真皮微器官和產生及應用該真皮微器官的方法和裝置的制作方法

專利名稱：真皮微器官和產生及應用該真皮微器官的方法和裝置的制作方法
技術領域：
本發明涉及基于組織的微器官、治療性的基于組織的微器官以及采集、加工、植入和操作真皮組織的方法和裝置的領域。
背景技術：
已知有多種輸送治療劑的方法。例如，治療劑可以經口服、透皮、吸入、注射及帶緩釋的藥物庫(depot)來輸送。在每種情況下輸送方法均受到治療劑所經歷的機體過程、頻繁給藥的需要以及可以應用的分子的大小的限制等方面的限制。對于某些方法，治療劑的量在不同給藥之間變化。 可以以自主功能狀態在體外(“回體(ex vivo)”或“體外(in vitro)”)保持一段延長時間并且對其可以施加各種操作的真皮微器官(Dermal Micro Organ, DM0)隨后可以皮下植入或體內植入以用于治療疾病或病變，或者用于整形外科手術目的。DMO可以被修飾以表達感興趣的基因產物。這些修飾的真皮微器官通常被稱作真皮治療性微器官(DermalTherapeutic Micro Organ, DTM0)。已經觀察到例如如PCT/IL02/0880所述的包括表皮和真皮組織層在內的皮膚微器官與各種臨床挑戰相關。采集皮膚樣品使得在患者身上留下一個表面傷口，其可能持續幾周并且可能留下疤痕。采集的皮膚樣品需要大量的處理以從這一樣品產生微器官。而且，已經發現在皮下或者在機體更深處植入皮膚微器官導致產生角質囊腫(keratin cyst)或角質微囊腫(keratin micro-cyst)。另外,皮膚微器官作為移植物植入皮膚表面上的狹長裂口(slit)需要很高的技術能力來處理MO且同時保持其合適的方向。采集真皮以例如用作整形外科或美容方法中的“填充材料(filler material)”是現有技術中已知的。傳統的采集技術包括使用取皮機或解剖刀剝離表皮層以暴露真皮部分。然后可再次使用取皮機或解剖刀以手工采集真皮的暴露部分。另一項不常用的采集真皮的常規裝置是Padgett出產的Martin DermalHarvester (Part No. P_225)，其提示了從背部采集真皮核心，從而隨后在美容厚唇程序中植入嘴唇中。為了操作這一不常用的裝置，將一種鋒利的切割管(其包括內徑約4. 5mm的可重復利用的厚壁管)以非常低的速度進行手工旋轉。使用這一類型裝置通常需要直接在采集部位上方向皮膚表面施加壓力，并且隨著切割管的前進而通過主動牽引而實現縫合。另外，所得到的采集的真皮通常在尺寸上不均勻并且在真皮核心的一端包括表皮“塞(plug)”。發明概述本發明一些方面的實施方案提供了 DM0/DTM0，其能夠以通常存活狀態保持在體外(ex vivo)，使得在DMO上實現各種操作，而同時保持所希望的治療劑的高生產和分泌水平。另外，本發明的一些方面的實施方案提供了采集DMO并隨后植入DTMO的方法，其在例如將DTMO植入皮下或機體的更深處時不會形成角質囊腫或角質微囊腫。另外，本領域技術人員能夠理解本發明一些實施方案的方法和裝置可以是相對不復雜的，因此對實現本發明方法和/或使用本發明裝置的專業人員的技術水平的需求可不像常規方法所需求的那樣高。本發明的一些舉例實施方案提供了具有多種真皮組分的真皮微器官(DM0)，其包括真皮組織細胞和周圍基質。本發明實施方案的DMO通常可以保持其所獲自的真皮器官的微觀結構和三維結構，并且DMO的尺寸可以使得充足的養分和氣體被動擴散進細胞以及細胞廢物擴散出細胞，從而使由于養分不足和廢物積累導致的細胞毒性和伴隨的死亡降至最低。在本發明的一些示例性實施方案中，本發明的真皮微器官不產生角蛋白或者產生可忽略量的角蛋白。在本發明的一些實施方案中，在植入皮下或機體更深處后，所述真皮微器官不產生角蛋白和/或角質囊腫。在本發明的另一實施方案，本發明的真皮微器官會產生微小的角質囊腫，其隨后在相對較短的時間例如皮下植入后幾天或幾周內萎縮。在本發明的另一實施方案中，本發明的真皮微器官含有毛囊和皮脂腺，它們在短時間例如幾天或幾周后萎縮。在本發明的另一實施方案中，本發明的真皮微器官含有腺體，其在短時間如幾天或幾周后與皮膚表面相接。本發明的進一步的示例性實施方案提供了采集真皮微器官的方法和裝置。所述方法可包括穩定和/或支撐一種待采集真皮微器官的皮膚相關組織結構，從而例如所述皮膚相關組織結構保持在所希望的形狀和/或位置，從所述皮膚相關組織結構分離至少一部分真皮微器官，以及將所述分離的真皮微器官從機體分離出。根據一些示例性實施方案，支撐構造可包括一種第一管狀構件，切割工具可包括一種第二管狀構件，該第二管狀構件適于沿第一構件呈基本同軸方向插入。根據其它的示例性實施方案，支撐構造可包括一真空腔，其具有能將皮膚相關組織結構保持在所希望的形狀和/或位置的內支撐表面，以便使切割工具能從所述皮膚相關組織結構分離DM0。本發明的進一步示例性實施方案提供了表達至少一種重組基因產物的遺傳修飾的真皮微器官，所述真皮微器官具有多個真皮成分，包括真皮組織的細胞和基質，它們保持其所來源的真皮組織的微觀結構和三維結構，并且具有所選擇的尺寸從而可以向細胞被動擴散充足的養分和氣體并且將細胞廢物擴散出細胞外以使由于養分不足和廢物積累導致的細胞毒性和伴隨的死亡最小化，其中所述真皮微器官的至少一些細胞表達至少一種重組基因產物或至少所述一種重組基因產物的至少一部分。本發明的進一步示例性實施方案提供了表達至少一種重組蛋白的遺傳修飾的真皮微器官，所述真皮微器官具有多個真皮成分，包括真皮組織的細胞和基質，它們保持其所來源的真皮組織的微觀結構和三維結構，并且具有所選擇的尺寸從而可以向細胞被動擴散充足的養分和氣體并且將細胞廢物擴散出細胞外以使由于養分不足和廢物積累導致的細胞毒性和伴隨的死亡最小化，其中所述真皮微器官的至少一些細胞表達至少一種重組蛋白的至少一部分。在本發明的一些實施方案中，本發明的遺傳修飾的真皮微器官基本上不產生角蛋白。 在本發明的一些實施方案中，本發明提供了一種向受體輸送由真皮微器官產生的重組基因產物的方法。在一些實施方案中，本發明提供了一種通過在受體中植入真皮微器官而導入局部或系統性生理效應的方法。在另一實施方案中，本發明提供了一種輸送感興趣的蛋白質給一個個體的方法。所述方法包括將遺傳修飾的真皮微器官植入皮膚中、植入皮膚下或植入機體的其它部位。
在另一實施方案中，本發明提供了一種植入真皮微器官從而避免或降低角質囊腫形成的方法。附圖簡述以下參照附圖描述本發明的非限制性實施方案。在附圖中，在一個以上圖中出現的相同或類似的結構、構件或其部分在它們所出現的圖中通常用相同或類似的標記代表。圖中所示成分和特征的尺寸主要是為方便和清楚而選擇，而非大小必須是這樣。圖I是根據本發明的一個示例性實施方案，產生和利用真皮治療性微器官(DTMO)的示例性方法的示意性框圖流程圖。圖2A和2B分別顯示了根據本發明的一個實施方案，植入前的mINF a -TMO和hEPO-TMO的體外分泌以及其植入后的血清體內水平之間的相關性分析。圖3A和3B分別顯示了根據本發明的一個實施方案，在自體TMO植入小型豬后由ELISA分析測定的升高的血清hEPO水平和網織紅細胞計數升高。圖4是顯示從六種不同人皮膚制備的DTMO-hEPO分泌人促紅細胞生成素(hEPO)的水平的不意圖。圖5 顯示了 DTMO 和分層皮膚 TMO (split thickness skin TMO)的組織學。圖6顯示了 DTMO的免疫組織化學(IHC)和蘇木精曙紅(H&E)染色。圖7證實將DTMO-hEPO和分層皮膚TMO-hEPO皮下植入SCID小鼠后的體內hEPO血清水平和對血細胞比容水平的生理學作用。圖8顯示了皮下植入SCID小鼠中的DTMO-hEPO和分層皮膚TMO-hEPO的臨床和組織學分析。圖9顯示了接入皮膚裂縫(skin slit)中的皮膚MO (分層皮膚MO，右側)或皮下植入健康志愿者中17天后的皮膚MO (DM0，左側)的組織學分析。

圖10是示出本發明一些示例性實施方案中的采集DMO的方法的示意性流程圖。圖Ila — Ilc是根據圖10的方法采集DMO的示例性步驟的示意圖。圖12是根據本發明的一些示例性實施方案的真皮采集裝置可以使用的夾持工具示意圖。圖13是根據本發明的一些示例性實施方案的真皮采集裝置的示意圖，該裝置包括一個插入源組織獲取DMO的鉆取管(coring tube),并且用一內導引針(inner guideneedle)共軸采集。圖14a - 14c分別是根據本發明的一個示例性實施方案的真皮真空采集裝置的正視圖、側視圖和俯視圖。圖15是根據本發明的一個示例性實施方案將真皮微器官保持在希望的位置的圖14a - 14c的裝置的橫截面側視圖。圖16是在外部保持待采集的真皮微器官在一希望位置的圖15的裝置的橫截面側視圖。圖17是根據本發明的另一示例性實施方案的真皮采集裝置的示意圖。圖18是根據本發明的再一示例性實施方案的真皮采集裝置的示意圖。圖19是操作圖18的采集裝置以用于采集DMO的示意圖。
圖20是根據本發明的一些實施方案的DTMO植入方法的流程圖。圖21是根據本發明的一些實施方案的DTMO切除方法的流程圖。圖22是根據本發明的一些實施方案的處理采集的DMO的系統的示意圖。示例性實施方案的詳細描述以下描述使得本領域技術人員能夠根據特定的應用及其需求制造和使用本發明。所描述的實施方案的各種改變對于本領域技術人員而言是顯而易見的，本文所描述的一般原理可以適用于其它實施方案。因此，本發明并非限于所顯示和描述的特定實施方案，而是符合與本文公開的原理和新特征相符合的最寬的范圍。在其它情況中，在不妨礙本發明的情況下，一些熟知的方法、程序和成分沒有詳細描述。在以下詳細描述中，指出了各種具體的細節以便詳細理解本發明。但是，本領域技術人員能夠理解本發明無需這些具體細節即可實施。本文所用術語的示例性定義本文所用術語“外植體(explant) ”在本發明的某些實施方案中是指從一個個體的一或多種組織或器官取下的活組織或器官部分。本文所用術語“真皮微器官”或“DM0”在本發明的某些實施方案中是指來自一外植體的或與該外植體相同的分離的組織或器官結構，其以一種有益于細胞存活性和功能的方式被制備，并且保持至少一些與其所來源的組織或器官相似的體內相互作用。真皮微器官可包括多個保持了其所來源的組織或器官的微觀結構和其所來源的真皮組織的三維結構的真皮成分，其尺寸的選擇是允許充足的養分和氣體能被動擴散至MO內的細胞并且允許細胞廢物擴散出MO的細胞，從而使由于營養不足和廢物積累所致的細胞毒性和伴隨的死亡最小化。真皮微器官可基本上由多個真皮成分(位于表皮之下的皮膚組織成分)組成。這些成分可含有皮膚成纖維細胞、上皮細胞、其它細胞類型、毛囊基部、神經末梢、汗腺和皮脂腺以及血管和淋巴管。當下文使用時，與MO相關的實施方案的描述也涉及真皮MO。當使用術語“真皮組織”時，其也涉及“真皮器官”。本文所用術語“微觀結構(microarchitecture)”在本發明的某些實施方案中是指外植體這樣的特征,其中在一個實施方案中至少約50%、在另一實施方案中至少約60%、在另一實施方案中至少約70%、在另一實施方案中至少約80%、在另一實施方案中至少約90%或更多的群體細胞在體外保持它們與其在體內所物理和/或功能性接觸的至少一個細胞或非細胞物質的物理和/或功能性接觸。優選地，外植體的細胞保持其所分離自的器官或組織的至少一種生物學活性。本文所用術語“供體”在本發明的某些實施方案中是指一個對象，從該個體取出了外植體并用于形成一或多個微器官或者其已經呈一或多個微器官的形式。本文所用術語“治療性微器官(ΤΜ0)”在本發明的某些實施方案中是指可以用于實現治療目的的微器官(MO)，例如一種已被遺傳改變或修飾以產生一種治療劑如蛋白質或RNA分子的MO。治療劑可以是天然存在的機體物質或者可以不是。當以下使用時，相關于TMO的實施方案的描述也涉及DTM0，其是一種在本發明的某些實施方案中可以是遺傳修飾的治療性真皮MO。本文所用術語“植入(implantation)”在本發明的某些實施方案中是指將一或多個TMO或DTMO導入一個受體，其中所述TMO或DTMO可以來自受體的組織或者來自另一個體或動物的組織。TMO或DTMO可以通過皮下植入而植入皮膚內的一個裂縫中，或者通過放置在受體體內其它希望的部位而植入。本文所用術語“受體”在本發明的某些實施方案中是指一個對象，其中植入了一或多個TMO或DTMO。

本文所用術語“夾持(clamping)”(例如皮膚)可以指任何類似的動作或具有類似目的的動作，例如“捏(pinching)”(例如皮膚)。本文所用術語“體外(in vitro)”應被理解為包括“回體(ex vivo)”。本文所用術語“鉆取管(coring tube)”可以單獨地或統稱地涉及術語“切割工具”、“切割管”和“鉆取針”以及具有類似功能的任何其它構件。盡管為了描述的清楚和完整，本文中描述的DTMO的產生和應用的所有方面并且本發明的實施方案的描述從過程的起始描述到結束，但是應理解的是，本文描述的每一方面可以與實現其它方面的其它方法學和/或設備一起應用并且可以用于其它目的，這些其它目的中的一些在本文中有描述。本發明包括用于制備和保持真皮微器官以轉化成DTMO的那些部分。應理解的是根據本發明的這些方面產生的真皮微器官可以用作轉化成DTMO以外的其它目的。在本發明的一些實施方案中，微器官是包括多種真皮成分的真皮微器官，所述多種真皮成分例如為成纖維細胞和/或含有神經末梢和/或汗腺和/或皮脂腺和/或血管和淋巴管和/或彈性蛋白纖維和/或膠原蛋白纖維的上皮成分和/或內皮成分和/或免疫系統衍生的細胞和/或胞外基質。如以下實施例部分總結的測試結果所示(實施例5、圖8)，在小鼠和豬(在豬中的數據未示出)中進行包括表皮層的微器官(“分層皮膚MO”)的傳統皮下植入可能導致角質囊腫或大角質囊腫的形成。相反，當根據本發明示例性實施方案取皮膚組織樣品以獲得DMO時，在小鼠、豬或人中未觀察到囊腫或大囊腫。應注意的是根據本發明的實施方案的DTMO的生物學活性(例如，對治療性蛋白質例如促紅細胞生成素的分泌以及其所導致的血細胞比容的升高)可以與分層皮膚衍生的TMO相當或甚至更高(見實施例4)。也即，兩種類型的制備方法可以釋放相同量的促紅細胞生成素；但是DTMO每單位可產生和分泌比分層皮膚衍生的TMO更高的蛋白質水平。總之，DTMO的產生可以包括DMO采集、保持DMO和/或修飾DMO和/或對它們進行遺傳改變，以及在某些實施方案中驗證DMO是否產生所需藥劑(例如蛋白質)。DTMO的應用可包括在患者或動物自身身體內產生治療性物質如蛋白質以治療對象。例如，DTMO可被植入對象皮膚內或皮膚下或身體內以體內產生藥劑/蛋白質。在組織來源于另一對象的情況中，任選地植入體被保護例如通過將DTMO裝入免疫保護性囊(capsule)或鞘(sheath)而免于與受體的免疫系統反應。例如，可放置一種膜來圍繞DTM0，這可以通過在植入前將DTMO置于囊中來實現，或者以其它方式實現。膜的孔大小應足夠大以允許養分、廢物和治療劑的穿過，且足夠小以防止免疫系統細胞穿過。在本發明的一些實施方案中,真皮微器官可以含有基底表皮層的組織和任選地皮膚其它表皮層。在其它一些實施方案中，真皮微器官不包括基底層組織。在本發明的一些實施方案中，DMO不包括表皮層。在其它一些實施方案中，DMO可含有幾層表皮組織。在本發明的一個實施方案中,DMO包括整個真皮剖面(cross-section)。在本發明的另一實施方案中，真皮微器官包括真皮剖面的一部分。在另一實施方案中，DMO包括真皮剖面的大部分，即真皮各層和成分的大部分，包括乳頭狀和網狀真皮。在另一實施方案中，DMO主要包括真皮組織，但也可包括脂肪組織。在本發明的一些實施方案中，DMO不產生角蛋白或產生可忽略量的角蛋白，從而防止在皮下植入受體后產生角質囊腫。待采集的DMO可以通過現有技術中已知的任何切除組織的手段如活檢法從身體中切下。采集程序保持組織微觀結構完整。在一個實施方案中，DMO可通過直接活檢獲得， 然后被切割成所需大小或者從其中切割掉不希望的組織。在另一實施方案中，組織樣品可以通過直接活檢獲得，其獲得所需大小的真皮微器官而無需進一步加工。在本發明的一些實施方案中，真皮微器官直接從身體采集，用于采集真皮微器官的切割工具的大小可以例如直徑為約I 一 4_。在另一實施方案中，尺寸可以是例如直徑1.71mm。在另一實施方案中，尺寸可以是例如直徑I — 3mm。在另一實施方案中，尺寸可以是例如直徑2 — 4mm。在另一實施方案中，尺寸可以是例如直徑I 一 2mm。在另一實施方案中，尺寸可以是例如直徑約I. 5_。在另一實施方案中，尺寸可以是例如約2_。在一些實施方案中，采集的真皮微器官可以在采集后不保持其圓柱體形狀，即其剖面的至少一維可以擴大，而其剖面的至少另一維可以收縮。在一個實施方案中，至少一維可以是0.5-3. 5_且至少一維可以是I. 5-10mm。在另一實施方案中，被采集的組織的尺寸可以是例如長度為約5 — 100mm。在另一實施方案中，被采集的組織的尺寸可以是例如長度為約10 - 60_。在另一實施方案中，被采集的組織的尺寸可以是例如長度為約20 - 60_。在另一實施方案中，被采集的組織的尺寸可以是例如長度為約20 - 50mm。在另一實施方案中，被采集的組織的尺寸可以是例如長度為約20 - 40mm。在另一實施方案中，被采集的組織的尺寸可以是例如長度為約20 - 100mm。在另一實施方案中，被采集的組織的尺寸可以是例如長度為約30 — 100mm。在另一實施方案中，被采集的組織的尺寸可以是例如長度為約40 — 100_。在另一實施方案中，被采集的組織的尺寸可以是例如長度為約50 — 100_。在另一實施方案中，被采集的組織的尺寸可以是例如長度為約60 — 100_。在另一實施方案中，被采集的組織的尺寸可以是例如長度為約70 - 100mm。在另一實施方案中，被采集的組織的尺寸可以是例如長度為約80 - 100mm。在另一實施方案中，被采集的組織的尺寸可以是例如長度為約90 —100_。在本發明的一些實施方案的一個方面，在采集過程中可以使用一種封閉的、無菌的生物反應器裝置來攜帶、支撐和/或改變DMO或DTM0。在另一實施方案中，長度可以是約20mm。在另一實施方案中，長度可以是約30mm。在另一實施方案中，長度可以是約40mm。當真皮MO具有上述尺寸時，其可以在合適的組織培養條件下體外保持在例如生長培養基中一段延長時間，例如幾天、幾周或幾個月。DMO可以例如體外保持在已知成分的生長培養基中。在一個示例性實施方案中，生長培養基可以包括生長因子、胎牛血清(FCS)或人血清，例如合成血清替代品(SSS)。在另一示例性實施方案中，生長培養基可包括來自供體或受體對象的血清。在另一實施方案中，生長培養基可包括自體血清。根據本發明的一些實施方案的一個方面，在采集、改變和植入全過程中、例如從采集至植入，可以使用一種封閉的、無菌的生物反應器裝置來攜帶、支撐和/或改變DMO或DTM0，如下例如參照圖22所詳細描述。根據一些示例性實施方案，生物反應器裝置的至少一部分可以由可置換材料形成。根據本發明的一些實施方案的一個方面，生物反應器裝置可以置于一底座中，其可以用于進行各種方法和/或保持DM0/DTM0在所希望的條件下。裝置可以任選地根據一個方案由計算機控制。根據本發明的一些實施方案的一個方面，僅僅是所產生的DTMO的一部分可以用于給定的治療過程。其余的DTMO可以返回進行保持和/或可以被貯存(例如低溫或其它方式)以便以后使用。 本發明的一些實施方案的一個特征是許多真皮微器官可以在一種分批方法中一起被加工成DTM0，如下所述。這使得加工更方便，但是卻不能單獨測定每一 DTMO的分泌水平。在本發明的一些示例性實施方案中，可以對可以由一個單DTMO或一批DTMO產生和/或分泌的治療劑進行一種效力分析。效力分析可包括例如細胞增殖分析，其中細胞的增殖應答主要依賴于治療劑在細胞的生長培養基中的存在。本文所用術語“皮膚相關組織結構”是指組織成分的一種結構，其可以由本文定義的裝置穩定化和/或支撐從而使得可以從其采集真皮微器官。皮膚相關組織結構可以包括表皮組織成分和真皮組織成分。任選地，皮膚相關組織結構可以包括位于真皮組織附近的脂肪組織和/或肌肉組織。根據本發明的一些實施方案，采集皮膚微器官的方法可以包括穩定和支撐待采集真皮微器官的皮膚相關組織結構，從而至少真皮微器官和/或其附近的一或多種其它組織片段被保持在所希望的形狀和/或位置，從周圍組織分離至少一部分真皮微器官，以及提取所分離的真皮微器官，如下所詳細描述。圖I以框圖形式顯示了根據本發明的一個示例性實施方案的用于產生和應用DMO和DTMO的方法學200的概括。在框202，從一個對象采集DM0。在本發明的一些實施方案中，DMO采集自稍后要進行治療的同一對象。在本發明的一個實施方案中，DMO來自真皮組織。任選地，以與以下參照真皮組織描述的類似的方式采集和使用其它組織。但是，下面描述的方法是示例性的，其它的采集組織樣品的方法可以用在本發明的一些實施方案中。如果需要，DMO可以低溫儲存直至以后使用(即在方法的同一階段引入)。或者，對于某些實施方案，DMO可以直接植入回到其所采集自的患者以產生治療性、美容性或其它生理學影響。為了使DMO成為活的微器官，其必須有至少一維尺寸足夠小從而養分可以從接觸DMO的營養培養基擴散到DMO的所有細胞，并且廢產物可以擴散出DMO進入培養基中。這使得DMO能在體外存活足夠長以進行以下描述的進一步加工以及任選地進一步應用DMO作為治療劑如蛋白質的來源。如上所述的采集DMO的方法通常產生具有幾個月的體外壽命的DMO。采集DMO后，任選地目視檢查以確定其合適地形成并且其具有所希望的尺寸。檢查也可以光學手段進行。任選地將其置于一架子上并運送(框206)至一裝置(生物反應器，如下文所述)，在該裝置中其可以被遺傳改變。制備一合適的遺傳修飾劑(框208)。制備遺傳修飾劑的另外的示例性方法包括用預定的稀釋緩沖液產生修飾劑例如一種病毒載體的具有所需量的等份，在控制的溫度(O - 4°C)下可低溫儲存和融化修飾劑，以及驗證修飾劑的活性。所有這些方法均是現有技術中熟知的。在這一點，可以低溫儲存DMO，以便以后導入方法中的同一處。這可以用已知的利用含有10% DMSO的DMEM培養基的用于組織和細胞的逐漸冷凍方案進行。在框210，DMO被遺傳改變。如上所述，已知有許多遺傳改變方法并可與本發明結合使用。作為一個例子，以下的描述基于使用一種病毒載體以將基因導入DMO的細胞中。這一方法是熟知的，以下不進一步描述，但是將病毒導入DMO的特定的方法學和裝置將會被描述。在框212，遺傳改變的DTMO任選地被測試以確定治療劑的產生和分泌率。有各種方法確定分泌的數量，例如ELISA、其它免疫測定、光譜分析等。另外，任選地確定分泌的 質量，例如分泌的蛋白質的無菌性和活性。這可以定期進行或者連續線性進行。在這一點DTMO可以低溫儲存以便以后使用。在框214和框216，確定產生所希望的治療效果所需的DTMO的量。如下所示，可以從所測量的分泌率、患者參數和對于估計的或已知的體外分泌和體內血清水平之間的關系的群體統計來估計治療劑量需求。在框218，將選定數目的DTMO置于植入工具中。示例性的實施工具如上所述。如果需要，為了同種異體移植或異種移植或者其它原因，DTMO可以被包囊化。如果DTMO必須在轉運至植入工具之前被轉運，其任選地保持(220)在維持站中，在此溫度、濕度等被保持在使得DTMO在轉運過程中能存活的水平。剩余的DTMO材料任選地在體外維持以備將來應用。這可以在可延長其體外存活性的暖保溫條件(30 - 37°C)、在上述條件中或在冷保溫條件(4°C)下。在框224，DTMO的一個亞群被植入對象中。植入方法的一個示例性實施方案如上所述。本領域技術人員已知其它方法，這些方法主要基于所使用的微器官的具體幾何形狀。動物研究已經表明DMO和DTMO在體內保持存活，因為在植入后DTMO在幾周和幾個月內持續產生和分泌治療劑(圖7)。在動物研究中，在直至160天(或更長)期間內產生了治療量。當DMO或DTMO的組織看起來是完整的或者被很好地帶進其所植入的對象的組織內(特別是如果組織被植入其被采自的同種組織中)時，包括DMO或DTMO的細胞持續產生和分泌治療劑。在每種情況下，任選地確定DTMO的體內性質(框228)。基于例如這一評價和/或過去的患者數據(框226)，患者劑量可隨后通過增加植入物的量或除去植入物的一部分而調節(框230)，如下所述。隨著植入物功效改變，可植入額外的DTM0。遺傳改變可通常包括將選定的一個或多個基因通過遺傳工程操作進入細胞,從而使細胞產生并任選地分泌所希望的治療劑如蛋白質。在本發明的一個實施方案中，在遺傳改變過程中保持DMO的方法的至少一部分以及遺傳改變本身在一生物反應器中進行，如下所述。現參照圖10，其示意性描述了根據本發明的一些示例性實施方案進行的采集真皮微器官的方法的流程圖，還參照圖lla-llc，其示意性描述了根據圖10的方法采集位于皮膚組織部分1120之下的真皮微器官1160的各代表性階段。如框1002所示，所述方法可任選地包括將一種本領域已知的麻醉劑局部給予待采集的DMO的附近。如框1004所示,所述方法可進一步包括將一種內導桿(inner guide) 1110插入組織部分1120。可優選地用外科手術柳葉刀、解剖刀或其它鋒利探針在外部皮膚形成細切口(“柳葉刀切口 ”)，以使得內導桿1110更易于插入，并且還防止采集表皮組織或使表皮組織采集減至最低。內導桿1110還可經切口 1190插入部分1120，例如大概平行于皮膚表面和/或位于真皮內所期望的深度或者就在皮膚下。內導桿1110可包括一細的針、桿或能夠被置于真皮內或皮下間隙的任何其它合適的細的通常為直的物體。例如，內導桿1110可包括一本領域已知的大小為20 - 25G、例如約22G的針。內導桿1110可被插入真皮中或皮下間隙和/或被大致水平地推進，即與皮膚表面大致平行。導桿1110在真皮內的穿透長度可大 致相應于待采集的DMO的長度。例如，內導桿1110可被手工插入，并且在真皮內經手動導引在所希望的深度，該深度可以在整個插入過程中被保持基本上一致。或者，內導桿1110可隨著其被插入通過手工感應纖維質真皮和之下的平滑脂肪層的界限而沿著皮下間隙被插入其中。如框1006所示，所述方法可任選地包括將內導桿1110例如在切口 1130導出皮膚。根據一些示例性實施方案，切口 1190和1130之間的距離可大約等于或大于待采集的DMO的所需長度。如框1008所示，所述方法還可包括將一管狀切割工具圍繞內導桿1110共軸插入，從而DMO可被捕獲，即位于內導桿1110和切割工具之間。這可以通過例如使用具有一大于內導桿1110外徑的內徑的管狀切割工具實現。所述切割工具可包括任何合適的切割工具，例如一種鉆取管1150。鉆取管1150可包括一大致上對稱的鋒利的管狀工具，例如一 hypo管，其加工成具有希望形狀的鋒利刀刃。鉆取管1150可包括例如一標準的醫用級管，具有薄壁，例如具有O. 05mm至O. 3mm的厚度。鉆取管1150可具有例如Imm至IOmm的直徑。鉆取管1150的尺寸例如直徑和/或內導桿1110的尺寸可基于要采集的DMO的體積和/或尺寸預定。鉆取管1150可具有鋒利的末端(“尖頭”)1140，其適于作為刀刃。優選地在皮膚外表面上產生初始切口例如切口 1130之后，鉆取管1150可被插入穿過組織部分1120，以防止采集表皮組織。根據本發明的一個示例性實施方案，例如如圖Ilb所示，所述方法可包括將鉆取管1150的末端1140初始定位在內導桿1110的遠端上，例如在切口 1130，并沿內導桿1110的長度滑動鉆取管1150，例如滑向切口 1190，以采集真皮DM0。如框1010所示，在一個實施方案中，所述方法可包括在例如朝向內導桿的近端推進切割工具的同時旋轉該切割工具。例如，在鉆取管1150被手動或自動推進時，可使用一種醫用鉆或其它合適的工具或旋轉機構旋轉該鉆取管1150，從而更平穩地采集DMO 1160。例如，鉆取管1150的近端1180可被連接至一種醫用鉆1170，如由Aesculap AG&Co. KG, AmAesculap Platz,D-78532 Tuttlingen,Germany 生產的 Aesculap Micro Speed 鉆，其可包括控制裝置、馬達、連接軟線、手機和/或腳踏開關，貨號分別為⑶650、⑶658、GB661、GB166和GB660。這種鉆或任何其它合適的鉆或旋轉機構可用于以適于切割真皮組織的轉速、例如相對較高的轉速例如高于1000RPM的速度、例如1000RPM至10000RPM之間的速度旋轉切割工具的刀刃。例如管1150可被以高于2000RPM、例如約7000RPM的轉速旋轉。或者，可使用小于1000RPM的相對較低的轉速，或者不旋轉，如下所述。任選地，鉆的轉速可以擺動方式變化，即旋轉方向可定期在“順時針”和“逆時針”方向之間變化。當由鉆1170旋轉時，鉆取管1150可被手動或自動推進，例如朝向內導桿1110的近端，例如朝向切口 1190。所述方法還可包括例如當尖頭1140前進至剛超過切口 1190時，停止鉆取管1150的前進運動。根據本發明的一些示例性實施方案，管1150的至少部分內表面和/或外表面可被一種低摩擦材料如Teflon、Parylene或任何其它合適涂覆材料涂覆，以便在后續作用中易于將采集的組織從切割工具的內表面分離和/或降低在切割作用過程中作用于組織上的任何力，如下所述。在另一實施方案中，可使用一種快速作用的例如彈簧承載的插入機構以輔助鉆取管1150穿透采集靶位并切割真皮，例如基本上不旋轉鉆取管。如框1012所示，所述方法可包括從鉆取管1150內撤出內導桿1110，例如使DMO1160釘在其上(impaled thereon)，從而從1120所示部分抽取DMO 1160。 根據一些實施方案，DMO 1160可被留在內導桿1110上。在這種情況下，內導桿1110 可用于留持(handle)、轉運(transport)和 / 或操作(manipulate) DMO 1160。或者，DMO 1160可以，例如，被小心地從內導桿1160移至生物反應器加工腔中，例如如下參照圖22所詳細描述的那樣；或者移至各種適于將DMO轉移至不同載片上的轉移裝置中(未示出)；或移至用于進一步加工的腔室中。這種轉移裝置可包括例如鑷子、真空鉗或任何其它能夾住DMO 1160和/或使DMO 1160離開內導桿1110的機械裝置。另外，可以單獨或與上述手段一起使用合適的液體如無菌液體以輔助將DMO移出內導桿1160。如框1014所示，所述方法還可包括從皮膚部分1120撤出切割工具例如鉆取管1150。本領域技術人員能理解的是可以實施上述動作的任何組合以進行本發明實施方案所述的采集。另外，可以使用其它動作或系列動作。根據本發明的一些實施方案，采集方法除了例如通過內導桿在內部穩定和/或支撐真皮之外，還可包括例如用外部支撐裝置和/或機構在外部穩定和/或支撐待采集的DMO和/或在待采集的DMO附近的組織，如下所述。還參見圖12，其示出了起穩定作用的夾持工具1200，其可與根據本發明的一些示例性實施方案的真皮采集裝置一起使用。根據本發明的示例性實施方案，工具1200可包括一具有夾持邊緣(clampingedges) 1210的夾持機構。例如，工具1200可包括例如本領域已知的尖嘴鉗(pinchingclamp)或鑷子。工具1200可包括一具有恒定夾緊力或可控制的可變夾緊力的彈簧夾。工具1200可被置于皮膚表面上與內導桿1110平行并位于其任一側上，從而，例如，當閉合時，夾持邊緣1210可位于內導桿1110之下。夾持邊緣1210當被合攏時可穩定和/或支撐內導桿1110和/或與待采集的DMO相關的皮膚部分1240，從而DMO在被管1150切割時可保持穩定。在這種情況下，當施加力時，鉆取管1150可經與內導桿同中心或不同中心的夾持邊緣1210推進。根據本發明的一些示例性實施方案,夾持邊緣1210可包括至少一排或兩排鋸齒1260以便更好地夾持部分1240并降低在鉆取過程中皮膚的橫向運動，例如使這種運動最小化。可以使用其它工具和/或機構以施加力至外部皮膚以引起圍繞在內導桿周圍的真皮的類似壓縮。或者，可使用用于穩定待采集的真皮的其它裝置和/或方法，如扭動內導桿并使之保持在相對于鉆取管的旋轉而言基本上固定的位置。另外參見圖13，其示意性示出根據本發明的一些示例性實施方案共軸沿內導桿1110插入其上的鉆取管1150的橫截面視圖。根據本發明的一些實施方案，內導桿1110可被置于皮膚部分1120中，其放置位置是使得導桿1110的軸1125基本上位于DMO 1160的中心。在這種情況下，鉆取管1150可基本上與內導桿1110共軸排列，從而DMO 1160以大約對稱的方式釘在內導桿1110上。但是，根據本發明的其它示例性實施方案，內導桿和鉆取管可以任何其它合適的排列方式放置。例如，內導桿可被置于皮下間隙，從而所需的待采集的DMO可主要位于內導 桿上并包裹圍繞之。相應地，鉆取管可被插入在內導桿上和/或被導引從而當鉆取管切割DMO時內導桿位于鉆取管下部內表面附近或接觸該下部內表面。在這種情況下，內導桿可保持DM0，在取出過程中DMO可例如保留在內導桿上表面。根據本發明的一些實施方案，被構造以用于實現上述采集DMO的一些或全部程序的集成裝置(未示出)可輔助上述手動程序。例如，在一個采集方法實施方案中，該集成裝置可被構造成能定位和指導內導桿1110的插入，附著夾持工具1200，指導鉆取管1150的插入和控制其在切割過程中的運動，和/或取出附著于內導桿1110上的DM01160。這種裝置可使得在進行采集程序時實現相對簡單的操作。根據本發明的一些示例性實施方案，從一個對象采集DMO的方法可包括產生和/或維持所需形狀和位置的例如通常位于用于采集DMO的靶采集部位的與DMO相關的皮膚相關組織結構，以便切割工具能從DMO附近的組織分離至少一部分DM0。例如，位于靶采集部位附近的表皮部分可被拉起，這例如通過將至少部分所述表皮部分附著于一預定的例如基本上平的表面區域而實現，從而至少部分所述皮膚相關組織結構被拉起并保持在所需的形狀和/或位置。根據一些示例性實施方案，附著表皮至預定的表面可包括施加一真空條件，例如如下所述。或者或額外地，附著表皮至預定的表面可包括向表面施加一粘合劑。現在參見圖14a-14C，其分別示意性描述了根據本發明的一個示例性實施方案的用于采集DMO的真皮采集裝置1400的主視圖、側視圖和俯視圖。另外參見圖15，其示意性描述了正在實施的裝置1400的橫截面側視圖，該裝置正在根據本發明的一個示例性實施方案實施用于將包括DM01510的皮膚相關組織結構外部支撐在一期望位置。裝置1400可包括一真空腔，例如一大致為圓柱體的長腔1406，其具有一經多個通道1404與真空入口 1402流體相通的上支撐表面1430。真空入口 1402可與至少一個真空源例如真空泵(未示出)流體相通，以向腔1406提供真空條件。表面1430和/或通道1404可構造成當例如通過真空源向腔1406施加真空條件時，能使與DMO 1510相關的表皮層1508的至少一部分，例如大致位于DMO 1510之上的部分，附著在表面1430。裝置1400還可包括一導向通道(guiding channel) 1416以導引切割工具例如鉆取管1520，并將切割工具保持在預定位置，例如，距離上表面1430預定的距離。例如，切割工具1520的上表面可距離上表面1430 —定距離，例如約1mm。在另一實施方案中，也可以使用其它范圍如O. 3-2. 0_。通道1416可包括例如一直徑稍大于鉆取管1520的外徑的大致為圓柱體的通道。鉆取管1520可包括一尺寸例如為Imm至IOmm之間、例如14G(相當于外徑約為2. Ilmm)并具有基本對稱的鋒利刃口的鉆取針(coring needle)。根據本發明的示例性實施方案，表面1430可以是平的、通常是曲面，或可以具有任何其它合適形狀。例如，在一個實施方案中，表面1430可以具有約3. 5_的曲率半徑。在一個實施方案中，腔1406可具有例如約4mm的寬度。另外，在一些實施方案中，表面1430的曲率半徑和/或腔1406的寬度和/或高度也可使用其它范圍例如3-25mm，例如，在本發明一些實施方案中可以使用在3-25mm范圍內的任何合適尺寸。腔1406的長度可以通常類似于被采集的DMO的長度，例如長度約30mm ;但是腔長度也可以是其它范圍，例如，5_100mm的范圍。根據一些示例性實施方案，裝置1400可包括兩個通道1408，其分別至少部分沿腔1406兩側分布，以使得能夾持表皮層1508，如下所述。通道1408可以定位于例如中心位于希望的高度，例如與待采集的DMO的中心大約相同的高度。在一個實施方案中，通道1408的中心可位于上表面1430之下約2mm的高度，從而夾持可穩定和/或支撐被切割的組織。根據這些示例性實施方案，裝置1400還可包括在通道1408的內表面或外表面的兩個柔性 膜構件1412，從而使得在外部夾持組織而基本上不影響施加于腔1406的真空條件。根據本發明的其它實施方案，裝置1400可不包括構件1412和/或通道1408。根據本發明的示例性實施方案，用裝置1400采集DMO 1510的方法可包括形成兩個切口(未示出)，例如用解剖刀在與DMO 1510相關的皮膚部分以預定的距離例如約30mm形成兩個柳葉刀切口，所述預定的距離可相應于鉆取管1520要進入表皮1508和從表皮1508出來的點(“穿透進入和穿透出口部位”)。可形成這些切口以保證在采集的DMO 1510的兩端基本上沒有表皮成分，和/或維持穿刺部位的所希望的形狀從而它們可以高效即快速愈合和/或留下相對較小的疤痕。所述方法也可包括將裝置1400與表皮層1508(“采集部位”)接觸從而切口位于腔1406之下，即位于點1410和1414之間。切口可以分別位于點1410和/或1414，或者可以位于點1410和1414之間以幫助柳葉刀切口在真空條件被施加于腔1406時“張開”。根據一些示例性實施方案，裝置1400可任選地包括構造用于例如在裝置1400被置于采集部位上之后并且真空條件被施加于腔1406之前時產生柳葉刀切口的機構，例如產生柳葉刀切口的彈簧柳葉刀。所述方法還可包括將鉆取管1520插入通道1416。鉆取管1520可例如通過一接頭例如捷可勃斯夾頭(Jacobs Chuck)或一摩擦固定器與一醫用鉆或能旋轉鉆取管1520的任何其它合適工具和/或機構例如鉆1170 (圖11)連接。任選地，鉆的旋轉速度可以擺動方式變化，即旋轉方向可定期在“順時針”和“逆時針”方向之間變化。所述方法還可包括向腔1406施加真空條件，例如通過激活真空源而施加。結果，皮膚相關組織結構可被吸入腔1406中，并且例如在柳葉刀切口之間的表皮1508可以相對于表面1430而被牢固地保持。根據每種組織層的厚度以及腔1406的尺寸，表皮1508、真皮1506和/或脂肪組織成分1504可額外地被吸入腔1406。因此，腔1406的尺寸可以根據一或多個組織層的預計厚度而被設計，和/或可以施加例如本文所述的外部夾持，從而被吸進真空腔1406的脂肪組織1504可被向下驅使并基本上離開腔1406。所述方法可進一步包括例如用鉆1170 (圖11)以相對較高的速度例如高于1000RPM、例如1000RPM和10000RPM之間、旋轉鉆取管1520。例如，鉆取管可以高于2000RPM、例如約7000RPM的轉速被旋轉。或者，可以使用低于1000RPM的相對較低的速度，或者根本不旋轉，如上所述。所述方法還可包括將鉆取管1520沿真空腔1406前進，例如至少沿腔1406的整個長度前進。鉆取管可被導向通過通道1416以保證真皮微器官1510采集自與沿腔1406的皮膚相關組織結構的深度大約相同的深度。鉆取管1520可被手動推進或者使用一種電動驅動裝置(未示出)推進，從而例如控制鉆取管1520前進的速度。所述方法還可包括使DMO 1510與DMO 1510周圍的組織剝離。例如，裝置1400可包括一伸長件(extension) 1418,例如長度在Imm和5mm之間，并且其半徑基本上等于通道1416的半徑，其基本上位于通道1416的相反側，從而鉆取管在穿過通道1406后可前進到伸長件1418中。或者，例如由硅氧烷或其它合適材料制成的切割表面1440可位于伸長件1418中，從而鉆取管可切割進表面1440中以剝離采集的DM0。另外，可在鉆取管1520內施加真空條件，例如從其后端開始，以便DMO 1510可被主動吸入鉆取管1520中，由此使DMO從其周圍組織中最終剝離。 所述方法可進一步包括從裝置1400中撤出鉆取管1520、包括其中的DMO 1510。參照圖16，其示意性示出了正在實施的裝置1400的橫截面側視圖，裝置1400正在根據本發明的另一示例性實施方案被操作以在外部支撐皮膚相關組織結構在一希望的位置。根據圖16的示例性實施方案，可通過外部夾持支撐在真空腔內的皮膚相關組織結構來實現真皮1506的改進的穩定化和/或改進的防止脂肪1504進入真空腔1406內。例如，可操作一種類似于圖12中的所述的夾持工具的夾持工具1600以例如對稱地“夾緊(pinch)”支撐在真空腔1406中的皮膚相關組織結構。夾持工具1600的兩個夾持末端1502可分別插入腔1408中。工具1600可被閉合從而夾持末端1502可下壓柔性件1412。由此，腔1406中的皮膚相關組織結構可被從兩側夾持而基本上不影響腔1406中的真空條件。由夾持末端1502施加的夾緊力可相應于例如彈簧1512或其它合適裝置的恒力或變力。盡管上述描述可參照在長軸上具有基本上恒定形狀和/或大小的真空腔，但是本領域技術人員能理解根據本發明的其它實施方案，真空腔可以具有任何其它預定的尺寸和/或形狀，例如如下所述。參照圖17，其示意性描述了根據本發明另一示例性實施方案的真皮采集裝置1700。裝置1700可包括一真空腔1701，該真空腔1701包括一高位突出體1706。高位突出體1706可具有預定的大小和/或形狀，其適于例如產生高于鉆取管1716軌道之上的大致平向的皮膚組織單層“平臺(plateau)”。例如，部分1706可高于腔1701的其它部分，從而脂肪層1718可被吸入部分1706中并沿鉆取管1716的軌道支撐。其結果是，在采集預定長度的DMO后，鉆取管1716可被輕輕推進脂肪層1718中，由此將采集的DMO與圍繞DMO的組織分離開。在鉆取管1716撤出身體后，采集的DMO保持在鉆取管1716內。裝置1700的構造可以無需在皮膚中形成例如如上所述的“出口”切口，由此使得可以僅用一個切口即可采集DMO。根據本發明的一些示例性實施方案，裝置1700還可包括一鉆制動器(drillstopper)1708以使得可以沿腔1701手動前進鉆取管1716 —段預定距離，例如前進至鉆取管1716稍進入脂肪組織1718的一個位置。
參照圖18，其示意性描述了根據本發明的再一示例性實施方案的真皮采集裝置1800。圖19示意性描述了操作圖18的采集裝置1800以用于采集DMO 1830的橫截面圖。根據一些示例性實施方案，可以使用如下所述的類似于例如在乳腺癌活檢中使用的裝置的活檢鉆取裝置來采集DM0。裝置1800可包括一切割工具1808，例如如上所述，和一皮下采集套針(HST) 1806，例如一種具有鋒利尖頭1804和例如稍大于切割工具1808外徑的合適內徑的皮下針，從而切割工具1808可被插入HST 1806內并基本上與其共軸。HST1806可包括一合適寬度(例如Imm或更高)以及合適長度(例如基本上等于待采集的DMO的所希望長度)的槽口 (notch cutout)(“窗口，，) 1802。根據圖18的示例性實施方案，可例如用一解剖刀片形成一單切口例如柳葉刀切口，通過這一切口 HST 1806可與切割工具1808例如作為一個單元插入到皮膚之下或皮膚中的所希望位置，優選地在皮下間隙中，并且使槽口 1802方向向上朝向真皮層1840。切割工具1808在穿透過程中可以被置于HST 1806內，以便窗口 1802可被“關閉”以允許HST1806大致平滑地穿透。工具1808和其所插入的HST 1806可沿皮下界面前進槽口 1802的長 度，且末端1804可不穿出皮膚表面。到達合適位置后，工具1808可被縮回以露出槽口 1802并使得真皮組織基本上充滿槽口。例如使用合適的夾持工具例如上述參照圖12描述的夾持工具可以在皮膚表面上施加合適的壓力，和/或可以通過例如位于槽口 1802之下的真空歧管(未示出)向HST 1806內施加真空條件以輔助真皮基本上充滿槽口 1802。工具1808可以與一例如如上所述的馬達連接以旋轉工具1808，轉速適于切割真皮組織，例如一相對較高的轉速，例如高于1000RPM的速度，例如在1000RPM至10000RPM之間的速度。例如，工具1808可被以高于2000RPM、例如約7000RPM的轉速旋轉。工具1808可以隨后例如經手動或自動推進，例如直至其穿過窗口槽口 1802的末端以切割槽口 1802內的DM01830。當完成時，可以停止工具1808的前進和旋轉運動，可縮回切割工具1808并且采集的DMO 1830位于其內。HST 1806隨后可從采集部位取出。DMO 1830可以從切割工具1808上取下，例如使用注射器用無菌液體例如鹽水沖洗通過工具1808，或者用真空源從切割工具1808的后端(未示出)吸出DMO 1830。本領域技術人員能理解裝置1800使得能夠僅形成一個切口就可采集DM0。另外，裝置1800可有效用于從具有相對較厚皮膚的區域例如從供體后背區域采集DM0。本領域技術人員能理解例如如上所述的根據本發明實施方案的采集方法和/或裝置可以包括在真皮內導入薄組織切割裝置。因此根據本發明的實施方案的采集方法和/或裝置可使得在采集DMO時對外部皮膚表面產生相對最小的損傷，并因此可提供一種侵害性最小的采集所希望的組織的方法。盡管本文所述的本發明的一些實施方案是用于采集DMO的方法和/或裝置，但是本領域技術人員能理解根據本發明的其它實施方案，至少一些方法和/或裝置可用于實施任何其它程序，例如整形外科程序、皮膚病學程序或包括采集組織的任何其它程序。例如，本發明實施方案的方法和/或裝置可用于采集例如在一后續實施中待用作填充材料的真皮組織。根據本發明的一些實施方案，提供了一種用于回體(ex-vivo)(體外“in vitro")處理或加工真皮微器官的系統和方法。作為直接MO被采集的真皮組織可被留在作為MO支撐物的內導桿上。在這些實施方案中，內導桿可被用于在后續加工中保持MO的位置和方向。在其它一些實施方案中，真皮MO可被從內導桿上取下并直接置于組織培養孔或生物反應器的轉導腔內，例如如下參照圖22的詳細描述。在一些實施方案中，例如，如果DMO從皮膚取出后留在鉆取管中，可用生物學相容液體例如鹽水或生長培養基施加于鉆取管的后端而將DMO從鉆取管中沖洗出。DMO的沖洗可以是使得其被直接沖入生物反應器的腔中，例如如下所述。或者，可以向鉆取管的后端施加真空以“吸出”DM0，例如直接進入生物反應器的腔中。根據本發明的一些實施方案,提供了一種用于植入DTMO的方法。在產生和/或例如通過遺傳修飾DMO而加工DMO后，修飾的DMO或DTMO可被植回患者內，以例如用于基于蛋白質或RNA的治療。被植入的完全或部分DTMO的數目可根據分泌的蛋白質的期望治療劑量而確定。DTMO可植入皮下或者身體內的任何其它位置。使用套針皮下植入例如可以使得DTMO在皮下間隙中保持線性形式。在以后需要切除DTMO例如以終止治療或降低治療性蛋白質的劑量的情況下，線形形式的植入可有助于定位。也可以使用其它已知的幾何形狀 植入模式。線性植入也可有助于真皮組織整合進周圍組織。現參照圖20，其示意性描述了根據本發明的一些實施方案的DTMO植入方法的流程圖。如框2002所示，可任選地在期望植入的部位給予局部麻醉。如框2004所示，根據本發明的一些實施方案，DTM0、任選地與周圍的無菌鹽水一起可被吸進一載體例如一植入針中，例如附著于一注射器的植入針。針可以具有任何合適的直徑，例如在17 口徑一 12 口徑(gauge)之間。任選地，針頭可附有一硅氧烷管或類似物的短伸長件，以便于在縮回注射器活塞時DTMO吸進針管內。如框2006所示，載有DTMO的植入針可被推進皮膚，例如不帶有硅氧烷管伸長件，進入皮下位置，前進大約等于DTMO的長度的距離。如框2008所示，根據一些實施方案，所述方法可包括在吸入的真皮治療性微器官上施加壓力以使得真皮治療性微器官離開載體進入植入部位。如框2010所示，在出口點可用一夾具例如鑷子抓住DTMO的末端。如框2012所示，植入針可被縮回穿過皮下間隙，從植入針釋放DTMO并將DTMO沿針道線性放置。如果需要，例如可通過在縮回過程中輕輕向下推注射器活塞而給予輔助以幫助釋放DTMO。如框2014所示，一旦將DTMO入位，可由夾具釋放DTMO的末端。根據本發明的一些實施方案，提供了一種系統和方法以用于體內分界和定位植入的真皮微器官。例如當需要終止蛋白質治療或降低分泌的蛋白質的劑量時，對加工的組織如DTMO在皮下植入或身體內任何其它位置的植入的位置的鑒別可以是很重要的。例如，終止或滴定劑量可通過完全除去一或多個DTMO和/或通過切除一個植入的DTM0、一個植入的DTMO的一部分或一個以上植入的DTMO而進行。為了鑒別皮下植入的DTM0，根據一個實施方案，可在植入前用一種含有生色團的惰性生物相容性油墨或染料染色DTM0，其肉眼可見或可需要特殊的顯示條件來觀察。以這種方式，DTMO可通過目視檢查和/或用增強的成象手段而與其周圍組織區分開。根據一個實施方案，DTMO的外周表面可用例如生物相容性碳顆粒、生物相容性文身墨或其它合適的材料包被。皮下植入后，DTMO肉眼可見或者用一合適的增強成象裝置可見。增強植入的DTMO的可見性的其它方式可包括在皮膚表面上使用強光源，或者夾起皮膚并使光源從一側照向皮膚，從而皮膚可呈半透明狀，而染色的DTMO更可見。或者，染料可以是熒光的，僅當用UV光照射時可見，例如使用熒光塑料珠。根據另一實施方案，皮下植入的DTMO的位置可通過將一種生物相容性結構與DTMO共植入而鑒別。這種生物相容性結構的一個例子是許多外科手術中常用的非吸收性單股尼龍縫合線。這種縫合線可被植入與DTMO相同的植入道內，或可被植入上部真皮中位于DTMO的正上方，從而DTMO的空間位置可通過縫合線的位置而確定。另外，DTMO的深度可以是已知在皮下間隙的深度。縫合線肉眼可見，可用照明裝置觀察和/或可用其它合適的成象裝置如超聲波而觀察。或者，縫合線可以是熒光的，并在合適的UV照射下透過皮膚可見。縫合線也可以是可吸收材料，從而其可以使得在期望的時間內如幾個月內進行定位。根據另一實施方案，DTMO可以被遺傳修飾或工程化以包括一表達突光標記或其它能被觀察的標記的基因。例如，DTMO可用GFP (綠色熒光蛋白)基因或螢光素酶報道基因修飾,這種基因可以例如與治療性蛋白質的基因一起表達。以這種方式，DTMO可用合適的UV或其它合適的照明和成象條件非侵入性觀察。 根據本發明的一些實施方案，提供了一種除去或切除植入的DTMO的系統和方法。在一種情況下，例如當患者的基于DTMO的療法必須被終止時，或者如果蛋白質分泌必須被降低時，每一植入的DTMO可以被部分或全部除去，或被分別或全部切除。除去DTMO的一個實施方案是用類似于或直徑稍大于直接采集DMO所用的鉆取管的鉆取管進行。如圖21所示，在框2102，可以確定植入的皮下DTMO的位置。在框2103，可任選地在DTMO除去的部位給予局部麻醉。在框2104，可沿DTMO的長度皮下插入一內導桿，以采集包括DTMO的一束組織。在框2106，可將一與植入針相同或直徑大于植入針直徑的鉆取針(例如11 口徑或類似的)插在內導桿上并于內導桿共中心。在框2108，可采集包括DTMO的該束組織。在框2110，具有該束組織的內導桿和鉆取針可從皮膚中抽出，帶出DTM0。在一個實施方案中，這種鉆取方法可組合真空抽吸以幫助從身體中取出切割材料。根據本發明的一個實施方案，可以使用原位切除DTMO的侵害性最小或非侵入性方法以使程序損傷性更小并且對于患者的侵害更小。在一個實施方案中，在染色的DTMO情況下，可以使用激光例如非侵入型Yag激光。Yag激光的能量例如可被生色團選擇性吸收，從而能量被主要導向DTM0，而對周圍組織的損害非常小。也可使用其它光源。根據另一實施方案，DTMO可通過從沿DTMO長度插入到皮下間隙中的最小侵害性探頭傳遞破壞性能量而切除。這種探頭可傳遞各種類型的能量，包括射頻、低溫、微波、電阻熱等。可使用共植入的結構如縫合線來確定DTMO的位置，從而使探頭能例如沿縫合線或位于縫合線正下方而被插入皮下。在這種情況下，例如，破壞性能量可在縫合線仍在原來位置時被傳遞。或者，縫合線可在放置探頭后及傳遞破壞性能量之前除去。施加的能量可以是如經透熱療法凝固過程中變性組織中的蛋白質所需的能量。額外地或者另外，施加的能量可以是燒焦組織的電動手術切割裝置中所用的那么高的能量。當然，也可以使用其它定位手段和其它傳遞破壞性能量的手段。在采集DMO之后，例如，根據本發明的實施方案，DMO任選地被遺傳改變。可使用現有技術中已知的任何方法學來遺傳改變組織。一個代表性方法是用一重組病毒載體將一基因插入組織細胞中。可以使用現有技術中已知的各種不同載體中的任一種，如病毒載體、質粒載體、線性DNA等，以將編碼治療劑的外源核酸片段導入靶細胞和/或組織。這些基因可使用如下任何方法插入，例如感染、轉導、轉染、磷酸鈣介導的轉染、DEAE-葡聚糖介導的轉染、電穿孔、脂質體介導的轉染、基因槍法(biolistic)基因輸送、使用融合陰離子脂質體(其是使用陽離子脂質體的替代方法)的脂質體基因輸送、直接注射、受體介導的攝入、磁穿孔、超聲和本領域已知的其它方法。這種基因插入可通過將載體導入DMO附近從而載體可與DMO細胞反應來實現。一旦外源核酸片段已摻入細胞，可定量由所述核酸片段編碼的治療劑的生產率和/或分泌率。根據本發明的一些實施方案，DMO的遺傳吸收可修飾內源基因表達譜。這可通過例如導入一增強子或控制內源基因表達的阻抑或誘導型調控構件而實現。在另一實施方案中，本發明提供了通過將本發明的遺傳修飾的DMO植入一對象而將感興趣的基因產物輸送給對象的方法。如上所述，在此過程中DMO可與一種營養溶液接觸。因此，由DTMO產生的治療劑可以分泌進該溶液中，由此測量其濃度。感興趣的基因可以是編碼任何RNA分子(有義或反 義)、肽、多肽、糖蛋白、脂蛋白或其組合或編碼任何其它后修飾的多肽的任何基因。在本發明的一個實施方案中，感興趣的基因可以是組織樣品中天然表達的基因。在本發明的另一個實施方案中，組織樣品可以被遺傳工程化以便至少一個細胞會表達感興趣的基因，該感興趣的基因是該細胞天然不表達的或者在該細胞中具有改變的表達譜。本文所用術語“核酸”是指多核苷酸或寡核苷酸如脫氧核糖核酸(DNA)，并且當合適時，是指核糖核酸(RNA)或其模擬物。該術語應該也被理解為包括作為等價物的從核苷酸類似物制備的RNA或DNA類似物，以及如所描述的實施方案適用時，也包括單鏈(有義或反義)和雙鏈多核苷酸。該術語包括由天然存在的堿基、糖和共價核苷間(骨架)連鍵組成的寡核苷酸以及具有非天然部分的功能類似的寡核苷酸。這種修飾的或取代的寡核苷酸因為其期望的性質如增強的細胞攝入、對核酸靶的增強的親和力和增強的在核酸酶存在下的穩定性而通常比天然形式優選。如本領域技術人員已知的，術語“蛋白質”、“肽”或“多肽”是指通過肽鍵以特異的序列連接在一起的氨基酸線性聚合物。本文所用術語“氨基酸”是指氨基酸的D或L立體異構體形式，除非特別指明。本發明范圍還包括例如具有純化的野生型腫瘤抑制蛋白的生物學活性的等價蛋白質或等價肽。“等價蛋白質”或“等價多肽”是指與天然存在的蛋白質或多肽的線性序列不符但是具有不改變其生物學活性的氨基酸取代的化合物。這些等價物可以通過用相關氨基酸例如具有相似電荷的氨基酸置換一或多個氨基酸或者取代或修飾側鏈或官能團而與天然序列不同。所述蛋白質、肽、多肽、糖蛋白或脂蛋白可以是但不限于下述任一種蛋白質或其各種組合蛋白酶、脂肪酶、核糖核酸酶、脫氧核糖核酸酶、凝血因子、細胞色素P450酶、轉錄因子、MHC成分、細胞因子、白細胞介素、BMP、趨化因子、生長因子、激素、酶、單克隆抗體、單鏈抗體、氧化還原酶、p450、過氧化物酶、氫化酶、脫氫酶、過氧化氫酶、轉移酶、水解酶、異構酶、連接酶、氨基酰基-trna合成酶、激酶、磷蛋白、突變基因轉座子、氧化還原酶、膽堿酯酶、葡糖淀粉酶、糖基水解酶、氨甲酰基轉移酶、核酸酶、(兆堿基)大范圍核酸酶(meganuclease)、核糖核酸酶、ATP酶、肽酶、環式核苷酸合成酶、磷酸二酯酶、磷蛋白、DNA或RNA相關蛋白、高遷移性基團蛋白、成對盒蛋白(paired box protein)、組蛋白、聚合酶、DNA修復蛋白、核糖體蛋白、電子傳遞蛋白、球蛋白、金屬硫蛋白、膜轉運蛋白、結構蛋白、受體、細胞表面受體、核受體、G蛋白、嗅覺受體、離子通道受體、通道、酪氨酸激酶受體、細胞粘著分子或受體、光受體、活性肽、蛋白酶抑制劑、分子伴侶、分子伴侶素(chaperonin)、應激相關蛋白、轉錄因子和嵌合蛋白。在一個實施方案中，由本發明的DMO分泌的蛋白質的量在植入前一天至少為1.6yg/DTM0/天。在本發明的一個實施方案中，感興趣的基因可編碼促紅細胞生成素或其等價蛋白。在本發明的另一實施方案中，感興趣的基因可編碼但不限于下述任一種蛋白質、下述蛋白質的任何組合和其任何等價物胰島素、胰蛋白酶原、糜蛋白酶原、彈性蛋白酶、淀粉酶、血清胸腺因子、胸腺體液因子、胸腺生成素、胃泌素、胰泌素、 促生長素抑制素、物質P、生長激素、生長調節素、集落刺激因子、促紅細胞生成素、表皮生長因子、肝促紅因子(h印atopoietin)、肝細胞生長因子、白細胞介素、負生長因子、成纖維細胞生長因子和β 3家族轉化生長因子、干擾素α、干擾素β、干擾素Y、人生長激素、G-CSF、GM-CSF、TNF受體、PDGF,AAT, VEGF、超氧化物歧化酶、白細胞介素、TGF- β、NGF、CTNF, PEDF, NMDA、AAT、肌動蛋白、苯丙酸諾龍(Activin) β-A、苯丙酸諾龍β-B、苯丙酸諾龍β-C、苯丙酸諾龍β-E、腺苷酸脫氨酶、腺苷酸脫氨酶、瓊脂水解酶_β、白蛋白HAS白蛋白、醇脫氫酶、醛縮酶、埃芬瑞(Alfimeprase)、α I抗胰蛋白酶、α半乳糖苷酶、α -I-酸性糖蛋白(AGP)、α -I-抗凝乳蛋白酶、α-I-抗胰蛋白酶AT、α-I-微球蛋白AIM、α-2-巨球蛋白Α2Μ、甲胎蛋白、α -半乳糖苷酶、D-氨基酸氧化酶、L-氨基酸氧化酶、α淀粉酶、β淀粉酶、Angiostatin、血管緊張肽、轉化酶、錨蛋白、載脂蛋白、AP0-SAA、精氨酸酶、天冬酰胺酶、天冬氨酸氨基轉移酶、心房利鈉因子(Anf)、心鈉肽、心鈉肽(Anp)、抗生物素蛋白、β_2_糖蛋白I、β_2_微球蛋白、β -N-乙酰氨基葡糖苷酶B-NAG、β -淀粉樣、腦鈉肽(Βηρ)、腦衍生神經營養因子(BDNF)、鈣粘蛋白(Cadherin)E、Calc a、Calc b、降I丐素、I丐細胞周邊蛋白(Calcyclin)、|丐結合蛋白(Caldesmon)、Calgizzarin、I丐粒蛋白(Calgranulin) A、I丐粒蛋白C、隹丐調蛋白、I丐網蛋白(Calreticulin)、 丐血管蛋白(Calvasculin)、碳酸酐酶、羧肽酶、羧肽酶A、羧肽酶B、羧肽酶Y、心臟肌鈣蛋白I、心臟肌鈣蛋白T、酪蛋白α、過氧化氫酶、連環素(Catenins)、組織蛋白酶D、⑶95L、CEA、纖維素酶、著絲粒蛋白B、血漿銅藍蛋白、血清銅藍蛋白(Ceruplasmin)、膽囊收縮素、膽固醇酯酶、乙酰膽堿酯酶、丁酰膽堿酯酶、絨膜促性腺激素(HCG)、絨膜促性腺激素核心(BchCG)、糜蛋白酶、糜蛋白酶原、肌氨酸激酶、K-BB、CK-MB (肌氨酸激酶-MB)、CK-MM、Clara細胞磷脂結合蛋白、梭菌蛋白酶、凝聚素(Clusterin)、CNTF、膠原蛋白、膠原蛋白酶、膠原(I-VI型)、集落刺激因子、補體Clq、補體C3、補體C3a、補體C3b_ α、補體C3b-i3、補體C4、補體C5、補體因子B、伴刀豆蛋白Α、促皮質激素釋放素、促腎上腺皮質激素釋放激素、C 一反應蛋白(CRP)、C-型利鈉肽(Cnp)、胱抑素(Cystatin)C、D- 二聚體、Delta I、Delta樣激酶I (Dlkl)、脫氧核糖核酸酶、脫氧核糖核酸酶I、脫氧核糖核酸酶II、脫氧核糖核酸、Dersalazine、葡聚糖酶、黃遞酶(Diaphorase)、T4DNA連接酶、DNA聚合酶I、T4DNA聚合酶、EGF，彈性蛋白酶、彈性蛋白、內分泌腺衍生血管內皮生長因子(EG-VEGF)、彈性蛋白內皮縮血管肽、彈性蛋白內皮縮血管肽I、彈性蛋白嗜酸性粒細胞趨化蛋白(Eotaxin)彈性蛋白、表皮生長因子(EGF)、上皮嗜中性粒細胞激活肽-78 (ENA-78)、促紅細胞生成素(Epo)、雌三醇、Exodus、因子IX、因子VIII、脂肪酸結合蛋白、鐵蛋白、成纖維細胞生長因子、成纖維細胞生長因子10、成纖維細胞生長因子11、成纖維細胞生長因子12、成纖維細胞生長因子13、成纖維細胞生長因子14、成纖維細胞生長因子15、成纖維細胞生長因子16、成纖維細胞生長因子17、成纖維細胞生長因子18、成纖維細胞生長因子19、成纖維細胞生長因子2、成纖維細胞生長因子20、成纖維細胞生長因子3、成纖維細胞生長因子4、成纖維細胞生長因子5、成纖維細胞生長因子6、成纖維細胞生長因子7、成纖維細胞生長因子8、成纖維細胞生長因子9、纖連蛋白、粘著斑激酶(FAK)、促濾泡素α、半乳糖氧化酶、β半乳糖苷酶、￥1 -10、胃泌素、60 、643 、膠質細胞衍生神經營養因子(6冊？)、膠質細胞原纖維酸性蛋白、膠質絲蛋白(GFP)、膠質細胞衍生神經營養因子家族受體(GFR)、球蛋白、葡萄糖氧化酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、α葡糖苷酶、β葡糖苷酶、β葡糖醛酸糖苷酶、谷氨酸脫羧酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、甘油脫氫酶、甘油激酶、糖原磷酸化酶ISO ΒΒ、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、生長刺激蛋白(GR0)、生長激素、生長激素釋放激素、血紅素結合蛋白、月干促紅因子(hepatopoietin)、Heregulin α、Heregulin β I、Heregulinβ 2、Heregulin β 3、己糖激酶、組蛋白、人骨形態發生蛋白、人松馳素Η2、透明質酸酶、輕基類固醇脫氫酶、低氧誘導因子一I a (HIF-1 Alpha)、I-309/TCA-3、IFNa、IFN3、IFN Y、 IgA、IgE、IgG、IgM、胰島素、胰島素樣生長因子I (IGF-I)、胰島素樣生長因子II (IGF-II)、干擾素、干擾素誘導型T細胞α化學引誘物(I-TAC)、白細胞介素、白細胞介素12β、白細胞介素 18 結合蛋白、腸三葉因子(Intestinal trefoil factor)、IP10、JaggedU Jagged2、K輕鏈、角質形成細胞生長因子(KGF)、Kissl、La/SS-B、乳酸脫氫酶、L-乳酸脫氫酶、乳鐵蛋白、乳過氧化物酶、λ輕鏈、昆布氨酸(Iaminin) α I、昆布氨酸α 2、昆布氨酸β 、昆布氨酸β 2、昆布氨酸β 3、昆布氨酸Y I、昆布氨酸Υ2、LD78beta、痩素(Leptin)、亮氨酸氨基肽酶、促黃體生成激素(LH)、LIF、脂肪酶、肝細胞生長因子、肝表達的趨化因子(LEC)、LKM抗原、TNF、TNF beta、螢光素酶、促黃體生成激素釋放激素、淋巴細胞激活基因-I蛋白(LAG-I)、淋巴細胞趨化因子(Lymphotactin)、溶菌酶、巨噬細胞炎性蛋白I a (MIP-IAlpha)、巨噬細胞衍生趨化因子(MDC)、蘋果酸脫氫酶、麥芽糖酶、MCP (巨噬細胞/單核細胞趨化蛋白)-I、2、3和4、M-CSF, MEC(CCL28)、膜型卷曲相關蛋白(Mfrp)、中期因子(Midkine)、MIF、MIG (干擾素 Y 誘導的單核因子)、MIP2 至 5、ΜΙΡ_1 β、Mp40、P40T 細胞和肥大細胞生長因子、髓磷脂堿性蛋白、髓過氧化物酶、肌紅蛋白、肌肉抑制素(Myostatin)生長分化因子-8 (⑶F-8)、Mysoin, MysoinLC, Mysoin HC、ATPase, NADase, NAP-2、負生長因子、神經生長因子(NGF)、神經氨酸酶、Neuregulin I、Neuregulin 2、Neuregulin3、神經元特異性烯醇化酶、神經元特異性烯醇化酶、神經營養蛋白(neurotrophin)-3 (NT-3)、神經營養蛋白_4 (NT-4)、Neuturin、NGF、NGF-β、Nicastrin、硝酸還原酶、氧化氮合成酶、去甲睪酮(Nortestosterone) >Notch KNotch 2、Notch 3、Notch 4、NP_1、NT_1 至 4、NT_3 Τρο、NT-4、核酸酶、制瘤素Μ、鳥氨酸氨甲酰轉移酶、護骨素(Osteoprotegerin)、卵清蛋白、草酸脫羧酶、P16、木瓜蛋白酶、PBP、PBSF、PDGF、PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB、PEDF、胃蛋白酶、肽YY (ΡΥΥ)、過氧化物酶、Persephin、PF-4、P-糖蛋白、酸性磷酸酶、堿性磷酸酶、磷酸二酯酶
I、磷酸二酯酶II、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、葡糖磷酸變位酶、磷脂酶、磷脂酶A2、磷脂酶A2、磷脂酶C、磷酸酪氨酸激酶、垂體腺苷酸環化酶激活多肽、胎盤催乳激素、Y-鈣緊張素(Plakoglobin)、斑菲素蛋白(Plakophilin)、血衆胺氧化酶、血衆視黃醇結合蛋白、血纖維蛋白溶酶原、Pleiotrophin (PTN)、PLGF-1、PLGF-2、Pokeweed抗病毒毒素、前清蛋白、妊娠相關血衆蛋白A、妊娠特異性β I糖蛋白(SP1)、強啡肽原(prodynorphin)、腦啡肽原(proenk印halin)、孕酮胰島素原、促乳素、促黑色素濃縮激素(Pmch)、前阿黑皮素(pro-opiomelanocortin)、前孤啡肽(pro_orphanin)、前列腺特異性抗原PSA、前列腺酸性磷酸酶PAP、凝血酶原、PSA-A1、肺表面蛋白A、丙酮酸激酶、Ranpirnase、RANTES、ReelinJ^素、抵抗素、視黃醇結合球蛋白 RBP、R0-SS-A 60kDa.R0/SS-A 52kDa、S100 (人腦)(BB/AB)、SlOO (人)BB 同二聚體、Saposin、SCF、SCGF-α、SCGF-β , SDF-I α , SDF-I β、分泌型卷曲相關蛋白I (Sfrpl)、分泌型卷曲相關蛋白2(Sfrp2)、分泌型卷曲相關蛋白3(Sfrp3)、分泌型卷曲相關蛋白4(Sfrp4)、分泌型卷曲相關蛋白5(Sfrp5)、胰泌素、血清胸腺因子、結合球蛋白(SHBG)、生長調節素、生長抑素(somatostatin)、生長激素(Somatotropin)、s-RankL、物質P、超氧化物歧化酶、TGF α、TGF β、硫氧還蛋白、血栓形成素(thrombopoietin, TP0)、凝血栓蛋白I、凝血栓蛋白2、凝血栓蛋白3、凝血栓蛋白4、凝血栓蛋白5、凝血栓蛋白6、凝血栓蛋白7、胸腺體液因子、胸腺生成素、胸腺素al、胸腺素α-I、胸腺和激活調節的趨化因子(TARC)、胸腺表達的趨化因子(TECK)、甲狀腺球蛋白Tg、甲狀腺微粒體抗原、甲狀腺過氧化物酶、甲狀腺過氧化物酶TP0、甲狀腺素(T4)、甲狀腺素結合球蛋白TBG、TNF a、TNF受體、轉鐵蛋白、轉鐵蛋白受體、b家族轉化生長因子、Transthyretin、三酰甘油脂肪酶、三碘甲狀腺 原氨酸(T3)、原肌球蛋白α、原肌球蛋白相關激酶(trk)、肌鈣蛋白C、肌鈣蛋白I、肌鈣蛋白T、胰蛋白酶、胰蛋白酶抑制劑、胰蛋白酶原、TSH、Tweak、酪氨酸脫羧酶、遍在蛋白、UDP葡糖醒酸基轉移酶、脲酶、尿酸酶、尿蛋白I、Urocortin I、Urocortin 2、Urocortin 3、尿壓素
II、Vang-樣I (Vangll)、Vang-樣2(Vangl2)、血管內皮生長因子(VEGF)，舒血管腸肽前體、波形蛋白、維生素 D 結合蛋白、Von Willebrand 因子、Wntl、WntlOa、WntlOb、Wntll、Wntl2、Wntl3> Wntl4> Wntl5> Wntl6> Wnt2> Wnt3> Wnt3a> Wnt4> Wnt5a> Wnt5b> Wnt6> Wnt7a> Wnt7b>Wnt8a> Wnt8b、Wnt9、黃嘌呤氧化酶、Clara細胞磷脂結合蛋白、梭菌蛋白酶、凝聚素(Clusterin)、CNTF、膠原蛋白、膠原蛋白酶、膠原(I-VI型)、集落刺激因子、補體Clq、補體C3、補體C3a、補體C3b-a、補體C3b_0、補體C4、補體C5、補體因子B、伴刀豆蛋白A、促皮質激素釋放素、促腎上腺皮質激素釋放激素、C 一反應蛋白(CRP)、C-型利鈉肽(Cnp)、胱抑素C、D-二聚體、Delta l、Delta樣激酶I (Dlkl)、脫氧核糖核酸酶、脫氧核糖核酸酶I、脫氧核糖核酸酶II、脫氧核糖核酸、Dersalazine、葡聚糖酶、黃遞酶(Diaphorase)、T4DNA連接酶、DNA聚合酶I、T4DNA聚合酶、EGF，彈性蛋白酶、彈性蛋白、內分泌腺衍生血管內皮生長因子(EG-VEGF)、彈性蛋白內皮縮血管肽、彈性蛋白內皮縮血管肽I、彈性蛋白嗜酸性粒細胞趨化蛋白彈性蛋白、表皮生長因子(EGF)、上皮嗜中性粒細胞激活肽-78 (ENA-78)、促紅細胞生成素(Epo)、雌三醇、Exodus、因子IX、因子VIII、脂肪酸結合蛋白、鐵蛋白、成纖維細胞生長因子、成纖維細胞生長因子10、成纖維細胞生長因子11、成纖維細胞生長因子12、成纖維細胞生長因子13、成纖維細胞生長因子14、成纖維細胞生長因子15、成纖維細胞生長因子16、成纖維細胞生長因子17、成纖維細胞生長因子18、成纖維細胞生長因子19、成纖維細胞生長因子2、成纖維細胞生長因子20、成纖維細胞生長因子3、成纖維細胞生長因子4、成纖維細胞生長因子5、成纖維細胞生長因子6、成纖維細胞生長因子7、成纖維細胞生長因子8、成纖維細胞生長因子9、纖連蛋白、粘著斑激酶(FAK)、促濾泡素α、半乳糖氧化酶、β半乳糖苷酶、^1 -10、胃泌素、60 、643 、膠質細胞衍生神經營養因子(6冊？)、膠質細胞原纖維酸性蛋白、膠質絲蛋白(GFP)、膠質細胞衍生神經營養因子家族受體(GFR)、球蛋白、葡萄糖氧化酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、α葡糖苷酶、β葡糖苷酶、β葡糖醛酸糖苷酶、谷氨酸脫羧酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、甘油脫氫酶、甘油激酶、糖原磷酸化酶ISO ΒΒ、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、生長刺激蛋白(GR0)、生長激素、生長激素釋放激素、血紅素結合蛋白、月干促紅因子(hepatopoietin)、Heregulin α、Heregulin β I、Heregulin β 2、Heregulin β 3、己糖激酶、組蛋白、人骨形態發生蛋白、人松馳素Η2、透明質酸酶、輕基類固醇脫氫酶、低氧誘導因子一I a (HIF-1 Alpha)、I-309/TCA-3、IFNa、IFN3、IFN Y、IgA、IgE、IgG、IgM、胰島素、胰島素樣生長因子I (IGF-I)、胰島素樣生長因子II (IGF-II)、干擾素、干擾素誘導型T細胞a化學引誘物(I-TAC)、白細胞介素、白細胞介素12β、白細胞介素 18 結合蛋白、腸三葉因子(Intestinal trefoil factor)、IP10、Jagged UJagged 2、κ輕鏈、角質形成細胞生長因子(KGF)、KissU La/SS-B、乳酸脫氫酶、L-乳酸脫氫酶、乳鐵蛋白、乳過氧化物酶、λ輕鏈、昆布氨酸(Iaminin) α I、昆布氨酸α 2、昆布氨酸β I、昆布氨酸β 2、昆布氨酸β 3、昆布氨酸Y I、昆布氨酸Υ2、LD78beta、痩素(Leptin)、亮氨酸氨基肽酶、促黃體生成激素(LH)、LIF、脂肪酶、肝細胞生長因子、肝表達的趨化因子(LEC)、LKM抗原、TNF^、螢光素酶、促黃體生成激素釋放激素、淋巴細胞激活基因-I蛋白(LAG-I)、淋巴 細胞趨化因子(Lymphotactin)、溶菌酶、巨噬細胞炎性蛋白la (MIP-IAlpha)、巨噬細胞衍生趨化因子(MDC)、蘋果酸脫氫酶、麥芽糖酶、MCP(巨噬細胞/單核細胞趨化蛋白)_1、2、3和4、M-CSF, MEC(CCL28)、膜型卷曲相關蛋白(Mfrp)、中期因子(Midkine)、MIF、MIG (干擾素Y誘導的單核因子)、11 2至5、10 -10、1^40、？401'細胞和肥大細胞生長因子、髓磷脂堿性蛋白、髓過氧化物酶、肌紅蛋白、肌肉抑制素(Myostatin)生長分化因子_8 (⑶F_8)、Mysoin, Mysoin LC、Mysoin HC、ATPase, NADase, NAP-2、負生長因子、神經生長因子(NGF)、神經氨酸酶、NeuregulinU Neuregulin 2、Neuregulin 3、神經元特異性烯醇化酶、神經元特異性烯醇化酶、神經營養蛋白(neurotrophin) -3 (NT-3)、神經營養蛋白_4 (NT-4)、Neuturin、NGF、NGF- β、Nicastrin、硝酸還原酶、氧化氮合成酶、去甲睪酮(Nortestosterone)>Notch KNotch 2、Notch 3、Notch 4、NP_1、NT_1 至 4、NT-3Tpo、NT_4、核酸酶、制瘤素Μ、鳥氨酸氨甲酰轉移酶、護骨素(Osteoprotegerin)、卵清蛋白、草酸脫羧酶、Ρ16、木瓜蛋白酶、PBP、PBSF, PDGF, PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB, PEDF、胃蛋白酶、肽 YY(ΡΥΥ)、過氧化物酶、Persephin、PF-4、P-糖蛋白、酸性磷酸酶、堿性磷酸酶、磷酸二酯酶I、磷酸二酯酶II、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、葡糖磷酸變位酶、磷脂酶、磷脂酶A2、磷脂酶A2、磷脂酶C、磷酸酪氨酸激酶、垂體腺苷酸環化酶激活多肽、胎盤催乳激素、Y-鈣緊張素(Plakoglobin)、斑菲素蛋白(Plakophilin)、血衆胺氧化酶、血衆視黃醇結合蛋白、血纖維蛋白溶酶原、Pleiotrophin (PTN)、PLGF-1、PLGF-2、Pokeweed抗病毒毒素、前清蛋白、妊娠相關血衆蛋白A、妊娠特異性β I糖蛋白(SP1)、強啡肽原(pro-dynorphin)、腦啡肽原(pro-enk印halin)、孕酮胰島素原、促乳素、促黑色素濃縮激素(Pmch)、前阿黑皮素(pro-opiomelanocortin)、前孤啡肽(pro_orphanin)、前列腺特異性抗原PSA、前列腺酸性磷酸酶PAP、凝血酶原、PSA-A1、肺表面蛋白A、丙酮酸激酶、Ranpirnase、RANTES、ReelinJ^素、抵抗素、視黃醇結合球蛋白 RBP、R0-SS-A 60kDa.R0/SS-A 52kDa、S100 (人腦)(BB/AB)、SlOO (人)BB 同二聚體、Saposin、SCF、SCGF-α、SCGF-β , SDF-I α ,SDF-I β、分泌型卷曲相關蛋白I (Sfrpl)、分泌型卷曲相關蛋白2(Sfrp2)、分泌型卷曲相關蛋白3(Sfrp3)、分泌型卷曲相關蛋白4(Sfrp4)、分泌型卷曲相關蛋白5(Sfrp5)、胰泌素、血清胸腺因子、結合球蛋白(SHBG)、生長調節素、somatostatin、Somatotropin、s-RankL、物質P、超氧化物歧化酶、TGF α、TGF β、硫氧還蛋白、血栓形成素(thrombopoietin, ΤΡΟ)、凝血栓蛋白I、凝血栓蛋白
2、凝血栓蛋白3、凝血栓蛋白4、凝血栓蛋白5、凝血栓蛋白6、凝血栓蛋白7、胸腺體液因子、胸腺生成素、胸腺素al、胸腺素α -I、胸腺和激活調節的趨化因子(TARC)、胸腺表達的趨化因子(TECK)、甲狀腺球蛋白Tg、甲狀腺微粒體抗原、甲狀腺過氧化物酶、甲狀腺過氧化物酶TP0、甲狀腺素(T4)、甲狀腺素結合球蛋白TBG、TNFa、TNF受體、轉鐵蛋白、轉鐵蛋白受體、b家族轉化生長因子、Transthyretin、三酰甘油脂肪酶、三碘甲狀腺原氨酸(T3)、原肌球蛋白α、原肌球蛋白相關激酶(trk)、肌鈣蛋白C、肌鈣蛋白I、肌鈣蛋白Τ、胰蛋白酶、胰蛋白酶抑制劑、胰蛋白酶原、TSH、Tweak、酪氨酸脫羧酶、遍在蛋白、UDP葡糖醛酸基轉移酶、脲酶、尿酸酶、尿蛋白 l、Urocortin KUrocortin 2、Urocortin 3、尿壓素 II、Vang-樣 I (Vangll)、Vang-樣2(Vangl2)、血管內皮生長因子(VEGF)，舒血管腸肽前體、波形蛋白、維生素D結合蛋白、Von Willebrand 因子、ffntl> WntlOa、WntlOb、ffntll> Wntl2> Wntl3> Wntl4> Wntl5>Wntl6> Wnt2> Wnt3> Wnt3a> Wnt4> Wnt5a> Wnt5b> Wnt6> Wnt7a> Wnt7b> Wnt8a> Wnt8b> Wnt9 和 黃嘌呤氧化酶。在遺傳修飾過程后，組織樣品可以隨后被分析以驗證組織樣品對感興趣基因的表達。這可以用現有技術中已知的任何方法進行,例如用ELISA檢測蛋白質或用Northern印跡檢測RNA。特定表達載體系統和導入核酸進細胞的方法可用現有技術中常規使用的標準方法進行評價。例如,導入到細胞中的DNA可用濾膜雜交技術(例如Southern印跡)檢測，由導入的DNA轉錄產生的RNA可例如通過Northern印跡、RNase保護或逆轉錄酶-聚合酶鏈反應(RT-PCR)進行檢測。基因產物可通過合適分析進行檢測，例如用一特異性抗體對所產生的蛋白質進行免疫學檢測，或者用一功能分析如酶分析檢測基因產物的功能活性。如果細胞表達的感興趣基因產物不能容易地被檢測，可以先用一與調控元件和待使用的載體相連的報道基因優化表達系統。報道基因編碼一種可容易地被檢測的基因產物，因此可以用于評價系統的功效。現有技術中使用的標準報道基因包括編碼β_半乳糖苷酶、氯霉素乙酰轉移酶、螢光素酶、GFP/EGFP和人生長激素的基因。本發明在一個方面包括遺傳修飾的DTMO在移植進一個生物體中的應用。本文所用術語“給予、給藥”、“導入”、“植入”和“移植”可互換使用并且是指將本發明的DTMO置于一對象中，例如一自體、同種異體(al Iogene i c )或異種的對象,使用的方法和途徑是使得DTMO定位在期望的部位。DTMO在對象中的期望位置的植入是使得DTMO的至少一部分細胞保持存活。在本發明的一個實施方案中至少約5%、在本發明的另一實施方案中至少約10%、在本發明的另一實施方案中至少約20%、在本發明的另一實施方案中至少約30%、在本發明的另一實施方案中至少約40%、在本發明的另一實施方案中至少約50%或更多的細胞在給予對象后保持存活。在給予對象后細胞存活時間可以短至幾小時，例如24小時，至幾天，至長達幾周、幾個月或幾年。為了促進可受到宿主免疫學攻擊的細胞群在組織內的移植，例如在使用異種移植物時如豬-人移植時，DTMO可被插入或包裹在生物相容性免疫保護材料如可再裝載的非生物降解性或生物降解性裝置中，然后被移植進受體對象中。由這種細胞/組織產生的基因產物隨后可經例如設計用于受控輸送化合物例如藥物(包括蛋白質生物藥物)的聚合裝置而輸送。各種生物相容性組合物(例如包括水凝膠)、包括生物降解性和非生物降解性聚合物可以被用于形成植入體以實現本發明的細胞群的基因產物在特定靶部位的持續釋放。現有技術中通常已知這種植入體的產生方法，參見例如 Concise Encyclopedia of Medical&Dental Materials, ed. By David Williams(MITPress: Cambridge, MA, 1990) ; Sabel 等人，美國專利 4, 883, 666 ；Aebischer 等人，美國專利4，892，538; Aebischer 等人，美國專利 5，106，627;Lim，美國專利 4，391，909;和 Sefton,美國專利4，353，888。本發明DTMO內的細胞群可以在一藥物學可接受的載體或稀釋劑如無菌鹽水和水性緩沖溶液中被給藥。這類載體和稀釋劑的使用是現有技術中熟知的。分泌蛋白例如但不限于可以是根據手術本發明實施方案的任何蛋白質。在本發明的一個實施方案中，感興趣的蛋白質可以是促紅細胞生成素。在本發明的另一實施方案中，本發明方法可以用于表達和分泌現有技術中已知的每一和任一蛋白質或它們的組合。另外，本發明方法可用于表達RNA分子(有義或反義)。或者，包括遺傳修飾細胞的DMO可在體外保持，而留在組織樣品周圍的上清培養基中的治療劑可以被分離并注射或施加于同一或不同對象。 另外地或額外地，包括遺傳修飾細胞的真皮微器官可以通過本領域已知方法進行低溫保存，例如但不限于在從組織樣品形成后或在遺傳改變后立即在含有10%DMS0的DMEM中逐漸冷凍(0°C、一 20°C、一 80°C、一 196°C)ο根據本發明的一些實施方案的一個方面，待植入的包括遺傳修飾細胞的組織樣品的量由以下一或多項確定基于規章指導、具體臨床方案或類似對象的群體統計而常規給予這類對象的感興趣治療劑的相應量；當該對象先前已通過注射或其它給藥途徑接受相同治療劑時，特異給予該同一對象的治療劑如感興趣蛋白質的相應量；對象數據如體重、年齡、身體條件、臨床狀態；來自對先前給予其它類似對象的包括遺傳修飾細胞的組織樣品的藥動學數據；對先前給予該對象的包括遺傳修飾細胞的組織樣品的應答。根據本發明的一些實施方案的一個方面，僅有一些DTMO被用于給定的治療過程。其余的DTMO可返回保持(或低溫保存或以其它方式保存)，以備以后使用。因此，根據本發明的一個實施方案，提供了一種確定待植入患者中的治療性微器官的量的方法，該方法包括體外確定由一定數量的真皮微器官分泌的治療劑的水平；估算治療劑的體外產生和分泌水平與其在體內血清水平之間的關系；基于所確定的分泌水平以及所估算的關系，確定待植入的DTMO的量。任選地，所述關系基于選自如下一組的一或多種因素進行估算a)對象數據如體重、年齡、身體條件、臨床狀態；b)來自對其它類似對象先前進行的DTMO給藥的藥動學數據；和c)來自對該對象先前進行的DTMO給藥的藥動學數據。任選地，所述關系基于至少兩種所述因素進行估算。任選地，所述關系基于三種所述因素。在本發明的一個實施方案中，確定待植入進患者中的DTMO的量也基于如下一或兩項基于規章指導、具體臨床方案或類似對象的群體統計而常規給予這類對象的相同治療性蛋白質的相應量；以及當該對象先前已通過注射或其它給藥途徑接受相同治療劑時，特異于該同一對象的相同治療劑的相應量。在本發明的一個實施方案中，所述方法包括根據確定的量制備用于一定量的用于植入的DTMO。在本發明的一個實施方案中，還提供了調整由植入一個對象中的DTMO產生的治療劑的劑量并且排出治療劑的方法，包括(a)監控該對象中治療劑的水平；(b)將治療劑的水平與一期望水平進行比較；(C)如果所述水平低于最低水平，則植入額外的DTMO ; (d)如果所述水平高于最高水平，則失活或除去所植入的DTMO的一部分。任選地，所述方法包括定期重復(a) —(d)。另外地或額外地，失活或除去由除去植入的DTMO的一部分組成。任選地，除去包括手術除去。另外地或額外地，失活或除去包括失活。任選地，失活包括殺死植入的DTMO的一部分。任選地，失活包括切除植入的DTMO的一部分。如上參照圖I的描述，在遺傳改變過程中保持DMO的方法的至少一部分以及遺傳改變本身可以在一生物反應器中進行，如下所述。
根據本發明的一些實施方案，生物反應器可具有下述一些或全部特性能夠提供養分和氣體給DMO的表面以便它們可以擴散進DMO中并且DMO可保持存活。因此，DMO的大部分面積和體積不會被阻斷與周圍液體接觸。能夠將DMO保持在期望的溫度。能夠在DMO附近保持期望的pH和氣體組成。能夠將廢物從DMO和/或生物反應器除去。能夠提供插入遺傳修飾性載體的簡單方法，而沒有插入載體會污染周圍環境的危險。能夠除去過量的未使用的載體。能夠測量所產生的治療劑的量。能夠取出基本上無菌的治療劑。能夠容易地插入DMO且取出全部或測量量的DTM0。現參照圖22，其示意性描述了根據本發明的一些示例性實施方案的處理采集的DMO的系統2207。根據本發明的一些不例性實施方案，系統2207可包括一生物反應器2200，該生物反應器2200具有一或多個加工腔室2202，每個腔室適于接受一個DMO 2204。在一個示例性實施方案中，生物反應器2200具有相同于從一特定對象采集的DMO數目的腔室數，其可以被調適以從一液體貯液池2208提供合適的液體例如生長培養基給一或多個加工腔室2202和/或將一或多個加工腔室2202中的液體排放進例如廢物容器2210，如下所述。可經過例如通過無菌連接器2258與貯液池2208相連的入口管線2242給貯液池2208供應液體，如下所述。DMO 2204可用一用于采集DMO 2204的切割工具轉移進腔室2202，例如如上所述。DMO轉移進腔室2202可優選地在采集DM02204后并保持無菌條件的同時直接進行。加工腔室2202可包括一適于接受DMO 2204的DMO插入端口 2201。例如，端口 2201可包括一能接受鈍套管例如由B. Braun Medical Inc.出售的SafeLine Injection Site的無菌隔片界面。當切割工具的尖頭穿過隔片插入時，可以以基本上無菌的方式、例如使用與切割工具后端連接的注射器將DMO 2204輕輕沖進腔室2202中。根據一個示例性實施方案，DM02204可被沖進腔室2202內的培養基浴2206中。或者，如果例如DM02204是例如如上所述用內導桿采集的，則可以除去蓋在腔室2202上的蓋2232 (例如如下所述)，可將DMO 2204輕輕從內導桿上取下并置于腔室2202內，然后將蓋2232蓋回并密封腔室2202以保持腔室2202的無菌性。生物反應器2200可被調試使之例如以基本上相同的方式對裝在至少一些加工腔室中的DMO施加一或多個過程。根據本發明的示例性實施方案，生物反應器2200可被調適以使之能將一或多個加工腔室中的內容物與一或多個其它加工腔室中的內容物流體分離，如下所述。根據本發明的示例性實施方案，生物反應器2200還可包括一控制液體流進和/或流出加工腔室2202的機構，如下所述。根據一個示例性實施方案，生物反應器2200可包括與非無菌注射泵2214流體連通的無菌緩沖器2222，其可適于例如經一無菌過濾器2220(例如O. 45微米孔徑的空氣過濾 器)以無菌方式將空氣注入緩沖器2222和/或從緩沖器2222排放空氣。生物反應器2200還可包括一控制閥2212，其能夠在至少4個位置之間移動，例如入口-緩沖器位置，其中輸入貯液池2208與緩沖器2222流體連通；出口-緩沖器位置，其中廢物容器2210與緩沖器2222流體連通；腔室-緩沖器位置，其中腔室2202與緩沖器2222流體連通；和/或無連接位置，其中緩沖器2222、腔室2202、輸入貯液池2208和廢物容器2210互相流體不連通。活塞2226可連接在閥2212和馬達2224之間以適于將閥2212在不同位置之間移動。任選地，可在活塞2226上安裝一囊形膜板2228以便在活塞2226移動過程中基本上沒有非無菌空氣轉移進無菌緩沖器2222中。系統2201還可包括一馬達2206以驅動注射泵2214的柱塞2218。如果生物反應器包括多于一個的腔室，則可安裝一個馬達以同時驅動與腔室相關的每一個柱塞，或者可安裝多個馬達，每個均可驅動一或多個柱塞。根據本發明的示例性實施方案，系統2201可包括一控制器2286，其能夠控制馬達2216和/或馬達2224的運轉，例如如下所述。根據本發明的示例性實施方案，來自貯液池2208的液體可以以可控方式轉移進腔室2202，以例如充滿腔室2202。例如，控制器2286可驅動馬達2224以使閥2212處于入口-緩沖器(inlet-buffer)位置，并且以可控方式驅動馬達2216從而使注射泵2214從緩沖器2222排出預定量的空氣。其結果是相當于所述預定量體積空氣的預定量體積的液體被從輸入貯液池2208 “吸引”進緩沖器2222。控制器2286隨后可以可控方式驅動馬達2224以將閥移動到腔室-緩沖器位置，并可控地驅動馬達2216以便注射泵2214將緩沖器2222中的液體排放進腔室2202中。以類似的方式，注射泵和控制閥可被控制以將腔室2202中的內容物或其部分量排放進廢物容器2210。根據本發明的一些示例性實施方案，腔室2202內的液體可以被可控地攪拌和/或混合，例如以輔助病毒轉導和/或施加于DMO 2204的任何其它體外維持程序。例如，控制器2286可以可控方式驅動馬達2216和/或馬達2224，例如如上所述，以定期將液體或其部分從腔室2202排放進緩沖器，之后將緩沖器中的液體注回腔室2202。根據本發明的一些示例性實施方案，可使用空氣凈化位于例如流體連通輸入貯液池2208、廢物容器2210和/或腔室2202之間的一或多個“通道管線”中的液體，以便例如在將液體轉移進/轉移出腔室2202、輸入貯液池2208和/或緩沖器2222后“沖洗”通道管線。這一方面是有用的，例如用于降低可能被“捕獲”在一或多個通道管線中的液體的“死體積”。例如，控制器2286可以可控方式驅動馬達2216以移動注射器活塞2218從而在將液體從貯液池2208導向緩沖器2222之前將預定體積的空氣吸入緩沖器2222。緩沖器2222可具有一幾何形狀，從而在緩沖器2222內空氣將上升到液體之上，由此在驅動注射泵2214時緩沖器2222中的液體首先被排放，然后是空氣，空氣會沖洗除去保留在通道管線中的一些或全部液體。根據本發明一些示例性實施方案，腔室2202的底面2230可包括多個孔或網孔狀圖案，例如構造用于使液體以基本上均勻的方式轉移進腔室2202和/或從腔室2202轉移出，和/或使得從腔室2202排出基本上大部分液體。這一構造也可使得降低“靜點”發生率，靜點即腔室中液體保持不流動和/或不恢復流動的區域。根據一些示例性實施方案，蓋2232可以是可拆式無菌蓋，如通過可剝離的粘合劑固定的膜、硅塞材料、或類似物。蓋2232可適于在腔室2202和環境之間保持一無菌“屏障”。 任選地，可安裝一無菌空氣過濾器2234例如O. 45微米孔徑的空氣過濾器以使腔室2202和環境流體連通，由此在保持腔室2202和環境之間的無菌屏障的同時能平衡壓力。或者蓋2232可包括一“可呼吸”材料，以便可通過蓋2232實現壓力平衡。貯液池2208和/或廢物容器2210可例如經一或多個歧管(未示出)共同連接至針對具體對象的一或多個加工腔2202。或者，輸入貯液池2208和/或廢物容器2210可單獨連接至每一個加工腔。輸入貯液池2208和/或廢物容器2210可包括一以無菌方式平衡壓力的機構。例如，輸入貯液池2208和/或廢物容器2210可分別經一無菌空氣過濾器2236和/或無菌空氣過濾器2238與環境流體連通。過濾器2236和/或過濾器2238可包括例如O. 45微米孔徑空氣過濾器。或者廢物容器2210可包括一可擴展的廢物容器，從而無需壓力平衡并因此不需要使用無菌空氣過濾器。根據本發明的一個示例性實施方案，生物反應器2200可適于將液體直接注射進腔室2202或將液體從腔室2202排出。可使用一取樣隔片端口(s印turn port)2240例如直接注射病毒載體液體或取樣生長培養基以用于各種生物反應器參數的測試，如ELISA、葡萄糖攝入、乳酸產生或任何其它指示性參數。隔片端口 2240可包括一適于針插入的標準硅端口或一套管端口，例如上述參照DMO插入口 2201所述的那樣。一種注射器(未示出)可脫離地通過隔片端口 2240插入。該注射器可由一例如類似于馬達2216的馬達驅動，其可以手動驅動或用控制器2286自動驅動。根據本發明的示例性實施方案，生物反應器2200的至少一些、在某些示例性實施方案中全部組件可被保持在預定條件例如保溫條件下，包括約37°C的溫度、約90-95%空氣和約5-10%C02的氣體環境和/或相對較高的濕度例如85-100%。根據一個示例性實施方案，僅僅腔室2202被保持在保溫條件下。如上所述，這些保溫條件可以是保持DMO組織培養物存活性所需的。根據本發明的示例性實施方案，可安裝一液體供應裝置以從至少一個液體罐例如液體罐2244和2246向輸入管線2242供應液體。在一個示例性實施方案中，罐2244和2246可含有相同的液體例如生長培養基，在這種情況下一個罐可用作另一罐的備份。在另一示例性實施方案中，罐2244和2246可含有兩種不同類型的液體，如用于DMO加工的不同階段的兩種類型生長培養基。罐2244和/或罐2246可包括一無菌空氣過濾器以便以無菌方式平衡壓力，如上述參照貯液池2208所述那樣。或者，罐2244和/或罐2246可包括一折疊式罐例如現有技術中已知的無菌塑料袋。根據本發明的示例性實施方案，罐2244和2246的每一個可經閥2252例如夾緊閥、隔片端口連接器(septum port connector) 2248 和穿入針(penetration spike) 2250與組合連接器(combining connector) 2254液體連通。連接器2254可包括例如本領域已知的一 Y型或T型連接器。閥2252可適于控制液體從罐2244和/或罐2246流向連接器2254。泵例如蠕動泵2256可沿輸入管線2242位于連接器2254和連接器2258之間。控制器2286可通過可控伺服馬達(actuating motor)2257和/或閥2252用于控制提供給忙液池2208的液體的量和/或流速。根據一個示例性實施方案，罐2244和/或罐2246中所含的液體在冷卻4°C條件下的儲存期限是9天。因此可采用一致冷系統(未示出)保持罐2244和/或罐2246中的液體在一定溫度，該溫度可低于貯液池2208的保溫溫度。因此，輸入管線2242可穿過致冷條件和保溫條件之間的界面。在儲存期限超過后，罐2244和/或罐2246可被換以新罐。根據一示例性實施方案，生物反應器2200的至少一些構件可由一次性無菌塑料成分形成。根據這些實施方案，生物反應器2200可包括一次性使用的無菌包裝的生物反應器裝置，其可被運送到DMO采集部位并且可在無菌環境中被打開并在原位準備以使生長培養基注射進每一生物反應器腔室2202。用于采集DMO的工具可通過DMO插入口 2201插入以便以無菌方式將DMO沖洗進腔室2202，如上所述。生物反應器裝置2200可以例如在保溫條件下被運送至加工部位，在加工部位其可與系統2207的其它部件連接，這些部件例如連接器2258、馬達2216和/或2224、夾緊閥2252和/或蠕動泵2256。控制器2286隨后在整個體外加工過程中可控制DMO的維持和轉導，在此過程中從采集的DMO產生DTM0。具體對象所需的劑量可使用例如本文所述的藥動學模型確定。生物反應器裝置隨后可從系統2207脫離，并例如在保溫條件下被運送至植入部位。為了例如根據上述植入方法植入特異的DTM0，可通過移去蓋2232而打開裝有該特異DTMO的生物反應器腔室2202，可從腔室中取出DTMO。
實施例實施例I DTMO-hEPO的人促紅細胞生成素體外分泌水平進行實驗以分析得自不同人皮膚樣品的DTMO-hEPO之間的體外hEPO分泌水平的
變異性。實驗程序
從得自6個不同人的皮膚樣品制備DTMO-hEPO (各3份)，在洗滌病毒載體后在圖4所示的不同時間點測量hEPO分泌水平。實驗結果在不同人皮膚樣品之間DTMO-hEPO分泌水平是類似的。另外，DTMO-hEPO分泌水平類似于先前從分層TM0-hEP0獲得的分泌水平(數據未示出)。實施例2
組織學為了驗證DTMO主要含有真皮成分，進行一組織學分析。從分層皮膚或真皮皮膚樣品制備MO，由一皮膚病理學家進行組織學分析。如圖5左側所示，DTMO含有真皮層和真皮成分，沒有殘余的基底和/或表皮層。相比之下，圖5右側示出的分層TMO含有所有皮膚層包括基底和表皮層。實施例3免疫細胞化學研究為了研究哪些細胞在DTMO-hEPO組織中被轉導，在采集后第9天用抗hEPO單克隆抗體(I :20稀釋度)進行DTMO-hEPO的組織學免疫組織化學分析。分析揭示真皮成纖維細胞強染色，如圖6所示。染色遍布整個DTMO。實施例4 來自DTMO-hEPO和完整TMO的在SCID小鼠中的長期hEPO造血活性的比較進行實驗以檢查和對比皮下植入的DTMO-hEPO和分層衍生的TM0_hEP0在SCID小鼠中的長期作用。實驗程序制備人DTMO-hEPO和人分層衍生的TMO-hEPO并皮下植入到兩組SCID小鼠(每組5只小鼠)中。對照組植入用Ad/lacZ病毒載體轉導的人DTMO和分層衍生的ΤΜ0。實驗結果如圖7所示，在兩個實驗組中觀察到相似的分泌水平和生理學應答，而如所預期的，對照組小鼠在其血液中沒有hEPO。在所有實驗組中，早在植入后15天即可觀察到血細胞比容的升高，并保持超過5個月，而ΜΟ/lacZ對照小鼠不顯示這種血細胞比容水平的升高。當與分層衍生的TM0-hEP0相比時，DTMO-hEPO看起來產生了類似的分泌水平并維持了類似一段時間。實施例5DTMO-hEPO當被皮下植入時不形成角質囊腫實驗程序將DTMO-hEPO和分層衍生的TMO-hEPO皮下植入SCID小鼠中，經臨床和組織學分析監控角質囊腫形成。實驗結果如圖8清楚可見，在植入后76天和141天觀察到植入分層衍生的TM0_hEP0有角質囊腫形成。相反，在植入后113天具有DTMO-hEPO的SCID小鼠中沒有觀察到囊腫形成。實施例6分層衍生的和DMO在健康人中的整合實驗程序用商購的取皮機(Aesculap GA 630)獲得人真皮MO和人分層衍生的分層衍生的ΤΜ0。在采集前,用Emla乳液(表面局部麻醉)和皮下注射Marcain + Adrenalin (局部麻醉)進行供體和受體部位的表面局部(topical)和局部(local)麻醉。采集兩種類型的皮膚樣品以產生人真皮MO和人分層衍生的MO。為獲得人分層衍生的MO，從腹部靠下部分切下一條健康皮膚。從這一皮膚部分如前所示制備6個線狀MO。同時，用可調式裂縫制備機在植入部位制備具有特定尺寸的裂縫，稍后將MO移植進所述皮膚裂縫。為制備人真皮MO，以兩步采集皮膚。首先，采集深度為200微米的皮瓣并保持在濕紗布中。從這一采集部位采集Imm深的真皮皮膚條。采集皮膚后，將所述200微米皮瓣放回供體部位以作為生物敷料。從上述采集的真皮條用制備分層衍生的分層衍生的TMO相同的程序制備4個真皮MO。將所述人真皮MO稍后用套針皮下植入。用Biodusivei)透明膜(Johnson&Johnson,USA)覆蓋供體和植入部位。一周后，更換敷料，檢查植入物以檢查移植整合。MO植入后兩到三周，進行設計的腹壁成形術，切下包括移植和植入區域在內的一部分皮膚。在移植區域進行臨床評價，包括照相和組織學檢查以確定MO整合。實驗結果植入后一周進行的臨床檢查和腹壁成形術后很快(移植后2 - 3周)進行的組織學分析顯示移植的MO非常好地整合進皮膚裂縫中以及整合在真皮MO皮下植入部位(圖9 )。在植入進裂縫中的分層衍生的MO上以及在皮下植入的真皮MO上均未發現發炎或紅腫跡象。實施例7 表達人促紅細胞生成素(hEPO)的小型豬皮膚線性分層TMO自體植入免疫相容性動物中線狀(30. 6毫米長、O. 6微米寬)小型豬(Sinclar豬)皮膚微器官從用普通麻醉程序得自活動物的新鮮皮膚組織樣品制備。0.9-1. Imm分層皮膚(深度)的組織樣品用商購取皮機(AesculapGA630)取下，并在皮氏皿(90_)中用含有谷氨酰胺和Pen-Str印的DMEM清潔。為了產生線狀微器官，經加壓裝置使用上述刀刃結構將上述組織樣品切割成所希望的尺寸30. 6毫米X600微米。將所得線狀微器官置于不含血清的每孔含有500微升 DMEM (Biological Industries — Beit Haemek)的 24 孔微滴板中，每孔 I 個微器官，在5% CO2下于37°C保溫24小時。在振蕩平板的同時，使用一攜帶編碼人促紅細胞生成素的基因的腺病毒載體(Adeno-hEPO) (I X 101(lIP/ml)對每一孔進行轉導程序以產生小型豬皮膚治療性微器官(豬皮膚ΤΜ0)。每2 — 4天更換培養基并用一特異性ELISA試劑盒(Cat. #DEP00, Quantikine IVD, R&D Systems)分析培養基中是否存在 hEPO。將上述小型豬皮膚hEPO線狀TMO皮下植入以及作為皮膚移植片移植進幾個免疫相容性小型豬中(在兩個小型豬中，皮下植入TM0-hEP0，在另外兩個小型豬中，TM0-hEP0移植進Imm深的裂縫中)。在每一小型豬中植入走過數目的TM0-hEP0以便在每個豬中它們的組合的植入前分泌水平為約每天7微克。在植入后連續7天產生了經ELISA測定的升高的血清hEPO水平(圖3A)和網狀紅細胞計數升高。因此，很清楚本發明已利用實施方案的非限制性的詳細描述進行了描述，這些實施方案是示例性的，并非意在限制本發明范圍。例如，僅僅有限數量的遺傳變化被顯示。但是，基于本文所述的活組織被再植入患者體內的方法學，以及在植入后該組織在身體中的存活性，很清楚由基本上任何已知方法誘導的基本上任何的組織中的遺傳變化都將產生靶蛋白或其它治療劑在患者中的分泌。本發明的實施方案的變化、包括各種實施方案的特征的組合對于本領域技術人員是能想到的。本發明的范圍因此僅由權利要求書的范圍限定。另外，為了避免有關權利要求書范圍的任何問題，當權利要求書中使用術語“包含”、“包括”或“具有”或其后綴時，它們是指“包括但非必須限 于”。
權利要求
1.表達和分泌至少一種重組基因產物的遺傳修飾的真皮微器官，所述真皮微器官包含多種真皮成分，其保持它們所來源的真皮組織的微觀結構和三維結構，具有選定的尺寸從而允許充足的養分和氣體被動擴散至所述真皮微器官的細胞以及細胞廢物擴散出所述細胞，從而將由于在所述真皮微器官中營養不足和廢物積累所致的細胞毒性和伴隨的死亡減至最低，其中至少一些所述細胞表達至少一種重組基因產物的至少一部分，其中所述至少一種重組基因產物選自促紅細胞生成素、干擾素和因子VIII。
2.權利要求I的遺傳修飾的真皮微器官，其中所述真皮微器官包括真皮剖面的一部分。
3.權利要求I的遺傳修飾的真皮微器官，其中所述真皮微器官包括真皮剖面的大部分。
4.權利要求3的遺傳修飾的真皮微器官，其中所述真皮微器官包括基本上整個真皮剖面。
5.權利要求I的遺傳修飾的真皮微器官，其中所述真皮微器官進一步包括脂肪組織。
6.權利要求I的遺傳修飾的真皮微器官，其中所述遺傳修飾的真皮微器官包括體內分界線。
7.權利要求I的遺傳修飾的真皮微器官，其中所述的干擾素是干擾素α。
8.權利要求I的遺傳修飾的真皮微器官，其中所述的干擾素是干擾素β。
9.權利要求I的遺傳修飾的真皮微器官，其中所述的干擾素是干擾素Y。
10.權利要求I的遺傳修飾的真皮微器官用于在對象中誘導局部或全身性生理學作用的用途，其中所述至少一種重組基因產物選自促紅細胞生成素、干擾素和因子VIII。
11.權利要求10的用途，其中所述誘導在將所述遺傳修飾的真皮微器官植入皮膚中或皮膚下之后發生。
12.權利要求10的用途，其中所述誘導在將所述遺傳修飾的真皮微器官皮下植入之后發生。
13.權利要求10的用途，其中所述局部或全身性生理學作用是提高所述對象中的百分比血細胞比容。
14.權利要求10的用途，其中所述至少一種重組基因產物是促紅細胞生成素并且所述局部或全身性生理學作用是保持所述對象中的百分比血細胞比容。
15.權利要求14的用途，其中所述保持為保持至少一個月。
16.權利要求10的用途，其中所述至少一種重組基因產物是促紅細胞生成素并且所述局部或全身性生理學作用是提高然后保持所述對象中的百分比血細胞比容。
17.權利要求16的用途，其中所述保持為保持至少一個月。
18.權利要求I的遺傳修飾的真皮微器官在制備用于將至少一種感興趣的基因產物輸送至對象的藥物中的用途，其中所述至少一種重組基因產物選自促紅細胞生成素、干擾素和因子VIII。
19.權利要求18的用途，其中所述藥物用于植入皮膚中或皮膚下。
20.權利要求18的用途，其中所述藥物用于皮下植入。
21.權利要求18的用途，其中所述真皮微器官來自所述對象。
22.權利要求18的用途，其中所述真皮微器官來自供體。
23.權利要求22的用途，其中所述供體是人。
24.權利要求22的用途，其中所述供體是非人動物。
25.權利要求18的用途，其中所述的干擾素是干擾素α。
26.權利要求18的用途，其中所述的干擾素是干擾素β。
27.權利要求18的用途，其中所述的干擾素是干擾素Y。
全文摘要
本發明的實施方案提供了真皮微器官(DMO)和產生及應用所述DMO的方法和裝置。本發明的一些實施方案提供了具有多個真皮成分的DMO，其基本上保持它們所來源的真皮組織的微觀結構和三維結構，具有選定的尺寸從而允許充足的養分和氣體被動擴散至所述真皮微器官的細胞以及細胞廢物擴散出所述細胞，從而將由于在所述真皮微器官中營養不足和廢物積累所致的細胞毒性和伴隨的死亡減至最低。本發明的一些實施方案提供了用于采集DMO的方法和裝置。根據一些示例性實施方案，用于采集DMO的裝置可包括一支撐構造，用于支撐待從中采集DMO的皮膚相關組織結構，和一能夠將DMO從所述皮膚相關組織結構中分離的切割工具。還描述和要求保護其它的實施方案。
文檔編號C12N5/071GK102816738SQ20121018903
公開日2012年12月12日 申請日期2004年4月29日 優先權日2003年5月1日
發明者斯蒂芬·F.·貝洛莫, 伊扎克·利平, 吉列爾莫·阿爾貝托·皮瓦, 利奧爾·羅森貝格, 莫迪凱·布赫曼, 巴魯赫·S.·斯特恩, 戴維·沙爾海韋特, 梅納赫姆·D.·沙維特, 安德魯·L.·珀爾曼 申請人:邁德詹尼克斯公司