC GCC TAA GTT CGT CPo9-R CAG ATA GGT TAG AGG CGA GAT。
全文摘要
本發明公開了一種玉竹微衛星DNA分子標記，包括玉竹微衛星(CT)n富集文庫的構建，微衛星序列陽性克隆的篩選及測序，得到55個含有微衛星重復序列的克隆，篩選得到了9個高多態性的微衛星分子標記Po1、Po2、Po3、Po4、Po5、Po6、Po7、Po8、Po9。本發明可用于研究玉竹的遺傳多樣性，黃精屬植物種間和居群間的變異和進化關系，重復性好，是一種可靠有效的分子標記。
文檔編號C12N15/11GK102703444SQ20121016528
公開日2012年10月3日 申請日期2012年5月25日 優先權日2012年5月25日
發明者唐王剛, 朱國萍, 李雪, 王文才, 王暉, 趙曉宇, 鄭基陽, 高鵬 申請人:安徽師范大學