專利名稱：由萬能干細胞所分化的神經上皮細胞的培養方法及培養基的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種神經上皮細胞的分化方法及其使用的培養基，特別是指一種由萬能干細胞所分化的神經上皮細胞的分化方法及其所使用的培養基。
背景技術：
干細胞是指尚未完全分化，而具有自我更新能力，并可分化成兩種以上成熟細胞的原始細胞。以分化能力將干細胞分類，可分為全能干細胞(totipotent stem cell)、萬能干細胞(pluripotent stem cell)、多能干細胞(multipotent stem cell)及雙能細胞(bipotent stem cell);另依干細胞來源區分，則可分為胚胎干細胞(embryonic stemcell)、成體干細胞(somatic stem cell)及誘導型萬能干細胞(induced pluripotentstem cell ；iPSC)0其中，人類胚胎干細胞屬于萬能干細胞，來自于未著床前囊胚時期的內細胞團塊，具有萬能性而可分化為各種成體細胞；另外，誘導型萬能干細胞則以強制表達(enforced expression)操作的方式,將特定基因或蛋白質導入已分化的體細胞,使該體細胞被重新程式化(reprogrammed)而成為類似胚胎干細胞。由于干細胞具有細胞分裂、再生更新的能力，也可被誘導分化成為特定組織，因此，目前許多研究學者致力于干細胞分化的研究，希望干細胞分化成為特定細胞或是組織器官后，能夠具有用于人類疾病治療或再生醫學等的用途，例如:可將分化培養的多巴胺神經元用以治療帕金森氏癥、分化后的器官用于器官損傷的病人。尤其是針對神經發育、神經損傷及神經退化性疾病、或是相關藥物篩檢等生物醫學研究，更是需要借由經干細胞分化后的神經細胞來進行。然而成熟的神經細胞來自于神經上皮細胞，因此，如何獲得大量且高純度的神經上皮細胞就顯得非常重要。許多研究學者于胚胎干細胞分化初期利用加入纖維細胞生長因子-2 (FGF2) (Li, X.J.et al., 2005 ；Timothy et al., 2009 ；Xu et al., 2005 ；Vallier, L.et al.，2005)，以懸浮培養方式進行誘導神經分化，該種分化方法雖可獲得具有類神經管表現的神經上皮細胞，然所需分化時間約需十四天以上，分化出來的細胞于貼附過程還夾雜有眾多非神經細胞，需以酵素及人力操作于顯微鏡下將神經上皮細胞挑出，才可獲得高純度的神經細胞。另有學者于干細胞分化過程加入兩種smad抑制劑(smad inhibitors)(Elkabetz et al., 2008 ；Lee et al., 2007 ；Chambers et al., 2009),包括 Noggin 和SB431542，用以縮短神經分化時間；也有學者利用基因操作誘導分化或是利用其他細胞共同培養誘導分化等(Pankratz et al.，2007 !Chambers et al.，2009),然而上述方法雖可得到神經上皮細胞，但仍無法使大部分的胚胎干細胞分化成為神經細胞，并且具有生產成本昂貴、利用病毒進行基因操作的安全疑慮及與其他細胞共同培養的不確定因素等缺點。此外，倘若所生產的神經上皮細胞夾雜有其他非神經細胞或未分化細胞等，可能會影響后續神經的分化，且此未分化萬能干細胞移植入動物體內也可能變成畸胎瘤。因此，有效率分化出高純度并表現大部分神經標記的神經上皮細胞，未來將有助于成熟神經細胞的分化，而提升臨床運用的可靠性及減少使用的危險。
發明內容
本發明的主要目的，在于提供一種將萬能干細胞分化成神經上皮細胞的分化方法。 本發明的另一目的，在于提供一種神經誘導培養基，其含有Wnt信號激動劑(ffnt-signal agonist)、轉化生長因子 β 信號抑制劑(TGF β-signal inhibitor)及纖維母細胞生長因子信號激動劑(FGF-signal agonist)，用以使干細胞得以分化出高純度的神經上皮細胞。為實現上述目的，本發明采用以下技術方案:一種神經誘導培養基，它包含有Wnt信號激動劑(Wnt-signal agonist)、轉化因子β信號抑制劑(TGFβ-signal inhibitor)及纖維母細胞生長因子信號激動劑(FGF-signal agonist)。如上所述的神經誘導培養基，優選地，所述fct信號激動劑選自Wntligands和月干醣合成酶激酶_3β抑制劑(glycogen synthase kinase 3 β inhibitor)如藥物Bio(6-bromoindirubin_3’ -oxime)中的一種或多種。如上所述的神經誘導培養基，優選地，所述Wnt信號激動劑為濃度介于0.05 μ M(即 0.05 μ mol/L,下同)至 50 μ M 間的藥物 Bio (6_bromoindirubin_3’ -oxime)。如上所述的神經誘導培養基，優選地，所述轉化因子β信號抑制劑選自骨形態發生蛋白質抑制劑(bone morphogenetic protein inhibitor)、chordin 蛋白質、noggin 蛋白質、dorsomorphin 蛋白質、Smadl 抑制劑(Smadl inhibitor)>Activin/Nodal 受體抑制劑藥物如SB431542、及Smad2/3抑制劑(Smad2/3_inhibitor)中的一種或多種。如上所述的神經誘導培養基，優選地，所述轉化因子β信號抑制劑為濃度介于I μ M 至 100 μ M 間的藥物 SB431542。如上所述的神經誘導培養基，優選地，所述纖維母細胞生長因子信號激動劑選自纖維母細胞生長因子2 (FGF2)、纖維母細胞生長因子受體的配體(ligand)、活化胞外信號調控激酶(extracellular signal-related kinases ;ERK)的促進劑、活化 c_jun N 端蛋白質激酶(c-jun N-terminal kinase kinase ;JNK)的促進劑及活化磷脂酰肌醇3激酶(phosphoinosital_3kinase ；PI3K)的促進劑中的一種或多種。如上所述的神經誘導培養基，優選地，所述纖維母細胞生長因子信號激動劑為濃度介于Ing/mL至100ng/mL間的纖維母細胞生長因子2 (FGF2)。一種如上所述的神經誘導培養基的用途，是將該培養基用于將萬能干細胞培養分化成神經上皮細胞。一種將萬能干細胞分化成神經上皮細胞的分化方法，它包含有下列步驟:步驟a:將萬能干細胞懸浮培養形成類胚體(embryoid body)；步驟b:將該類胚體培養于第一神經誘導培養基中，分化形成神經上皮細胞；其特征在于:所述第一神經誘導培養基選自如權利要求1至7中任意一項所述的神經誘導培養基。如上所述的將萬能干細胞分化成神經上皮細胞的分化方法，優選地，所述方法還包含有一步驟C，將所述第一神經誘導培養基更換為第二神經誘導培養基，使該被培養細胞繼續分化為神經上皮細胞。如上所述的將萬能干細胞分化成神經上皮細胞的分化方法，優選地，所述第二神經誘導培養基至少由神經干細胞培養基、N2神經細胞生長添加劑、非必須胺基酸及肝素所組成。如上所述的將萬能干細胞分化成神經上皮細胞的分化方法，優選地，所述步驟a的萬能干細胞為人類的胚胎干細胞株及誘導型萬能干細胞中的一種或多種。本發明的有益效果在于:本發明提供的將萬能干細胞分化成神經上皮細胞的分化方法，使用添加有fct信號激動劑、轉化因子β信號抑制劑及纖維母細胞生長因子信號激動劑的該神經誘導培養基，不僅可縮短萬能干細胞分化為神經上皮細胞的分化時間，還可獲得高純度的神經上皮細胞而可高度表現神經標記，借此，可將該神經上皮細胞于臨床上進一步分化為成熟神經細胞而應用于再生醫學、篩選神經疾病藥物等。
圖1A至C為人類胚胎干細胞培養于無喂養細胞環境下的mTESRl培養基中的生長形態圖。圖2為分化過程中 加入藥物Bio、藥物SB431542及纖維母細胞生長因子2的第一
神經誘導培養液進行懸浮培養的細胞形態圖。圖3A為以顯微鏡倍率為100倍的顯微鏡下觀察的細胞形態圖。圖3B為以顯微鏡倍率為200倍的顯微鏡下觀察的細胞形態圖。圖3C為以顯微鏡倍率為400倍的顯微鏡下觀察的細胞形態圖。圖4A為將分化后的神經上皮細胞貼附后神經管狀細胞呈現的細胞形態圖。圖4B為圖4A培養兩天后細胞伸展的形態圖。圖5A_la及圖5A_lb為神經上皮細胞以一級抗體0ct4表現的免疫熒光表現圖。圖5A_2a及圖5A_2b為神經上皮細胞以一級抗體Sox2表現的免疫熒光表現圖。圖5A_3a及圖5A_3b為神經上皮細胞以一級抗體Nanog表現的免疫熒光表現圖。圖5A_4a及圖5A_4b為神經上皮細胞以一級抗體Zo-1表現的免疫熒光表現圖。圖5A-5為神經上皮細胞以一級抗體Nestin表現的免疫熒光表現圖。圖5B_la及圖5B_lb為神經上皮細胞以一級抗體Soxl表現的免疫熒光表現圖。圖5B_2a及圖5B_2b為神經上皮細胞以一級抗體Pax6表現的免疫熒光表現圖。圖5B_3a及圖5B_3b為神經上皮細胞以一級抗體Zicl表現的免疫熒光表現圖。圖5B_4a及圖5B_4b為神經上皮細胞以一級抗體N_cadherin表現的免疫熒光表現圖。圖5C-1及圖5C-2為神經上皮細胞以一級抗體BFl表現的免疫熒光表現圖。圖為神經上皮細胞經貼附后以一級抗體Tujl表現神經軸突的免疫熒光表現圖。
具體實施方式
本發明提供了一種將萬多能干細胞分化成神經上皮細胞的分化方法，其是取一萬多能干細胞而將之聚集成為類胚體，再利用包含有fct信號激動劑、轉化生長因子β信號抑制劑及纖維母細胞生長因子信號激動劑的神經誘導培養基，作用于該萬多能干細胞，使該萬多能干細胞分化形成神經上皮細胞。借由本發明所提供的將萬多能干細胞分化成神經上皮細胞的分化方法及所使用的神經誘導培養基，可使超過90%的未分化萬多能干細胞于一周內成功地分化形成神經上皮細胞，并可高度表達神經標記與前腦標記分子。關于本發明專利申請所使用的名詞，其核心含義如下所述，但其含義的范圍并不為此所限:萬多能干細胞:包含有哺乳類動物的胚胎干細胞、經由基因或蛋白質的外來表現而形成的誘導性萬多能干細胞或是其他具有分化為所有體細胞特性的萬多能型細胞。于以下實施例中所使用的萬多能干細胞為人類胚胎干細胞TWl (由李茂盛婦產科診所提供；En-Hui Cheng et al，2008)，如圖1A至C所示，其是由人類胚胎干細胞培養于無喂養細胞(non-feeder cells)環境下的mTESRl培養基中的生長形態圖。神經標記:如Nestin、Soxl、Pax6、Zic-1和N-cadherin等基因，在神經上皮細胞內所表達，因此，通過分析該神經標記即可鑒定萬多能干細胞是否已經分化形成神經上皮細胞。前腦標記分子:如腦因子I (brain factor I ;BF1),表達于神經前腦細胞的轉錄因子，因此，通過分析該前腦標記分子是否表達，用以鑒定萬多能干細胞是否以分化形成神經上皮細胞。 胚胎干細胞標記分子:如0ct4及nanog等轉錄因子，于胚肽干細胞中大量表達，因此，借由分析胚胎干細胞標記分子的表達，可用以鑒定萬多能干細胞分化為神經上皮細胞的效率。神經上皮細胞:其細胞呈球型結構，而邊緣逐漸成管狀緊密規則排列結構，排列如花瓣狀，又稱 neural rossettes。Wnt信號激動劑:可為一種肝醣合成酶激酶-3 β的抑制劑，穩定β _連結蛋白質(β-catenin),包括:Wntl、Wnt3a、肝醣合成酶激酶-3 β抑制劑如藥物Bio。其中，下列實施例中所使用的fct信號激動劑為藥物Bio，其化學式為C16H10BrN302，結構式為
OC轉化因子β信號抑制劑:使胚胎干細胞減少自我更新的能力，使0ct4表現量降低，包括:骨形態發生蛋白質抑制劑(bone morphogenetic protein inhibitor)、chordin蛋白質、noggin 蛋白質、dorsomorphin 蛋白質、Smadl 抑制齊[J(Smadl inhibitor)、Activin/Nodal受體抑制劑藥物如SB431542，或Smad2/3抑制劑(Smad2/3-1nhibitoiO。其中，下列實施例中所使用的轉化因子β信號抑制劑為藥物SB431542，化學式為:C22-H16-N4_03，結構式為
權利要求
1.一種神經誘導培養基，其特征在于，它包含有fct信號激動劑、轉化因子β信號抑制劑及纖維母細胞生長因子信號激動劑。
2.如權利要求1所述的神經誘導培養基，其特征在于，所述fct信號激動劑選自Wntligands和肝醣合成酶激酶_3 β抑制劑中的一種或多種。
3.如權利要求1或2所述的神經誘導培養基，其特征在于，所述Wnt信號激動劑為濃度介于0.05 μ M至50 μ M間的藥物Bio。
4.如權利要求1所述的神經誘導培養基，其特征在于，所述轉化因子β信號抑制劑選自骨形態發生蛋白質抑制劑、chordin蛋白質、noggin蛋白質、dorsomorphin蛋白質、Smadl抑制劑、Activin/Nodal受體抑制劑藥物及Smad2/3抑制劑中的一種或多種。
5.如權利要求1或4所述的神經誘導培養基，其特征在于，所述轉化因子β信號抑制劑為濃度介于I μ M至100 μ M間的藥物SB431542。
6.如權利要求1所述的神經誘導培養基，其特征在于，所述纖維母細胞生長因子信號激動劑選自纖維母細胞生長因子2、纖維母細胞生長因子受體的配體、活化胞外信號調控激酶的促進劑、活化c-jun N端蛋白質激酶的促進劑及活化磷脂酰肌醇3激酶的促進劑中的一種或多種。
7.如權利要求1或6所述的神經誘導培養基，其特征在于，所述纖維母細胞生長因子信號激動劑為濃度介于Ing/mL至lOOng/mL間的纖維母細胞生長因子2。
8.—種如權利要求1所述的神經誘導培養基的用途，其特征在于，其是將該培養基用于將萬能干細胞培養分化成神經上皮細胞。
9.一種將萬能干細胞分化成神經上皮細胞的分化方法，它包含有下列步驟: 步驟a:將萬能干細胞懸浮培養形成類胚體； 步驟b:將該類胚體培養于第一神經誘導培養基中，分化形成神經上皮細胞； 其特征在于: 所述第一神經誘導培養基選自如權利要求1至7中任意一項所述的神經誘導培養基。
10.如權利要求9所述的將萬能干細胞分化成神經上皮細胞的分化方法，其特征在于，所述方法還包含有一步驟C，將所述第一神經誘導培養基更換為第二神經誘導培養基，使該被培養細胞繼續分化為神經上皮細胞。
11.如權利要求9所述的將多能干細胞分化成神經上皮細胞的分化方法，其特征在于，所述第二神經誘導培養基至少由神經干細胞培養基、N2神經細胞生長添加劑、非必須胺基酸及肝素所組成。
12.如權利要求9、10或11所述的將萬能干細胞分化成神經上皮細胞的分化方法，其特征在于，所述步驟a的萬能干細胞為人類的胚胎干細胞株及誘導型萬能干細胞中的一種或多種。
全文摘要
本發明提供了一種神經誘導培養基，它包含有Wnt信號激動劑(Wnt-signal agonist)、轉化因子β信號抑制劑(TGFβ-signal inhibitor)及纖維母細胞生長因子信號激動劑(FGF-signal agonist)。使用該神經誘導培養基對萬能干細胞進行培養，不僅可縮短萬能干細胞分化為神經上皮細胞的分化時間，還可獲得高純度的神經上皮細胞而可高度表現神經標記，借此，可將該神經上皮細胞于臨床上進一步分化為成熟神經細胞而應用于再生醫學、篩選神經疾病藥物等。
文檔編號C12N5/079GK103160466SQ20121018553
公開日2013年6月19日 申請日期2012年6月6日 優先權日2011年12月14日
發明者蘇鴻麟, 陳圣美 申請人:中興大學