專利名稱：一種miRNA的原位雜交探針及其檢測試劑盒和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及分子檢測領域，具體涉及一種miRNA的原位雜交探針及其檢測試劑盒和應用。
背景技術：
原位雜交技術是根據核酸分子堿基互補原則，將標記的DNA或RNA探針與經過變性后的單鏈DNA片段或組織、細胞上特定的核苷酸序列，在適宜條件下結合形成專一的核酸雜交分子，再經過相應的檢測手段，將待測核酸在染色體、組織或細胞上的位置顯示出來。原位雜交技術是由Gall和Parue (1969)利用標記的rDNA探針與非洲爪蟾細胞核雜交首次獲得成功。隨著植物染色體制備技術的改進，Rayburn(1985)最早將非放射性檢測系統應用到植物染色體原位雜交。目前，該技術在基因定位、多倍體起源、非整倍體鑒定以及系統進化和親緣關系等方面均得到廣泛應用。 現有的原位雜交探針包括DNA探針、寡聚核苷酸探針、RNA探針,這些探針需要信號級聯放大反應才能觀察結果，而且要有一定的Tm值才能保證實驗的正確性和準確性。而且為了增強信號，目前多采取長的核酸序列做為探針的靶向序列或采用信號擴大系統。miRNA是短的非編碼的RNA，是致癌基因或抑癌基因的潛在調節子。RT-PCR、Northern印跡法以及生物芯片可以檢測miRNA的表達量,但是并不能檢測在單個細胞中miRNA的表達也不能在原位研究moRNA的表達，達到研究miRNA在癌細胞增殖或凋亡的機制的目的。為了驗證miRNA表達的特異性以及它在癌細胞或癌組織中的定位，需要進行原位雜交。針對miRNA，因為miRNA的片段長度在18 — 22nt范圍內，比較小，Tm值比較小不能滿足原位雜交的需要，以上方法均不能很好的解決這些問題。目前，為了解決Tm值偏小，丹麥的一家公司生產檢測miRNA的探針，他們的探針是將堿基五碳環上2’氧4’碳亞甲基連接，然后人工合成，該方法有效提高了 Tm值，但是其售價昂貴。
發明內容
為克服上述技術缺陷，并降低經濟成本，本發明的目的是提供一種miRNA的原位雜交探針及其檢測試劑盒和應用。為實現上述目的，采用如下的技術方案本發明提供了一種miRNA的原位雜交探針，所述雜交探針的堿基五碳環第2位碳原子修飾了氟原子。修飾的探針是其大部分堿基進行2-F修飾，即在第2位碳原子上修飾一個氟原子，提高Tm值；用長18-22nt的序列和microRNA互補作為探針將修飾后的RNA合
并到到探針中。其中，修飾位點如下式
權利要求
1.ー種miRNA的原位雜交探針，其特征在于，所述雜交探針中的堿基的五碳環第2位碳原子修飾了 ー個氟原子。
2.根據權利要求I所述的原位雜交探針，其特征在于，所述雜交探針的序列為5’一3’AGCCTATGGAATTCAGTTCTCA，其中第3、6、15、20個堿基五碳環第2位碳原子修飾了一個氟原子。
3.根據權利要求I所述的原位雜交探針，其特征在于，所述雜交探針的序列為5’一3’TCACGCGAGCCGAACGAACAAA，其中第3、8、13、21個堿基五碳環第2位碳原子修飾了一個氟原子。
4.根據權利要求1-3之一所述的原位雜交探針，其特征在于，所述雜交探針的5’和3’端修飾地高辛。
5.ー種含有權利要求1-3之一所述的原位雜交探針的miRNA的原位雜交檢測試劑盒。
6.根據權利要求5所述的原位雜交檢測試劑盒，其特征在于，還包括對照探針、預雜交液、封閉液和標記物。
7.根據權利要求6所述的原位雜交檢測試劑盒，其特征在于，所述對照探針的序列為 5’ 一 3’ AGTCTATGGTATTCAGTACTCA ;20ml 所述預雜交液中含 20XSSC 4ml、硫酸葡聚糖.4g、去離子甲酸胺 IOml> Poly A (10mg/ml) O. 5ml、魚精 ssDNA (10mg/ml) O. 5ml、tRNA (lOmg/ml) O. 5ml、IM ニ硫代蘇糖醇(DTT) 2ml、50*Denhardt’ s 0. 2ml ;所述封閉液為PBS 中加入.0.l%Triton-X100、3%正常山羊血清、3%BSA ;所述標記物為堿性磷酸酶熒光底物。
8.如權利要求2所述的原位雜交探針在制備肺癌細胞系或肺癌組織的miRNA原位雜交檢測試劑盒中的應用。
9.如權利要求3所述的原位雜交探針在制備食管癌細胞系或食管癌組織的miRNA原位雜交檢測試劑盒中的應用。
全文摘要
本發明提供了一種miRNA的原位雜交探針及其檢測試劑盒和應用。雜交探針的堿基五碳環第2位碳原子修飾了氟原子。優選序列如SEQ ID NO:1，其中第3、6、15、20個堿基五碳環第2位碳原子修飾了氟原子。另一優選序列如SEQ ID NO:2，其中第3、8、13、21個堿基五碳環第2位碳原子修飾了氟原子。探針的5’和3’端修飾地高辛。本發明還提供了一種含有上述雜交探針的miRNA的原位雜交檢測試劑盒。本發明的探針可以分別應用于制備肺癌細胞系或肺癌組織的miRNA原位雜交檢測試劑盒中和制備食管癌細胞系或食管癌組織的miRNA原位雜交檢測試劑盒中。本發明的試劑盒價格比較便宜，具有較好的特異性。
文檔編號C12N15/11GK102732619SQ201210185570
公開日2012年10月17日 申請日期2012年6月6日 優先權日2012年6月6日
發明者關新元, 李江超, 李焱 申請人:中山大學腫瘤防治中心