專利名稱：：包含白喉毒素無毒突變體crm197或其片段的融合蛋白的制作方法
技術領域：
：本發明涉及分子病毒學和免疫學領域。具體而言，本發明涉及白喉毒素無毒突變體CRM197或其片段在融合蛋白中作為分子內佐劑增強與其融合的目的蛋白(例如HEV衣殼蛋白、流感病毒M2蛋白或其免疫原性片段)的免疫原性的用途。本發明還涉及增強目的蛋白(例如衣殼蛋白、流感病毒M2蛋白或其免疫原性片段)的免疫原性的方法，其包括將CRM197或其片段與目的蛋白融合表達，形成融合蛋白。本發明還涉及包含CRM197或其片段以及目的蛋白(例如JEV衣殼蛋白、流感病毒M2蛋白或其免疫原性片段)的融合蛋白，其中CRM197或其片段增強了目的蛋白的免疫原性。本發明還涉及編碼所述融合蛋白的分離的核酸，包含所述核酸的構建體和載體，以及包含所述核酸的宿主細胞。本發明還涉及所述融合蛋白的用途，其用于制備藥物組合物或疫苗。
背景技術：
：已對白喉毒素(diphtheriatoxin,DT)進行了深入的研究。結構研究顯示，白喉毒素由三個結構域組成N端的催化結構域C(aa1-190，Cdomain)(其也稱為A片段)，中間轉膜結構域T(aa201-384，Tdomain)，以及C端的受體結合位點結構域R(aa386-535，Rdomain)(ChoeS，BennettM,FujiiG,etal.,Nature.1992.357:216222)。利用白喉毒素的前兩個結構域與白介素2(IL-2)融合而制備的ONTAK(DAB389-IL-2)在1999年被美國FDA批準上市,用于成人皮膚T細胞淋巴瘤的治療。這證實白喉毒素的三個結構域可以進行拆分并發揮其各自的功能。CRM197(Cross-ReactingMaterials197)是白喉毒素的一種無毒突變體(Uchida,T.,A.M,Pappenheimer,Jr.,R.Gregory,etal.,J.Biol.Chem.1973.248:3838-3844)，其與編碼DT的野生型基因相比存在單個核苷酸突變，導致第52位的氨基酸殘基由Gly變為Glu(G.Giannini,R.Rappuoli,G.Rattietal.,NucleicAcidsResearch.1984.12:4063-4070)。研究表明，CRM197雖然具有與野生型DT類似的結構(即，具有上述3個結構域)，但其A片段喪失了與NAD結合的能力，不能結合EF2并因而喪失了天然DT所具有的細胞毒性，這表明第52位氨基酸殘基Gly在DT與NAD的結合中起著重要作用(K.Moyner,G.Christiansen,ActapathmicrobialimmunolscandsectC.1984，92:17-23)。CRM197雖然喪失了細胞毒性，但其卻保留了與野生型DT相當的、極強的免疫原性，因此其常被用作蛋白載體，用于與其他半抗原交聯從而制備結合疫苗。早在1985年，Porter等人就將Hib表面的多糖分別交聯至CRM197和DT蛋白載體并制成疫苗，并且研究兩者的免疫原性的差異。實驗結果表明，兩種交聯疫苗的免疫效果沒有顯著差異，二者都能刺激幼兒機體產生較強的免疫反應和免疫記憶(PorterAnderson,MichealE.PichicheroandRichardA.J.Clin.Invest.1985:52—59)。在比較與各種蛋白載體交聯的肺炎球菌結合疫苗后發現，以CRM197為蛋白載體的疫苗在動物實驗和臨床試驗中均能產生較好的免疫效果，且CRM197安全，無毒負作用(Black，S.，H.Shinefield,etal.PediatrInfectDisJ,2000，19(3);187-195)。目前以CRM197為蛋白載體的肺炎球菌結合疫苗主要有PCV7、PCV9，PCV13等。臨床試驗結果證明，這些疫苗在2歲以下的兒童中均具有較好的免疫原性和安全性(Barricarte,A.,J.Castilla,etal.ClinInfectDis,2007，44(11):1436-1441；Madhi,S.,P.Adrian,etal.Vaccine,2007,25(13):2451-2457；Duggan,S.T.Drugs,2010,70(15):1973-1986)。將CRM197與腦膜炎奈瑟氏菌(N.menigitidis)表面多糖交聯可制備流行性腦膜炎的結合疫苗。例如，以CRM197為蛋白載體的Meningitec(WyethPharmaceuticals)、Menjugate(Novartisvaccines)>Menveo(Novartisvaccines)等疫苗已經上市。CRM197雖然失去酶活性和細胞毒性，但仍可與DT的特異受體HB-EGF(heparin-bindingEGF-Iikegrowthfactor,肝素結合性表皮生長因子)結合。因為這種受體一般在癌變組織中表達上調，所以CRM197與DT—樣具有抗腫瘤效應(Buzzi,S.,D.Rubboli,etal.Immunotherapy,2004,53(11))。石開究還發現,CRM197能透過血腦屏障(Blood-Brain-BarrierBBB),從而可以用作腦部藥物投遞的載體(Gaillard，P.J.,andA.G.deBoer.JControlRelease,2006,116(2):60-62)。雖然已報道CRM197具有多種功能，尤其是具有較強的免疫原性而可用作免疫佐齊U，但是迄今為止從未報道過，CRM197可以用作分子內佐劑在融合蛋白中增強與其融合的目標蛋白的免疫原性。本發明以戊型肝炎衣殼蛋白為例，首次證實了CRM197或其片段在融合蛋白中能夠增強與其融合的蛋白的免疫原性，從而可用作分子內佐劑。
發明內容在本發明中，除非另有說明，否則本文中使用的科學和技術名詞具有本領域技術人員所通常理解的含義。并且，本文中所用的細胞培養、分子遺傳學、核酸化學、生物化學、免疫學實驗室操作步驟均為相應領域內廣泛使用的常規步驟。同時，為了更好地理解本發明，下面提供相關術語的定義和解釋。根據本發明，術語“CRM197”是指白喉毒素的一種無毒突變體，其與野生型白喉毒素相比，差異在于第52位的氨基酸殘基由GIy變為Glu(G.Giannini,R.Rappuoli,G.Rattietal.,NucleicAcidsResearch.1984.12:4063-4070)。白喉毒素是本領域技術人員熟知的(參見例如，ChoeS,BennettM,FujiiG,etal.，Nature.1992.357:216-222),其氨基酸序列可見于例如GenBank登錄號AAV70486.I。在本發明中，CRM197的示例性氨基酸序列提供于SEQIDN0:2中。因此，在本發明中，當涉及CRM197的序列時，其使用SEQIDNO:2所示的序列來進行描述。例如，表述“CRM197的第1-190位氨基酸殘基”中的第1-190位氨基酸殘基是指，SEQIDNO:2的第1-190位氨基酸殘基。然而，本領域技術人員理解，可在SEQIDN0:2中天然產生或人工引入突變或變異(包括但不限于，置換，缺失和/或添加)，而不影響CRM197生物學特性。因此，在本發明中，術語“CRM197”意欲包括所有此類多肽和變體，包括SEQIDN0:2所示的多肽以及其天然或人工的變體，所述變體保留了CRM197的生物學特性，即，具有強免疫原性且無細胞毒性。并且，當描述CRM197的序列片段時，其不僅包括SEQIDN0:2所示的多肽的序列片段，還包括該多肽的天然或人工變體中的相應序列片段。例如，表述“CRM197的第1-190位氨基酸殘基”意欲包括，SEQIDNO:2的第1-190位氨基酸殘基，以及SEQIDNO:2所示的多肽的變體(天然或人工)中的相應片段。根據本發明，戊型肝炎病毒OfepatitiSEvirus,HEV)衣殼蛋白是指由HEV0RF2編碼的蛋白。0RF2的序列是本領域公知的(參見，例如DDBJ數據登錄號D11092)。在本發明中，當涉及0RF2的序列時，其使用DDBJ數據登錄號D11092所示的序列來進行描述。例如，表述“HEV0RF2編碼的多肽的第368-606位氨基酸殘基”中的第368-606位氨基酸殘基是指，D11092編碼的多肽的第368-606位氨基酸殘基。然而，本領域技術人員理解，在HEV0RF2或其編碼的多肽中，可天然產生或人工引入突變或變異(包括但不限于，置換，缺失和/或添加)，而不影響其生物學功能(例如抗原性，免疫原性等等)。因此，在本發明中，術語“ffiV0RF2”應包括所有此類序列和其變體，包括例如D11092所示的序列以及其天然或人工的變體。并且，當描述HEV0RF2(或其編碼的多肽)的序列片段時，其不僅包括D11092(或其編碼的多肽)的序列片段，還包括D11092(或其編碼的多肽)的天然或人工變體中的相應序列片段。例如，表述“HEV0RF2編碼的多肽的第368-606位氨基酸殘基”包括，Dl1092編碼的多肽的第368-606位氨基酸殘基，以及Dl1092編碼的多肽的變體(天然或人工)中的相應片段。HEV衣殼蛋白的示例性氨基酸序列(Dl1092中的0RF2所編碼的多肽)描述于SEQIDN0:31中。根據本發明，流感病毒(Influenzaviruses)M2蛋白是指由A型或B型流感病毒基因組第七節段編碼或C型流感病毒基因組第六節段編碼的蛋白。流感病毒M2蛋白的示例性氨基酸序列描述于SEQIDNO:32中。根據本發明，表述“相應序列片段”或“相應片段”是指，當對序列進行最優比對時，即當序列進行比對以獲得最高百分數同一性時，進行比較的序列中位于等同位置的片段。根據本發明，當在蛋白/多肽的背景中使用時，術語“變體”是指這樣的蛋白，其氨基酸序列與參照蛋白/多肽(例如，本發明的CRM197)的氨基酸序列相比，具有一個或多個(例如1-10個或1-5個或1-3個)氨基酸差異(例如，保守氨基酸置換)，或者具有至少60%，80%，85%，90%,95%，96%，97%，98%，或99%的同一性，并且其保留了參照蛋白/多肽的必要特性。在本發明中，CRM197的必要特性可以指，具有強免疫原性且無細胞毒性；HEV衣殼蛋白和流感病毒M2蛋白的必要特性可以指其抗原性和/或免疫原性。根據本發明，術語“同一性”用于指兩個多肽之間或兩個核酸之間序列的匹配情況。當兩個進行比較的序列中的某個位置都被相同的堿基或氨基酸單體亞單元占據時(例如，兩個DNA分子的每一個中的某個位置都被腺嘌呤占據，或兩個多肽的每一個中的某個位置都被賴氨酸占據)，那么各分子在該位置上是同一的。兩個序列之間的“百分數同一性”是由這兩個序列共有的匹配位置數目除以進行比較的位置數目XlOO的函數。例如，如果兩個序列的10個位置中有6個匹配，那么這兩個序列具有60%的同一性。例如，DNA序列CTGACT和CAGGTT共有50%的同一性(總共6個位置中有3個位置匹配)。通常，在將兩個序列比對以產生最大同一性時進行比較。這樣的比對可通過使用，例如，可通過計算機程序例如Align程序(DNAstar，Inc.)方便地進行的Needleman等人(1970)j.Mol.Biol.48443-453的方法來實現。還可使用已整合入ALIGN程序(版本2.0)的E.Meyers和W.Miller(Comput.ApplBiosci.,4:11-17(1988))的算法，使用PAM120權重殘基表(weightresiduetable)、12的缺口長度罰分和4的缺口罰分來測定兩個氨基酸序列之間的百分數同一性。此外，可使用已整合入GCG軟件包(可在www.gcg.com上獲得)的GAP程序中的Needleman和Wunsch(JMoIBiol.48:444-453(1970))算法，使用Blossum62矩陣或PAM250矩陣以及16、14、12、10、8、6或4的缺口權重(gapweight)和1、2、3、4、5或6的長度權重來測定兩個氨基酸序列之間的百分數同一性。如本文中使用的，術語“保守置換”意指不會不利地影響或改變包含氨基酸序列的蛋白/多肽的必要特性的氨基酸置換。例如，可通過本領域內已知的標準技術例如定點誘變和PCR介導的誘變引入保守置換。保守氨基酸置換包括用具有相似側鏈的氨基酸殘基替代氨基酸殘基的置換，例如用在物理學上或功能上與相應的氨基酸殘基相似(例如具有相似大小、形狀、電荷、化學性質，包括形成共價鍵或氫鍵的能力等)的殘基進行的置換。已在本領域內定義了具有相似側鏈的氨基酸殘基的家族。這些家族包括具有堿性側鏈(例如，賴氨酸、精氨酸和組氨酸)、酸性側鏈(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不帶電荷的極性側鏈(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非極性側鏈(例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、^分支側鏈(例如，蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳香族側鏈(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)的氨基酸。因此，優選用來自相同側鏈家族的另一個氨基酸殘基替代相應的氨基酸殘基。鑒定氨基酸保守置換的方法在本領域內是熟知的(參見,例如，Brummell等人，Biochem.32:1180-1187(1993);Kobayashi等人ProteinEng.12(10):879-884(1999);和Burks等人Proc.NatlAcad.SetUSA94:412-417(1997)，其通過引用并入本文)。根據本發明，術語“免疫原性(immunogenicity)”是指,能夠刺激機體形成特異抗體或致敏淋巴細胞的能力。其既指，抗原能刺激特定的免疫細胞，使免疫細胞活化、增殖、分化，最終產生免疫效應物質如抗體和致敏淋巴細胞的特性，也指抗原刺激機體后，機體免疫系統能形成抗體或致敏T淋巴細胞的特異性免疫應答。免疫原性是抗原最重要的性質，一種抗原能否成功地誘導宿主產生免疫應答取決于三方面的因素抗原的性質、宿主的反應性和免疫方式。根據本發明，術語“免疫原性片段”是指這樣的多肽片段，其至少部分地保留了所源自的蛋白的免疫原性。例如，衣殼蛋白的免疫原性片段是指，HEV衣殼蛋白的至少部分地保留了免疫原性的片段，例如本發明中描述的HEV-239，E2或E2s等(參見，Li等人，JBiolChem.280(5):3400-3406(2005);Li等人，PLoSPathogens.5(8):el000537(2009))；流感病毒M2蛋白的免疫原性片段是指，M2蛋白的至少部分地保留了免疫原性的片段，例如本發明中描述的M2e(參見，FiersW等人，Vaccine.27(45):6280-6283(2009))。根據本發明，HEV-239(或簡稱239)是指由HEV0RF2編碼的多肽(即，HEV衣殼蛋白)的第368-606位氨基酸殘基組成的多肽；E2是指由HEV0RF2編碼的多肽的第394-606位氨基酸殘基組成的多肽；E2s指由HEV0RF2編碼的多肽的第455-606位氨基酸殘基組成的多肽。根據本發明，術語“M2e”是指，由流感病毒M2蛋白的第1_24位氨基酸殘基組成的多肽。在本發明中，術語“多肽”和“蛋白質”具有相同的含義，可互換使用。并且在本發明中，氨基酸通常用本領域公知的單字母和三字母縮寫來表示。例如，丙氨酸可用A或Ala表不。根據本發明，術語“大腸桿菌表達系統”是指由大腸桿菌(菌株)與載體組成的表達系統，其中大腸桿菌(菌株)來源于市場上可得到的菌株，例如但不限于GI698，ER2566，BL21(DE3)，B834(DE3)，BLR(DE3)。根據本發明，術語“載體(vector)”是指，可將多聚核苷酸插入其中的一種核酸運載工具。當載體能使插入的多核苷酸編碼的蛋白獲得表達時，載體稱為表達載體。載體可以通過轉化，轉導或者轉染導入宿主細胞，使其攜帶的遺傳物質元件在宿主細胞中獲得表達。載體是本領域技術人員公知的，包括但不限于質粒；噬菌體；柯斯質粒等等。根據本發明，術語“色譜層析”包括但不限于離子交換色譜(例如陽離子交換色譜)、疏水相互作用色譜、吸附層析法(例如羥基磷灰石色譜)、凝膠過濾(凝膠排阻)層析、親和層析法。根據本發明，術語“藥學可接受的載體和/或賦形劑”是指在藥理學和/或生理學上與受試者和活性成分相容的載體和/或賦形劑，其是本領域公知的(參見例如Remington’sPharmaceuticalSciences.EditedbyGennaroAR,19thed.Pennsylvania:MackPublishingCompany,1995),并且包括但不限于pH調節劑，表面活性劑，佐劑，離子強度增強劑。例如，PH調節劑包括但不限于磷酸鹽緩沖液；表面活性劑包括但不限于陽離子，陰離子或者非離子型表面活性劑，例如Tween-80;離子強度增強劑包括但不限于氯化鈉。根據本發明，術語“佐劑”是指非特異性免疫增強劑，當其與抗原一起或預先遞送入機體時，其可增強機體對抗原的免疫應答或改變免疫應答類型。佐劑有很多種，包括但不限于鋁佐劑(例如氫氧化鋁)、弗氏佐劑(例如完全弗氏佐劑和不完全弗氏佐劑)、短小棒狀桿菌、脂多糖、細胞因子等。弗氏佐劑是目前動物試驗中最常用的佐劑。氫氧化鋁佐劑則在臨床實驗中使用較多。根據本發明，術語“分子內佐齊『是指這樣的佐劑，其與目的蛋白(即，抗原)形成融合蛋白，從而其與抗原存在于一個相同的分子(即，包含其與抗原的融合蛋白)中，并充當該抗原的佐劑以增強該抗原的免疫原性。即，分子內佐劑是能夠增強與之融合表達的目的蛋白(抗原)的免疫原性的佐劑，其通常為多肽片段。在本發明中，分子內佐劑特別地是指白喉毒素無毒突變體CRM197或其片段。將兩種或更多種蛋白融合表達以形成融合蛋白的技術是本領域公知的(參見例如，J.Samtoook等人，分子克隆實驗室手冊，第2版，冷泉港實驗室出版社，1989，以及F.M.Ausubel等人,精編分子生物學實驗指南,第3版,Johnffiley&Sons,Inc.,1995)。通常，通過使用重組DNA技術將編碼兩種或更多種蛋白的DNA片段符合讀框地連接在一起，并進行蛋白質表達來獲得融合蛋白。任選地，可使用或不使用接頭來將兩種或更多種蛋白融合表達。根據本發明，術語“接頭”是指用于連接兩個分子(例如蛋白)的短肽。通常，通過將編碼該短肽的多核苷酸序列引入(例如，通過PCR擴增或連接酶)分別編碼所要連接的兩種目的蛋白的兩個DNA片段之間，并進行蛋白質表達來獲得融合蛋白，例如目的蛋白I-接頭-目的蛋白2。如本領域技術人員公知的，接頭包括但不限于柔性連接肽，例如Gly-Gly-Gly-Gly,Gly-Gly-Gly-Gly-Ser,Gly-Gly-Ser-Ser和(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3坐坐寸寸o根據本發明，術語“有效量”是指足以獲得或至少部分獲得期望的效果的量。例如，預防疾病(例如或流感病毒感染)有效量是指，足以預防，阻止，或延遲疾病(例如HEV或流感病毒感染)的發生的量；治療疾病有效量是指，足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并發癥的量。測定這樣的有效量完全在本領域技術人員的能力范圍之內。例如，對于治療用途有效的量將取決于待治療的疾病的嚴重度、患者自己的免疫系統的總體狀態、患者的一般情況例如年齡，體重和性別，藥物的施用方式，以及同時施用的其他治療等等。本發明至少部分基于發明人的出人意料的發現在將CRM197或其片段與目的蛋白(例如HEV衣殼蛋白、流感病毒M2蛋白或其免疫原性片段)融合表達后，CRM197或其片段顯著增強了目的蛋白的免疫原性。即，CRM197或其片段可以通過與目的蛋白融合表達而作為分子內佐劑增強目的蛋白的免疫原性。因此，在一個方面，本發明涉及一種融合蛋白，其包含CRM197或其片段以及目的蛋白，并且其中CRM197或其片段增強了目的蛋白的免疫原性。在一個優選實施方案中，CRM197片段例如包含，CRM197的催化結構域C(aa1-190，其在本申請中也稱為A片段)，轉膜結構域T(aa201-384)，和/或受體結合位點結構域R(aa386-535)。例如，CRM197片段可以包含A片段，或者A片段和轉膜結構域T。在另一個優選實施方案中，CRM197片段包含CRM197的aa1-190，例如包含CRM197的aa1-389。在另一個優選實施方案中，CRM197片段由CRM197的aa1-190或aa1-389組成。在本申請中，CRM197的示例性氨基酸序列示于SEQIDNO:2中，其相應的核苷酸序列示于SEQIDNO:I中。在一個優選實施方案中，目的蛋白例如可以是HEV衣殼蛋白、流感病毒M2蛋白或其免疫原性片段。在另一個優選實施方案中，HEV衣殼蛋白的免疫原性片段可以包含或者是例如HEV-239(HEV衣殼蛋白aa368-606),E2(HEV衣殼蛋白aa394-606)或E2s(HEV衣殼蛋白aa455-606)等。在另一個優選實施方案中，M2蛋白的免疫原性片段可以包含或者是例如M2e(M2蛋白aa1-24)。在一個優選實施方案中，根據本發明的融合蛋白中的CRM197或其片段可連接至目的蛋白的N端和/或C端，任選地使用接頭進行連接。用于連接2個肽段的接頭是本領域公知的，包括但不限于柔性連接肽，例如Gly-Gly-Gly-Gly,Gly-Gly-Gly-Gly-Ser,Gly-Gly-Ser-Ser和(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3等等。此類接頭是本領域公知的,并且其選擇完全在本領域技術人員的能力范圍之內。在一個優選實施方案中，根據本發明的融合蛋白可以包含CRM197或其片段，以及HEV衣殼蛋白或其免疫原性片段，二者任選地使用接頭進行連接。例如，根據本發明的融合蛋白可以是具有SEQIDN0:4，6，8，10，12，14，16或18所示氨基酸序列的蛋白。在一個優選實施方案中，根據本發明的融合蛋白可以包含CRM197或其片段，以及流感病毒M2蛋白或其免疫原性片段，二者任選地使用接頭進行連接。例如，根據本發明的融合蛋白可以是具有SEQIDNO:34，36，38，40，42或44所示氨基酸序列的蛋白。在本發明的融合蛋白中，CRM197或其片段出人意料地顯著增強了與之融合(任選地，使用接頭)的目的蛋白例如HEV衣殼蛋白、流感病毒M2蛋白或其免疫原性片段的免疫原性，從而可用作分子內佐劑。在另一個方面，本發明提供了編碼如上所定義的融合蛋白的多核苷酸。還提供的是包含此類多核苷酸的構建體。在另一個方面，本發明提供了一種載體，其包含編碼如上所定義的融合蛋白的多核苷酸或者含有此類多核苷酸的構建體。本發明的載體可以是克隆載體，也可以是表達載體。在一個優選實施方案中,本發明的載體是例如質粒，粘粒，曬菌體，柯斯質粒等等。在另一個方面，還提供了包含本發明的多核苷酸或構建體或載體的宿主細胞或者生物體。此類宿主細胞包括但不限于，原核細胞例如大腸桿菌細胞，以及真核細胞例如酵母細胞，昆蟲細胞，植物細胞和動物細胞(如哺乳動物細胞，例如小鼠細胞、人細胞等)。本發明的細胞還可以是細胞系，例如293T細胞。在一個實施方案中，所述生物體是植物或者動物。在另一個方面，本發明還涉及一種藥物組合物或疫苗，其包含根據本發明的融合蛋白，任選地還包含藥學可接受的載體和/或賦形劑。取決于融合蛋白中所使用的目的蛋白，本發明的藥物組合物或疫苗可以用于預防和/或治療各種疾病(即，能夠被目的蛋白預防和/或治療的疾病)。例如，當使用的目的蛋白是衣殼蛋白或其免疫原性片段時，本發明的藥物組合物可用于預防和/或治療HEV感染和與HEV感染相關的疾病例如戊型肝炎；當使用的目的蛋白是流感病毒M2蛋白或其免疫原性片段時，本發明的藥物組合物可用于預防和/或治療流感病毒感染和與流感病毒感染相關的疾病例如流感。在另一個方面，本發明還涉及根據本發明的融合蛋白用于制備藥物組合物的用途，所述藥物組合物用于預防和/或治療能夠被目的蛋白預防和/或治療的疾病。取決于融合蛋白中所使用的目的蛋白，本發明的藥物組合物可以用于預防和/或治療各種疾病。例如，當使用的目的蛋白是衣殼蛋白或其免疫原性片段時，本發明的藥物組合物可用于預防和/或治療感染和與HEV感染相關的疾病例如戊型肝炎；當使用的目的蛋白是流感病毒M2蛋白或其免疫原性片段時，本發明的藥物組合物可用于預防和/或治療流感病毒感染和與流感病毒感染相關的疾病例如流感。在另一個方面，本發明還涉及預防和/或治療HEV感染或與HEV感染相關的疾病例如戊型肝炎的方法，其包括施用有效量的根據本發明的融合蛋白或包含所述融合蛋白的藥物組合物，所述融合蛋白包含CRM197或其片段以及HEV衣殼蛋白或其免疫原性片段，二者任選地使用接頭進行連接。在另一個方面，本發明還涉及預防和/或治療流感病毒感染或與流感病毒感染相關的疾病例如流感的方法，其包括施用有效量的根據本發明的融合蛋白或包含所述融合蛋白的藥物組合物，所述融合蛋白包含CRM197或其片段以及流感病毒M2蛋白或其免疫原性片段，二者任選地使用接頭進行連接。在另一個方面，本發明提供了增強目的蛋白的免疫原性的方法，其包括獲得包含上文所定義的CRM197或其片段與目的蛋白的融合蛋白，從而增強目的蛋白的免疫原性。在一個優選實施方案中，任選地使用上文所定義的接頭，將CRM197或其片段與目的蛋白融合表達，從而獲得融合蛋白。在一個優選實施方案中，目的蛋白是如上所述的衣殼蛋白、流感病毒M2蛋白或其免疫原性片段。因此，在一個實施方案中，本發明提供了增強HEV衣殼蛋白或其免疫原性片段的免疫原性的方法，其包括獲得包含CRM197或其片段與HEV衣殼蛋白或其免疫原性片段的融合蛋白，從而增強HEV衣殼蛋白或其免疫原性片段的免疫原性。在一個優選實施方案中，任選地使用接頭，將CRM197或其片段與HEV衣殼蛋白或其免疫原性片段融合表達，從而獲得融合蛋白。在另一個實施方案中，本發明提供了增強流感病毒M2蛋白或其免疫原性片段的免疫原性的方法，其包括獲得包含CRM197或其片段以及流感病毒M2蛋白或其免疫原性片段的融合蛋白，從而增強流感病毒M2蛋白或其免疫原性片段的免疫原性。在一個優選實施方案中，任選地使用接頭，將CRM197或其片段與流感病毒M2蛋白或其免疫原性片段融合表達，從而獲得融合蛋白。在另一個方面，本發明涉及CRM197或其片段用于增強目的蛋白的免疫原性的用途，其特征在于獲得包含CRM197或其片段與目的蛋白的融合蛋白。在一個優選實施方案中，任選地使用接頭，將CRM197或其片段與目的蛋白融合表達，從而獲得融合蛋白。在一個優選實施方案中，目的蛋白是如上所述的衣殼蛋白、流感病毒M2蛋白或其免疫原性片段。·因此，在一個實施方案中，本發明涉及CRM197或其片段用于增強HEV衣殼蛋白或其免疫原性片段的免疫原性的用途，其特征在于獲得包含CRM197或其片段與HEV衣殼蛋白或其免疫原性片段的融合蛋白。在一個優選實施方案中，任選地使用接頭，將CRM197或其片段與衣殼蛋白或其免疫原性片段融合表達，從而獲得融合蛋白。在另一個實施方案中，本發明涉及CRM197或其片段用于增強流感病毒M2蛋白或其免疫原性片段的免疫原性的用途，其特征在于獲得包含CRM197或其片段以及流感病毒M2蛋白或其免疫原性片段的融合蛋白。在一個優選實施方案中，任選地使用接頭，將CRM197或其片段與流感病毒M2蛋白或其免疫原性片段融合表達，從而獲得融合蛋白。發明的有益效果本發明首次證實，CRM197及其片段可以用作分子內佐劑，用于增強目的蛋白的免疫原性。因此，本發明提供了CRM197及其片段的新用途，并且提供了新的增強目的蛋白的免疫原性的方法。此外，由于本發明的融合蛋白展示了比單獨的目的蛋白更強的免疫原性，因此，本發明為制備藥物或者疫苗提供了新的選擇，并且可以實現更有效地預防和治療相應疾病。例如，本發明的包含CRM197(或其片段)以及HEV衣殼蛋白(或其免疫原性片段)的融合蛋白展示比單獨的衣殼蛋白(或其免疫原性片段)更強的免疫原性，從而該融合蛋白可以用于制備藥物組合物，且更有效地預防和治療感染和與HEV感染相關的疾病例如戊型肝炎。例如，本發明的包含CRM197(或其片段)以及流感病毒M2蛋白(或其免疫原性片段)的融合蛋白展示比單獨的流感病毒M2蛋白(或其免疫原性片段)更強的免疫原性，從而該融合蛋白可以用于制備藥物組合物，且更有效地預防和治療流感病毒感染和與流感病毒感染相關的疾病例如流感。例如，當將M2e蛋白融合至CRM197(或其片段)的N端時，所形成的融合蛋白可形成四聚體或其他多聚體構象，并且在體外與保護性單抗019(參見，Fu等，Virology,2009,385:218-226)具有良好的反應性(參見圖12B)，且在體內具有良好的免疫原性(參見圖14)，因此，所形成的融合蛋白可用于研制通用的流感疫苗。關于序列信息的說明本發明涉及的序列的信息提供于下表中。^序列號^序列號I描述描述(SEQIDNO:)(SBQIDMO:)|ICRMl97的核苷酸序列2CMl97的氨基酸序列[3CRM197-L-12的核苷酸序列4C1M197-L-E2的氨基酸序^|5CRM197-L-E2S的核苷酸序列6—eiM197:B2s的氨基酸序列—|7389-L-E2的核香酸序列838^L~E2的氨基酸序列9389-L-E2S的核苷酸序列103g9-L-E2s的氨基酸序列|IIA-L-E2的核苷酸序列12A-L~B2的氨基酸序列^|13A-L-E2S的核苷酸序列14|15389-E2S的核苷酸序列16389-E2s的氨基酸序列|17A-E2s的核苷酸序列18...............................A-E2s................................|IfIl物CRM197F20fl#CRM197R21引物CRM197-linkerR225)#389-1inkerRI2SIl物A-IinkerR24引物E2FI25丨物B2sF26g|Drp59R|27!]#389E2sI28引物A-E2sR29引物389-B2sF30|#A-12sP|31腿V衣殼蛋白的氨基酸序列32M2蚤白_氨基酸序列j33OIMW7-L-M2e—瞽酸序列IMaMirHL:M2e的'氨基酸序到35389-L-M2e的核苷酸序列36389-L-M2e的氨基酸序列|37A-L-M2e的核苷酸序列38A-L-M2e的氨基酸序列|3fM2e-L-M197的核苷酸序列40M2e:L-aM197的氨基酸序列|41M2e-L-389的核苷酸序列_議e:L:邛9的氨基酸序列43M2e-L-A的核苷酸序列442e-L-A的氨基酸序列|45I丨物CWI197P146......................OMWl-Ilhket.......Rl........................|47引物389-linkerM48...........................................-.....................................j49引物M2eFl50引物M2eR|SI引物M2eF252I丨物M2e-LinkerI53Il縣CMIW7F254引物CTMl97R2|55引物389R56引物A量|下面將結合附圖和實施例對本發明的實施方案進行詳細描述，但是本領域技術人員將理解，下列附圖和實施例僅用于說明本發明，而不是對本發明的范圍的限定。根據附圖和優選實施方案的下列詳細描述，本發明的各種目的和有利方面對于本領域技術人員來說將變得顯然。圖I顯示了在實施例2中構建的各種融合蛋白的克隆設計。其中，使用的接頭(Linker，在本申請中也簡寫為L)為15個氨基酸殘基的柔性片段，其序列為GGGGSGGGGSGGGG;使用的CRM197包含535個氨基酸，其序列示于SEQIDNO:2；389是指包含CRM197的第1-389位氨基酸殘基(aa1-389)的多肽；A是指包含CRM197的第1-190位氨基酸殘基(aa1-190)的多肽；E2是指包含HEV衣殼蛋白第394-606位氨基酸殘基(aa394-606)的多肽；E2s是指包含HEV衣殼蛋白第455-606位氨基酸殘基(aa455-606)的多肽。圖2顯示了實施例2中構建的融合蛋白的表達、純化和復性的SDS-PAGE分析結果。其中，圖2A使用的樣品為菌體超聲破碎后離心獲得的沉淀(即包涵體)，圖2B使用的樣品為4M尿素溶解上清，圖2C使用的樣品為SM尿素溶解上清，圖2D使用的樣品為復性至PBS中的蛋白。泳道M:蛋白分子量標記；泳道I:CRM197-L-E2;泳道2CRM197-L-E2s;泳道3389-L-E2;泳道4:389-L_E2s;泳道5:389_E2s;泳道6:A-L_E2;泳道7:A-L_E2s;泳道8:A-E2s。結果顯示，所構建的融合蛋白均可在包涵體中表達，并且A-L-E2和A-L-E2s在4M和8M尿素中均可溶解，而其余融合蛋白則需8M尿素才能溶解。此外，結果還顯示，經透析復性后可獲得純度在80%左右的融合蛋白。圖3顯示了經層析純化后的融合蛋白A-L-E2的SDS-PAGE結果。其中，泳道I為經層析純化后復性至PBS中的A-L-E2，泳道2為經沸水煮10分鐘的泳道I的A-L-E2樣品。結果顯示，經過兩步層析純化后，A-L-E2的純度可達到90%以上。圖4顯示了使用實施例2中構建的融合蛋白與HEV中和單抗8C11進行的蛋白質印跡(Westernblotting)的結果。泳道M:蛋白分子量標記；泳道I:對照蛋白HEV-239;泳道2:對照蛋白E2,泳道3CRM197-L-E2;泳道4CRM197-L-E2s;泳道5:389-L_E2;泳道6389-L-E2s;泳道7:389_E2s;泳道8:A-L_E2;泳道9:A-L_E2s;泳道10:A_E2s。結果顯示，測試的所有融合蛋白與特異性中和單抗8C11均具有顯著的反應性。圖5顯示了使用實施例2中構建的融合蛋白與HEV特異性單抗進行的間接法ELISA的結果。橫坐標為用于ELISA的HEV特異性單抗或CRM197多抗血清，縱坐標為同樣的抗體稀釋濃度下ELISA測定的OD讀值。圖5A顯示了包含E2的融合蛋白的ELISA結果，圖5B顯示了包含E2s的融合蛋白的ELISA結果。結果顯示，E2s蛋白與CRM197或其片段融合后，與HEV特異性單抗的反應性顯著提高，其中A-L-E2S和A-E2S的反應性提高最為顯著；E2蛋白與CRM197或其片段融合后，保留或提高了與HEV特異性單抗的反應性。圖6顯示了使用蛋白A-L-E2、HEV-239或E2與HEV特異性單抗進行的間接法ELISA的結果，其中截斷值(cutoff)定義為3倍陰性均值。結果顯示，A-L-E2與HEV特異性單抗的反應性與HEV-239和E2蛋白相當。圖7顯示了融合蛋白A-L-E2的沉降速率(SedimentationVelocity,SV)的分析結果。結果顯示，融合蛋白A-L-E2主要以二聚體形式存在，并且存在少量的四聚體。圖8顯示了實施例2中構建的融合蛋白與HEV-239的免疫原性的比較。在0周時進行初次免疫，在2周和4周時進行加強免疫,初次免疫和加強免疫的劑量均為g或均為0.5iig。圖8A為5iig劑量組的免疫血清的抗體滴度的比較結果，圖8B為0.5iig劑量組的免疫血清的抗體滴度的比較結果。結果顯示，在5yg和0.5yg劑量組中，小鼠血清在第四周均發生抗HEV陽轉，并且抗體滴度在第五或六周時達到最高。特別地，在5yg劑量組中，使用A-L-E2獲得的抗體滴度最高，其在第6周時高達IO6;并且，各融合蛋白誘導的抗體滴度均高于HEV-239蛋白或與之相當。在0.g劑量組中，各融合蛋白誘導的抗體滴度均顯著高于HEV-239，并且A-L-E2蛋白在第5周時誘導的抗體滴度高達106。此外，在5yg和0.5yg劑量組中，使用E2和E2s獲得的免疫血清均沒有發生陽轉。從以上結果可知，實施例2所構建的各種融合蛋白的免疫原性均顯著高于單獨的抗原蛋白(E2和E2s)，這表明本發明的CRM197或其片段顯著增強了與其融合的抗原蛋白的免疫原性，可以用作分子內佐劑。圖9顯示了在實施例6中構建的各種融合蛋白的克隆設計。其中，使用的接頭(Linker，在本申請中也簡寫為L)為10個氨基酸殘基的柔性片段，其序列為GGGGSGGGGS;使用的CRM197包含535個氨基酸，其序列示于SEQIDNO:2;389是指包含CRM197的第1-389位氨基酸殘基(aa1-389)的多肽；A是指包含CRM197的第1-190位氨基酸殘基(aa1-190)的多肽；M2是指流感病毒M2蛋白，其序列示于SEQIDNO:32；M2e是指包含流感病毒M2蛋白的第1-24位氨基酸殘基(aal-24)的多肽。圖10展示了實施例6中構建的融合蛋白的表達、純化和復性的SDS-PAGE分析結果。其中，泳道M:蛋白分子量標記。圖IOA使用的樣品為菌體超聲破碎后離心獲得的沉淀(即包涵體)和上清泳道I:從用CRM197-L-M2e轉化的菌體獲得的包涵體；泳道2:從用CRM197-L-M2e轉化的菌體獲得的上清；泳道3:從用389-L_M2e轉化的菌體獲得的包涵體；泳道4:從用389-L_M2e轉化的菌體獲得的上清；泳道5:從用A-L_M2e轉化的菌體獲得的包涵體；泳道6:從用A-L_M2e轉化的菌體獲得的上清。圖IOB使用的樣品為菌體超聲破碎后離心獲得的沉淀(即包涵體)和上清泳道I:從用M2e-L_A轉化的菌體獲得的包涵體；泳道2:從用M2e-L_A轉化的菌體獲得的上清；泳道3:從用M2e-L_389轉化的菌體獲得的包涵體；泳道4:從用M2e-L_389轉化的菌體獲得的上清；泳道5:從用M2e-L_CRM197轉化的菌體獲得的包涵體；泳道6:從用M2e-L-CRM197轉化的菌體獲得的上清。圖IOC使用的樣品為經分離且復性至PBS中的融合蛋白，并且在進行SDS-PAGE分析時，未使用P-巰基乙醇，且蛋白樣品經煮沸處理(10分鐘)或者未經煮沸處理泳道I:A-L_M2e蛋白，未經煮沸處理的；泳道2A-L-M2e蛋白，經煮沸處理的；泳道3389-L-M2e蛋白，未經煮沸處理的；泳道4389-L-M2e蛋白，經煮沸處理的；泳道5CRM197-L-M2e蛋白，未經煮沸處理的；泳道6CRM197-L-M2e蛋白，經煮沸處理的。圖IOD使用的樣品為經分離且復性至PBS中的融合蛋白，并且在進行SDS-PAGE分析時，使用了P-巰基乙醇，且蛋白樣品經煮沸處理(10分鐘)或者未經煮沸處理泳道I:A-L_M2e蛋白，未經煮沸處理的；泳道2A-L-M2e蛋白，經煮沸處理的；泳道3389-L-M2e蛋白，未經煮沸處理的；泳道4389-L-M2e蛋白，經煮沸處理的；泳道5CRM197-L-M2e蛋白，未經煮沸處理的；泳道6CRM197-L-M2e蛋白，經煮沸處理的。圖IOE使用的樣品為經分離且復性至PBS中的融合蛋白，并且在進行SDS-PAGE分析時，未使用P-巰基乙醇，且蛋白樣品經煮沸處理(10分鐘)或者未經煮沸處理泳道I:M2e-L_A蛋白，未經煮沸處理的；泳道2M2e-L-A蛋白，經煮沸處理的；泳道3M2e-L-389蛋白，未經煮沸處理的；泳道4M2e-L-389蛋白，經煮沸處理的；泳道5M2e-L-CRM197蛋白，未經煮沸處理的；泳道6M2e-L-CRM197蛋白，經煮沸處理的。圖IOF使用的樣品為經分離且復性至PBS中的融合蛋白，并且在進行SDS-PAGE分析時，使用了P-巰基乙醇，且蛋白樣品經煮沸處理(10分鐘)或者未經煮沸處理泳道I:M2e-L-A蛋白，未經煮沸處理的；泳道2M2e-L-A蛋白，經煮沸處理的；泳道3M2e-L-389蛋白，未經煮沸處理的；泳道4M2e-L-389蛋白，經煮沸處理的；泳道5M2e-L-CRM197蛋白，未經煮沸處理的；泳道6M2e-L-CRM197蛋白，經煮沸處理的。圖10A-10F的結果顯示，所構建的融合蛋白均可在包涵體中表達，并且經純化和復性后，可獲得純度為80%左右的融合蛋白。圖11顯示了使用實施例6中構建的融合蛋白與抗M2e單抗以及CRM197單抗1E6進行的蛋白質印跡的結果。其中，圖11A，11B,IlC和IlD的泳道1-6所代表的樣品分別對應于圖10C，10D,IOE和IOF的泳道1-6所代表的樣品，且使用抗M2e特異性單抗OT1。圖he,HF,HG和iih的泳道1-6所代表的樣品分別對應于圖ioc,iod,ioe和iof的泳道1-6所代表的樣品，且使用CRM197特異性單抗1E6。結果顯示，測試的所有融合蛋白與抗M2e特異性單抗以及CRM197特異性單抗1E6均具有顯著的反應性。圖12顯示了使用實施例6中構建的融合蛋白與各種抗M2e特異性單抗進行的間接法ELISA的結果。橫坐標為用于ELISA的抗M2e特異性單抗以及抗CRM197特異性單抗，縱坐標為同樣的抗體稀釋濃度下ELISA測定的OD讀值。其中，圖12A顯示了M2e融合在CRM197或其片段的C端的融合蛋白的ELISA結果，圖12B顯示了M2e融合在CRM197或其片段的N端的融合蛋白的ELISA結果。結果顯示，與單獨的M2e蛋白相比，包含M2e蛋白以及CRM197或其片段的融合蛋白，與各種抗M2e特異性單抗的反應性保持不變或者顯著提高。圖13顯示了實施例6中構建的各種融合蛋白的沉降速率的分析結果。其中，圖13ACRM197-L-M2e；圖13B:389-L_M2e；圖13C:A-L_M2e；圖13DM2e-L-CRM197;圖13E:M2e-L-389;圖13F:M2e-L_A。結果顯示，融合蛋白A_L_M2e和M2e_L_A主要以單體和四聚體的形式存在；389-L-M2e主要以二聚體和多聚體形式存在；M2e-L_389主要以單體和多聚體形式存；CRM197-L-M2e主要以二聚體和多聚體形式存在；和，M2e-L_CRM197主要以單體和多聚體形式存在。圖14顯示了實施例6中構建的融合蛋白與GST_M2e的免疫原性的比較。在0周時進行初次免疫，在2周和4周時進行加強免疫,初次免疫和加強免疫的劑量均為g或均為0.5iig。圖14A為5iig劑量組的免疫血清的抗體滴度的比較結果，圖14B為0.5iig劑量組的免疫血清的抗體滴度的比較結果。結果顯示，在5yg和0.5yg劑量組中，在第二次加強免疫后，各融合蛋白誘導的抗體滴度均顯著高于GST-M2e。從上述結果可知，實施例6所構建的各種融合蛋白的免疫原性均顯著高于單獨的抗原蛋白(GST-M2e)，這表明本發明的CRM197或其片段(無論其是位于融合蛋白的N端，還是C端)顯著增強了與其融合的抗原蛋白的免疫原性，可以用作分子內佐劑。具體實施例方式現參照下列意在舉例說明本發明(而非限定本發明)的實施例來描述本發明。除非特別指明，本發明中所使用的分子生物學實驗方法和免疫檢測法，基本上參照J.Samtoook等人，分子克隆實驗室手冊，第2版，冷泉港實驗室出版社，1989，以及F.M.AusubeI等人,精編分子生物學實驗指南,第3版，JohnWiley&Sons,Inc.,1995中所述的方法進行；限制性內切酶的使用依照產品制造商推薦的條件。實施例中未注明來源的試劑均是本領域的常規試劑或市售可得的試劑。本領域技術人員知曉，實施例以舉例方式描述本發明，且不意欲限制本發明所要求保護的范圍。實施例I.CRM197基因的克隆以從購自ATCC(N053281)的白喉棒狀桿菌C7(@197)菌株中提取的基因組DNA作為模板，以CRM197F(SEQIDNO:19)為正向引物，CRM197R(SEQIDNO:20)為反向引物，在PCR儀(Biometra，T3)中按照如下條件進行PCR反應，從而制備編碼CRM197的全長基因。9410變性10分鐘__I個循環_941C變性L5分鐘58C退火I.5分鐘20個循環72r延伸I.5分鐘721C延伸IQ分鐘__I個循琢_PCR擴增后，得到大小特異的I.6kb左右的產物。經測序獲得擴增產物(S卩，CRM197全長基因)的核苷酸序列(SEQIDNO:I)，其編碼的氨基酸序列示于SEQIDN0:2。實施例2.包含CRM197或其片段以及HEV衣殼蛋白片段的融合蛋白的設計與克隆在本實施例中，示例性地構建了表達融合蛋白的載體。所構建的各種示例性融合蛋白的克隆設計參見圖I，其各自包含CRM197或其片段以及HEV衣殼蛋白片段，并且任選地使用接頭。使用接頭的融合蛋白的克隆以實施例I獲得的擴增產物(即，CRM197全長基因)為模板，以CRM197F(SEQIDNO:19)為正向引物(在其5’端引入限制性內切酶NdeI位點CATATG,ATG為大腸桿菌系統中的起始密碼子)，并且分別以CRM197-linkerR(SEQIDNO:21)、389_linkerR(SEQIDNO:22)、A-IinkerR(SEQIDNO:23)為反向引物(在其5’端引入限制性內切酶BamHI位點GGATCC)，在PCR熱循環儀(BiometraT3)中按照如下條件進行PCR反應。所使用的引物的序列列于表I。權利要求1.一種融合蛋白，其包含CRM197或其片段以及目的蛋白，并且其中CRM197或其片段增強了目的蛋白的免疫原性，其中，例如，CRM197的片段可以包含，CRM197的A片段，轉膜結構域T，和/或受體結合位點結構域R;例如，CRM197片段可以包含A片段，或者A片段和轉膜結構域T；例如，CRM197片段可以包含CRM197的aa1-190，例如包含CRM197的aa1-389；例如，目的蛋白可以是JEV衣殼蛋白或其免疫原性片段；例如，HEV衣殼蛋白的免疫原性片段可以包含或者是HEV-239(HEV衣殼蛋白aa368-606)，E2(HEV衣殼蛋白aa394-606)或E2s(HEV衣殼蛋白aa455-606)；例如，目的蛋白可以是流感病毒M2蛋白或其免疫原性片段；例如，M2蛋白的免疫原性片段可以包含或者是M2e(M2蛋白aal_24)；例如，在所述融合蛋白中，CRM197或其片段可連接至目的蛋白的N端和/或C端，任選地使用接頭進行連接；例如，所述融合蛋白可以包含CRM197或其片段以及HEV衣殼蛋白或其免疫原性片段，二者任選地使用接頭進行連接；例如，所述融合蛋白可以是具有SEQIDNO:4，6，8，10，12，14，16或18所示氨基酸序列的蛋白；例如，所述融合蛋白可以包含CRM197或其片段以及流感病毒M2蛋白或其免疫原性片段，二者任選地使用接頭進行連接；例如，所述融合蛋白可以是具有SEQIDNO:34，36，38，40，42或44所示氨基酸序列的蛋白。2.編碼權利要求I的融合蛋白的多核苷酸。3.包含權利要求2的多核苷酸的構建體。4.包含權利要求2的多核苷酸或權利要求3的構建體的載體,例如所述載體是表達載體。5.包含權利要求2的多核苷酸或權利要求3的構建體或權利要求4的載體的宿主細胞或者生物體。6.一種藥物組合物或疫苗，其包含權利要求I的融合蛋白，任選地還包含藥學可接受的載體和/或賦形劑。7.權利要求I的融合蛋白用于制備藥物組合物的用途，所述藥物組合物用于預防和/或治療能夠被所述目的蛋白預防和/或治療的疾病，例如，當所述融合蛋白包含CRM197或其片段以及HEV衣殼蛋白或其免疫原性片段(二者任選地使用接頭進行連接)時，所述藥物組合物可用于預防和/或治療HEV感染和與HEV感染相關的疾病例如戊型肝炎；例如，當所述融合蛋白包含CRM197或其片段以及流感病毒M2蛋白或其免疫原性片段(二者任選地使用接頭進行連接)時，所述藥物組合物可用于預防和/或治療流感病毒感染和與流感病毒感染相關的疾病例如流感。8.預防和/或治療HEV感染或與HEV感染相關的疾病例如戊型肝炎的方法，其包括施用有效量的權利要求I的融合蛋白或包含所述融合蛋白的藥物組合物，其中，所述融合蛋白包含CRM197或其片段以及HEV衣殼蛋白或其免疫原性片段，二者任選地使用接頭進行連接。9.預防和/或治療流感病毒感染或與流感病毒感染相關的疾病例如流感的方法，其包括施用有效量的權利要求I的融合蛋白或包含所述融合蛋白的藥物組合物，所述融合蛋白包含CRM197或其片段以及流感病毒M2蛋白或其免疫原性片段，二者任選地使用接頭進行連接。10.用于增強目的蛋白的免疫原性的方法，其包括獲得包含權利要求I所定義的CRM197或其片段與所述目的蛋白的融合蛋白，從而增強目的蛋白的免疫原性，例如，可任選地使用接頭，將CRM197或其片段與目的蛋白融合表達，從而獲得融合蛋白；例如，所述目的蛋白是衣殼蛋白、流感病毒M2蛋白或其免疫原性片段。11.權利要求I所定義的CRM197或其片段用于增強目的蛋白的免疫原性的用途，其特征在于獲得包含CRM197或其片段與目的蛋白的融合蛋白，例如，可任選地使用接頭，將CRM197或其片段與目的蛋白融合表達，從而獲得融合蛋白；例如，所述目的蛋白是衣殼蛋白、流感病毒M2蛋白或其免疫原性片段。全文摘要本發明涉及分子病毒學和免疫學領域。具體而言，本發明涉及白喉毒素無毒突變體CRM197或其片段在融合蛋白中作為分子內佐劑增強與其融合的目的蛋白(例如HEV衣殼蛋白、流感病毒M2蛋白或其免疫原性片段)的免疫原性的用途。本發明還涉及增強目的蛋白(例如HEV衣殼蛋白、流感病毒M2蛋白或其免疫原性片段)的免疫原性的方法，其包括將CRM197或其片段與目的蛋白融合表達，形成融合蛋白。本發明還涉及包含CRM197或其片段以及目的蛋白(例如HEV衣殼蛋白、流感病毒M2蛋白或其免疫原性片段)的融合蛋白，其中CRM197或其片段增強了目的蛋白的免疫原性。本發明還涉及編碼所述融合蛋白的分離的核酸，包含所述核酸的構建體和載體，以及包含所述核酸的宿主細胞。本發明還涉及所述融合蛋白的用途，其用于制備藥物組合物或疫苗。文檔編號C12N1/19GK102807621SQ20121018139公開日2012年12月5日申請日期2012年6月1日優先權日2011年6月1日發明者李少偉,宋翠靈,楊春燕,顧穎,羅文新,夏寧邵申請人:廈門大學,廈門萬泰滄海生物技術有限公司