專利名稱：豬細小病毒bq-c株及其在制備豬細小病毒滅活疫苗中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種豬細小病毒及其在制備豬細小病毒滅活疫苗中的應用，特別涉及一株自行分離得到的豬細小病毒BQ-C株以及由該病毒株制備得到的滅活疫苗。屬于生物疫苗領域。
背景技術：
豬細小病毒(Porcine parvovirus, PPV)是引起豬繁殖障礙的主要病原之一，PPV感染的主要是孕豬，特別是初產母豬在懷孕前容易受到感染，引起懷孕母豬流產、產死胎、 胎兒木乃伊化等，而母體通常缺乏臨診癥狀；當然也會引起其他癥狀。自1966年Mayr和Mahnel發現和證實PPV存在及其致病性以來，國內外學者對其進行了廣泛深入的研究。近年來，PPV感染呈擴大上升趨勢，給全球養豬業造成了巨大的經濟損失。在我國，潘雪珠于1983年首次分離到了 PPV。此后，在各地陸續分離到了數株PPV，目前，人們發現豬細小病毒經常與其他一些病毒，例如豬圓環病毒2型和豬繁殖與呼吸系統綜合征病毒等混合感染，導致斷奶仔豬多系統綜合征、皮炎、呼吸道綜合征等，給世界的養豬業造成很大的損失。雖然不同分離株均屬于同一血清型，但可以引起多種臨床癥狀，但都以造成繁殖障礙為主。目前，我國經產母豬及種公豬PPV陽性率高達80%以上。本發明的發明人在2005年從黑龍江省某豬場分離到一株豬細小病毒，經實驗室鑒定為強毒株，馴化克隆后的毒株命名為PPV BQ-C株。利用PPV BQ-C株，開展了豬細小病毒病滅活疫苗的研制開發工作，篩選培育出免疫原性良好、效價穩定的豬細小病毒強毒BQ-C株，選擇了最適合該病毒增殖的ST細胞和符合制造疫苗的滅活劑、佐劑及其他條件。對制品的生產工藝、安全性、保護率、免疫程序、最小劑量、抗體持續期和保存期等都進行了試驗測定，并獲得了大量的試驗數據，證明本疫苗安全有效。在此基礎上，進行了中試生產，經抽樣檢驗，全部符合擬定的質量標準，并對中試產品進行了安全試驗和效力試驗，其結果也證實本疫苗能有效地預防由豬細小病毒引起的母豬繁殖障礙，在實驗室試驗、中間試制的基礎上，本發明研制出了豬細小病毒(BQ-C株)滅活疫苗，其結果也證實本疫苗能有效地預防由豬細小病毒引起的母豬繁殖障礙性，進一步驗證了本疫苗的各項質量標準。
發明內容
本發明的目的之一是提供一種免疫原性良好、效價穩定的豬細小病毒株；本發明的目的之二是提供所述的豬細小病毒株在制備疫苗中的應用；本發明的目的之三是提供一種由所述的豬細小病毒株制備得到的疫苗；本發明的目的之四是提供所述的疫苗在制備預防豬細小病藥物中應用。為了達到上述目的，本發明采用了以下技術手段本發明的發明人在2005年從黑龍江省某豬場分離到一株豬細小病毒，經實驗室鑒定為強毒株，馴化后的毒株命名為PPV BQ-C株。本發明的PPV BQ-C株是從發生典型豬細小病毒感染的妊娠母豬所產弱仔中分離獲得的，因此與分離到的其它毒株相比在細胞上的增殖滴度 高，對豬的免疫原性好。經豬睪丸傳代細胞系(ST)傳代后作為疫苗毒種，效檢用強毒為BQ-C株第7 10代。該毒株可以引起ST細胞90%以上感染。本發明的一種豬細小病毒，為在ST細胞上傳代后的第7代病毒株，命名為豬細小病毒BQ-C株，分類命名為豬細小病毒，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址在北京市朝陽區北辰西路I號院中科院微生物研究所，其菌種保藏編號為CGMCC No. 6091，保藏日期為2012年5月8日。本發明還提供了所述的豬細小病毒在制備豬細小病毒滅活疫苗中的應用。本發明的一種豬細小病毒滅活疫苗，其特征在于含有滅活后的本發明所述的豬細小病毒BQ-C株。在本發明所述的豬細小病毒滅活疫苗中，優選的，所述的豬細小病毒BQ-C株采用以下方法進行滅活0. 3%的二乙烯亞胺(BEI)在32°C條件下滅活96小時后，加入0. 02%硫代硫酸鈉終止滅活。在本發明中，優選的，所述的豬細小病毒滅活疫苗是由15% (v/v)的法國賽比克公司的商品化MontanideTM ISA15AVG佐劑和85% (v/v)的用二乙烯亞胺(BEI)滅活的豬細小病毒(BQ-C株)乳化后得到。在本發明中，乳化工藝是采用法國賽比克公司的商品化MontanideTMISA15AVG佐齊U，除菌后可直接用于疫苗乳化制備；乳化前將滅活的同批病毒液解凍混合，在無菌室內用勻衆機以200r/min攪拌均勻,然后按照水相抗原與油相佐劑8. 5 I. 5的體積配比；乳化程序為先將水相放入乳化器中進行攪拌，然后緩緩加入油相佐劑，以800r/min連續攪拌30分鐘；生產得到的疫苗屬水包油劑型，為了穩定界面和消除氣泡，獲得最佳乳化效果，需要靜止30分鐘后分裝。進一步的，本發明還提供了所述的滅活疫苗在制備預防由豬細小病毒引起的疾病的生物制品中的用途。特別地，所述的疾病為初產健康陰性母豬發生的母豬繁殖障礙。
圖I為豬細小病毒BQ-C株在ST細胞上培養不同時間后的熒光檢測結果；圖IA為接種0小時的熒光檢測結果；圖IB為接種8小時的熒光檢測結果；圖IC為接種16小時的熒光檢測結果；圖ID為接種24小時的熒光檢測結果；圖IE為接種32小時的熒光檢測結果；圖IF為接種40小時的熒光檢測結果；圖IG為接種48小時的熒光檢測結果；圖IH為接種56小時的熒光檢測結果；圖II為正常對照細胞的熒光檢測結果。圖2為豬細小病毒BQ-C株感染ST細胞后的一步生長曲線。
具體實施例方式下面通過實驗并結合實施例對本發明做進一步說明，應該理解的是，這些實施例僅用于例證的目的，決不限制本發明的保護范圍。實施例I豬細小病毒BQ-C株的分離及培養鑒定I毒種來源及標準
根據新生物制品申報要求，結合本發明獲得的大量的試驗數據，參照《中國獸藥典》(2005年版)，對制苗用毒種進行了鑒定，現將試行規程(草案)中毒種標準進行以下說明。I. I毒種來源制造本品用的毒種為豬細小病毒BQ-C株，是本發明人在2005年從發病豬只自行分離馴化后獲得，由于這一毒株是從發生典型豬細小病毒感染的妊娠母豬所產弱仔中分離獲得的，并且與分離到的其它毒株相比在細胞上的增殖滴度高，對豬的免疫原性好，所以選擇其用于疫苗的生產。經豬睪丸傳代細胞系(ST)傳代后作為疫苗毒種，效檢用強毒為BQ-C株第7 10代。該毒種為在ST細胞上傳代后的第7代病毒株，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址在北京市朝陽區北辰西路I號院中科院微生物研究所，其菌種保藏編號為=CGMCCNo. 6091，保藏日期為2012年5月8日。I. 2 毒種(CGMCC No. 6091)標準 I. 2. I紅細胞凝集價取96孔U型微量反應板，每孔加入25 ill PBS (0. 01mol/L，pH值7. 0 7. 4)，第一列各孔中加入25 Ul抗原，然后將抗原進行2倍系列稀釋，直至第11孔棄去25 yl。每孔加入25 u I PBS,再加入0. 6%豚鼠紅細胞懸液25 u 1，用微量振蕩器混合均勻，置室溫下作用I小時。判定結果時，以50%紅細胞凝集的抗原最高稀釋倍數作為判定終點。結果毒種對豚鼠紅細胞凝集價應不低于1:512。I. 2. 2病毒含量以DMEM培養液將毒種作連續10倍系列稀釋，每個稀釋度取100 ill加入96孔細胞培養板中，每個稀釋度作8個重復，隨后加入消化分散的ST細胞懸浮，每孔100 u I (細胞含量以3父105/1^)，并設正常細胞培養對照，置371、含5%的CO2培養箱中培養，逐日觀察細胞病變(CPE)，細胞固縮，聚集，顆粒增多，有的細胞融合、脫落、出現較多空隙則判為CPE。觀察7日，記錄細胞病變的孔數，按照Reed-Muench法計算病毒的TCID5(I。結果每毫升病毒液不低于IO6 0TCID500I. 2. 3 毒力病毒代次為豬細小病毒BQ-C株第7 10代細胞毒；攻毒劑量為每暈升病毒含量應不低于IO6 tlTCID5ci;程序是健康陰性初產母豬4頭，妊娠35天后分別肌肉注射豬細小病毒BQ-C株第7 10代細胞毒2ml、滴鼻2ml，病毒含量分別為3 X 106_tlTCID5tl ;判定標準是攻毒后40天剖殺，損失胎豬25%以上，或者有3/5母豬發生繁殖障礙(死胎、木乃伊胎和溶胎)。I. 2. 4免疫原性將毒種同步接種ST細胞進行增殖,收獲病毒液，用BEI滅活后,加Montanide ISA15AVG佐劑混合乳化制成水包油型滅活疫苗，用健康易感初產母豬(PPV HI抗體效價不高于1:8) 5頭，配種前肌肉注射按本規程制苗2ml，在妊娠后35 40日，連同條件相同的對照豬5頭，滴鼻并經肌肉注射豬細小病毒BQ-C株各2ml ( IO6 qTCID5q)，攻毒后40日剖殺所有豬。對照組應至少4頭出現死胎、木乃伊胎或胎兒重吸收等繁殖障礙癥狀，免疫組應至少4頭保護。I. 2. 5純凈檢驗對建立的豬細小病毒BQ-C株的原始種子批第10 11代、基礎種子批第12 21代和生產種子批第22 25代進行了細菌、霉菌、支原體檢驗，并對第11、12和24代次毒種進行了外源病毒的檢驗，結果表明，本發明建立的原始種子批、基礎種子批、生產種子批均無細菌、霉菌、支原體和外源病毒污染，均純凈。I. 2. 6 特異性用DMEM液將毒種稀釋至200TCID5(l/0. 1ml，與滅活的抗豬細小病毒特異性血清等量混勻，置37°C中和I小時，同步接種生長良好的ST細胞3瓶(細胞含量以3X 105/ml)，同時設病毒對照、正常細胞對照和陰性血清對照，置37°C、含5%的CO2培養箱中，培養5 7日。中和病毒組和正常細胞對照組均應不出現細胞病變(CPE);病毒對照組和陰性血清對照組均應出現CPE。I. 2. 7毒種使用代次 將原始分離得到的豬細小病毒BQ-C株，在ST細胞上連續傳40代(即在菌種保藏編號為CGMCC No. 6091的菌株基礎上連續傳代33代)，測定了每一代病毒的TCID5tl，選擇第15、20、25、30、35、40代病毒分別滅活后制成疫苗，接種5月齡后備豬，妊娠35天時進行攻毒。結果表明，病毒在ST細胞上傳代，第7代以后(包括第7代病毒，即菌種保藏編號為CGMCC No. 6091的病毒株)各代次病毒含量穩定，均不低于106_ ciTCID5tl，且HA效價均在29以上，已經達到了做疫苗的標準。攻毒試驗表明，第15、20、25、30代病毒制備的疫苗免疫豬在對BQ-C株攻擊的保護性無顯著差異，胎兒均健康存活；第35和40代病毒制備的疫苗免疫后攻毒各有2頭和I頭死胎，而對照組4頭豬均有不同程度的死胎和弱胎。根據以上結果，為保證生產毒種良好的免疫原性和安全性，本發明確定了病毒的傳代最高次數在27代，原始毒種為7 11代，基礎毒種為第12 21代，生產用毒種最高傳代次數限制在3代(第22 25代)以內。I. 2. 8毒種保存期的確定將豬細小病毒BQ-C株濕毒保存在_20°C和_70°C下，于保存后不同時間取樣進行HA效價和TCID5tl測定，結果顯示濕毒于_20°C凍存18個月、于-70°C保存30個月時毒價開始明顯下降；凍干毒保存在_20°C和-70°C下，于保存后每年取樣進行HA效價和TCID5tl測定。結果在_20°C下保存36個月的病毒的效價略有下降，保存48個月病毒的HA效價和TCID5tl值明顯下降，而在_70°C下保存48個月病毒的HA效價和TCID5tl沒有明顯的變化，保存60個月下降明顯。考慮到在病毒保存時存在的其他不利因素，保證病毒保存期可靠性，所以將豬細小病毒BQ-C株濕毒在_20°C的保存期定為12個月，在-70°C的保存期定為24個月；將豬細小病毒凍干毒在_20°C的保存時間定為36個月；凍干毒在_70°C的保存時間為48個月。2生產用細胞2. I細胞來源ST細胞，購自中國(武漢)典型培養物保藏中心，由中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所保存。2. 2細胞的選擇在病毒的培養過程中本發明選用了傳代細胞系PK-15及ST進行病毒的增殖，結果病毒在ST細胞上的病變時間早，增殖滴度最高，豬細小病毒BQ-C株(CGMCC No. 6091)在ST細胞上的增值規律如圖I所示，豬細小病毒BQ-C株(CGMCC No. 6091)感染ST細胞后的一步生長曲線如圖2所示。國外學者也有報告選擇ST細胞進行PPV的增殖比較好，所以選擇了 ST細胞進行病毒的增殖。2. 3細胞系的建立制苗用細胞系選用ST細胞。傳代范圍控制在40 55代，本發明建立了原始細胞庫、基礎細胞庫和工作細胞庫。其中原始細胞庫共分裝55瓶；基礎細胞庫分裝370瓶；工作細胞庫共分裝了 350瓶。對各個代次的細胞都按《中國獸藥典》附錄進行檢驗，應無細菌、霉菌、支原體和外源病毒的污染。2. 4細胞系的鑒定根據現行《中國獸藥典》附頁中有關“生產、檢驗用細胞標準”規定進行檢驗，均符合標準。具體見“ST細胞系的鑒定試驗報告”。實施例2滅活疫苗的制備豬細小病毒滅活疫苗(BQ-C株)的制備工藝流程是按照目前已經成熟的商品化疫苗制備工藝制備。從實驗室制備的3批疫苗和中間試制的5批疫苗質檢結果來看，用該工藝流程制備的疫苗產品質量穩定，效檢結果完全符合所制定的質量標準。I病毒液的制備在病毒繁殖過程中，很多因素會影響細胞及病毒的增殖。PPV的復制需要宿主細胞的DNA聚合酶，最適宜在具有旺盛增殖能力并處于有絲分裂時期的細胞內增殖，因此在進行PPV繁殖時采用與細胞同時接種培養；培養液中血清濃度顯著影響著病毒的復制，經過一系列比較試驗，選用細胞培養液血清濃度為10%，維持液血清濃度為2 %，能夠繁殖穩定的，高滴度的病毒液；另外對培養液的PH值、細胞濃度、病毒接種劑量、收毒時間等進行了比較試驗，結果顯示病毒繁殖時細胞維持液PH值控制在7. 2 7. 4之間、接毒時細胞濃度選擇I X IO5個/ml 5X IO5個/ml、細胞接毒劑量為1% (v/v)病毒含量為106 0TCID50/ml以上的種毒、病毒最佳收獲時間為72 96小時，均能獲得高病毒含量的病毒液。在本實施例中選用細胞培養液(商品名是1640，購自Gibco公司)中血清濃度為10%，pH值控制在7. 3，維持液(商品名是MEM，購自上海滬峰生物科技有限公司)中血清濃度為2%，接毒時ST細胞濃度為3X IO5個/ml，按照1% (v/v)的細胞接毒劑量接入病毒含量為106_°TCID5(l/ml的豬細小病毒BQ-C株第7代病毒株(菌種保藏編號為CGMCC No. 6091)、病毒收獲時間為72小時。2滅活工藝選擇終濃度為0. 1%,0. 2%,0. 3%、0. 4%的甲醛溶液和終濃度為0. 1%,0. 2%,
0.3%、0. 4%的二乙烯亞胺(BEI)對豬細小病毒進行滅活比較試驗，試驗結果表明，0. 3%的BEI在32°C條件下96小時后可將豬細小病毒完全滅活，而且，試驗結果表明BEI對細胞的損傷較小；PPV抗原加入0. 3%的甲醛溶液，經37°C滅活48小時亦可達到完全滅活病毒的目的；但甲醛具有強刺激性，如果疫苗中殘留游離的甲醛進入動物機體，會產生不良反應。因而最終確定用0. 3%的BEI在32°C條件下滅活豬細小病毒96小時后，加入0. 02%硫代硫酸鈉終止滅活。3乳化工藝 采用法國賽比克公司的商品化Montanide ISA15AVG佐劑，除菌后可直接用于疫苗乳化制備；乳化前將滅活的同批病毒液解凍混合，在無菌室內用勻漿機以200r/min攪拌均勻，然后按照水相抗原與油相佐劑8. 5 I. 5的體積配比；乳化程序為先將水相放入乳化器中進行攪拌，然后緩緩加入油相佐劑，以800r/min連續攪拌30分鐘；生產得到的疫苗屬水包油劑型，為了穩定界面和消除氣泡，獲得最佳乳化效果，需要靜止30分鐘后分裝。4半成品檢驗質量標準4. I無菌檢驗按現行《中國獸藥典》附錄進行檢驗，應無菌生長。4. 2病毒含量測定以DMEM培養液將毒種作連續10倍系列稀釋，每個稀釋度取100 U I加入96孔細胞培養板中，每個稀釋度作8個重復，隨后加入消化分散的ST細胞懸浮，每孔100 u I (細胞 含量以3X 105/ml左右為宜)，并設正常細胞培養對照，置37°C、含5%的CO2培養箱中培養，逐日觀察細胞病變(CPE)，細胞固縮，聚集，顆粒增多，有的細胞融合、脫落、出現較多空隙則判為感染。記錄細胞病變的孔數，按照Reed-Muench法計算病毒的TCID5tlt5結果每毫升病毒液不低于IO6 0TCID5004. 3滅活檢驗取滅活后的病毒液，按病毒液與生長液I : 10的比例接種于ST細胞3瓶(細胞含量以3X105/ml)，37°C培養觀察5日，對無病變者再盲傳2代，同時設病毒對照。結果無細胞病變。實驗室生產的3批半成品均合格。5關于成品檢驗質量標準5. I安全檢驗標準為了保證疫苗的安全性，本發明對實驗室制備的5批疫苗先后進行了“對小白鼠的安全性試驗”、“對仔豬單劑量接種、單劑量重復接種、一次性超劑量(2倍劑量)接種的安全性試驗”、“對后備母豬單劑量接種、單劑量重復接種、一次性超劑量(2倍劑量)接種的安全性試驗”、對妊娠母豬單劑量接種、單劑量重復接種、一次性超劑量(2倍劑量)接種的安全性試驗”。試驗結果表明各免疫動物單劑量接種、單劑量重復接種、一次性大劑量接種后，豬只狀態均良好，采食飲水正常，無異常反應；疫苗接種后對妊娠母豬的繁殖功能也無明顯影響。以上試驗均證明疫苗是安全的。通過試驗觀察本發明總結出只要接種疫苗后21日內不出現局部紅腫、潰瘍、糜爛以及神經萎縮、采食減少等現象，以后就不會出現因為疫苗接種而引起的不良反應，就可以證明疫苗的安全性。因此，在試行規程(草案)中規定用10 20kg健康易感仔豬(HI抗體效價不高1:8)2頭，各深部肌肉注射疫苗4ml，另取條件相同的2頭豬不接種作為對照，連續觀察21日。在觀察期內應不出現由疫苗注射引起的任何局部或全身不良反應。5. 2效力檢驗標準的制定5. 2. I抗體效價與免疫攻毒保護相關性試驗將安全性試驗合格的I批豬細小病毒滅活疫苗0701，按照不同劑量0. 5ml/頭份、Iml/頭份、2ml/頭份、4ml/頭份分別免疫3 5月齡的健康后備母豬(PPV HI抗體不高于8)，并以106_°TCID5(l/ml PPV BQ-C株第10代強毒4ml攻擊，以確定HI抗體滴度與免疫攻毒保護的相關性。試驗結果表明，當血清HI抗體效價在不低于1:64時，母豬產仔成活率達97. 5%，其中一組中有一頭豬仔流產，但PCR檢測仔豬病毒分離率為0，也無其他引起母豬流產的病原感染。以上結果表明在試驗條件下，當血清HI抗體效價在不低于1:64時，能有效阻止病毒經母體垂直傳給胎兒。因而確定疫苗效力檢驗時，檢驗標準為免疫28日后，其血清HI抗體效價不低于1:64。5. 2. 2最小免疫劑量和最小使用劑量試驗將安全性試驗合格的3批豬細小病毒滅活疫苗0701、0702和0703，按照不同劑量
0.5ml/頭份、lml/頭份、I. 5ml/頭份、2ml/頭份分別免疫3 5月齡的健康后備母豬(PPVHI抗體不高于8)，于免疫后28日采血進行HI抗體檢測。結果顯示，以Iml/頭份劑量免疫豬28日后HI抗體效價平均值不低于1:64，而I. 5ml/頭份以上劑量免疫豬28日后HI抗體效價均不低于1:64。根據HI抗體效價與攻毒保護相關性試驗結果，確定在免疫后28天豬細小病毒HI抗體效價達到1:64以上時，可以完全保護懷孕母豬抵抗豬細小病毒強毒的攻擊。考慮到疫苗的保存、運輸和使用過程中可能存在的效價降低因素。本發明將豬細小病毒滅活疫苗(BQ-C株)的最小免疫劑量確定為I. 5ml/頭份，使用劑量確定為2. Oml/頭份。5. 2. 3免疫豚鼠與免疫豬HI抗體相關性試驗 將實驗室生產的3批豬細小病毒滅活疫苗0701、0702和0703分別免疫豚鼠和豬，進行HI抗體效價檢測，分析豚鼠與豬的HI抗體相關性。結果表明，當豚鼠免疫0. 5ml/只、豬免疫2ml/只，28日后其血清HI抗體效價均不低于1:64，二者有明顯的平行關系。試驗結果證明可以用實驗動物豚鼠代替靶動物(豬)進行效力檢驗。因此，根據以上結果，本發明將本產品的效力檢驗標準定為用體重350g 400g成年豚鼠(PPV HI抗體效價不高于1:8) 5只，各肌肉注射疫苗0.5ml，28日后，連同對照豚鼠4只，一并采血，測定PPV HI抗體效價。對照豚鼠HI抗體效價應不高于1:8，免疫豚鼠至少應有4只出現抗體反應，且HI抗體效價應不低于1:64。用3月齡健康易感豬(PPV HI抗體效價不高于1:8) 5頭，各深部肌肉注射疫苗2ml, 28日后，連同對照豬4頭，一并采血，測定PPV HI抗體效價。對照豬HI抗體效價應不高于8，注苗豬應全部出現抗體反應，且HI抗體效價應不低于1:64。6抗體消長規律與免疫持續期試驗將安全性試驗合格的3批豬細小病毒滅活疫苗0701、0702和0703分別免疫健康后備母豬、經產豬和公豬。為進一步掌握免疫效力及免疫持續期，制定合理的免疫程序，保證免疫豬群保持高而持久的抗體水平，對免疫豬不同時間進行抗體檢測，以掌握其抗體消長規律。試驗結果表明，3 5月齡初產母豬免疫2ml/頭份，2 3周后加強免疫一次，經產母豬于配種前一個月免疫2ml/頭份，28日后其血清HI抗體不低于1:64，免疫后抗體高峰在2 6個月內，其后抗體水平逐漸下降，至9個月仍達1:64，為保證疫苗的免疫保護效果，確定其免疫持續期為7個月。7免疫程序的確定根據仔豬母源抗體的持續時間，初次免疫應在5 6月齡，因為這時母源抗體已下降到較低水平(HI抗體效價低于1:64)。而且后備母豬配種時間一般為6月齡，這樣在5 6月齡時免疫也正好可以避免母豬在妊娠時遭受強毒攻擊。對于經產母豬由于其體內抗體的持續存在，豬細小病毒對其往往不構成威脅，所以在以前一般不進行免疫，但近幾年由于臨床發病的復雜性，如豬細小病毒往往會加重豬圓環病毒的感染等，所以本發明主張對經產母豬在妊娠前進行免疫，這樣可以保護妊娠母豬在整個妊娠期避免豬細小病毒強毒的攻擊。
根據后備母豬的配種時間、后備母豬免疫后的抗體消長規律、免疫期，同時結合臨床上豬細小病毒感染的實際情況，本發明確定了豬細小病毒滅活疫苗(BQ-C株)的免疫程序為初產母豬5 6月齡免疫I次，2 4周后加強免疫I次；經產母豬于配種前3 4周免疫I次；公豬每年免疫兩次。每次免疫均為2ml/頭。8疫苗的保存期本發明對實驗室制備的3批滅活疫苗(0701、0702、0703)保存期進行了試驗研究，將3批疫苗在2 8°C條件下保存9、12、15、18個月，在各個時間段分別取樣對其性狀、安全性及免疫效力檢測。結果顯示，3批疫苗在2 8°C條件下保存18個月性狀不發生明顯變化，無菌檢驗和安全性都符合質量標準的要求。效力檢驗中0701批疫苗保存18個月樣品免疫豚鼠后有一只豚鼠HI抗體效價為1:32 ；0701和0702批疫苗保存18個月樣品免疫豬后均有一頭豬HI抗體效價為1:32，但免疫豬平均HI抗體水平為1:64，考慮到疫苗在運輸和使用過程中造成的效價損耗，本發明將疫苗的保存期定為2 8°C條件下保存15個月。 9與國內同類商品苗的免疫效力比較將實驗室試制的3批疫苗0701、0702和0703與市售疫苗A (批號20071228)和B (批號20071205)，分別免疫350g 400g健康豚鼠及5 6月齡健康后備豬，28日后其血清HI抗體效價均不小于1:64，達到攻毒保護要求，實驗室制備的疫苗HI抗體平均值略高于市售A疫苗，明顯高于市售B疫苗。分別在免疫前、免疫后3、6、9、12個月靜脈采血分離血清，檢測抗體產生情況。結果表明在免疫后6個月內，實驗室試制的疫苗和市售A和B疫苗免疫豬，HI抗體效價均在1:64以上，均能達到攻毒保護要求。而6個月后市售B疫苗免疫豬HI抗體下降明顯。以上所述僅為本發明的優選實施例，對本發明而言僅是說明性的，而非限制性的；本領域普通技術人員理解，在本發明權利要求所限定的精神和范圍內可對其進行許多改變，修改，甚至等效變更，但都將落入本發明的保護范圍內。
權利要求
1.豬細小病毒，命名為豬細小病毒BQ-C株，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其菌種保藏編號為=CGMCC No. 6091。
2.權利要求I所述的豬細小病毒在制備豬細小病毒滅活疫苗中的應用。
3.一種豬細小病毒滅活疫苗，其特征在于含有滅活后的權利要求I所述的豬細小病毒。
4.如權利要求3所述的滅活疫苗，其特征在于所述的滅活是指將權利要求I所述的豬細小病毒采用0. 3%的二乙烯亞胺(BEI)在32°C條件下滅活96小時后，加入0. 02%硫代硫酸鈉終止滅活。
5.權利要求3或4所述的滅活疫苗在制備預防由豬細小病毒引起的疾病的生物制品中的應用。
6.如權利要求5所述的應用，其特征在于所述的疾病為初產健康陰性母豬發生的母豬繁殖障礙。
全文摘要
本發明公開了豬細小病毒BQ-C株及其在制備豬細小病毒滅活疫苗中的應用，屬于生物疫苗領域。本發明的豬細小病毒BQ-C株具有免疫原性好、培養特性好等優點，將本發明的豬細小病毒(BQ-C株)接種ST細胞，收獲培養物，用二乙烯亞胺(BEI)滅活后，與法國賽比克公司的商品化MontanideTM ISA15AVG佐劑混合乳化制成豬細小病毒滅活疫苗。實驗證明，使用本發明制備得到的豬細小病毒滅活疫苗免疫初產健康陰性母豬能夠預防由豬細小病毒引起的疾病，而且此疫苗具有安全、產生抗體快、免疫期持久等優點。
文檔編號C12R1/93GK102719407SQ20121016645
公開日2012年10月10日 申請日期2012年5月25日 優先權日2012年5月25日
發明者崔尚金 申請人:中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所