專利名稱：一株產α-酮戊二酸的菌株及用其發酵生產α-酮戊二酸的方法
技術領域：
本發明采用微生物發酵法生產α -酮戊二酸。發明內容涉及一株基因改造后丙酮酸代謝過程可動態調控的α-酮戊二酸高產菌株，以及相關的發酵生產技術。本發明是一種高光學純度和化學純度的α -酮戊二酸制造技術，發酵生產過程中只有痕量琥珀酸，乙酸等雜酸的生成。屬于微生物發酵工程技術領域。
背景技術：
α -酮戍二酸(a-ketoglutaric acid, a-KG),又名 α -氧代戍二酸，α -膠酮酸，α-羰基戊二酸，α-酮基戊二酸，在細胞代謝中起重要作用，是三羧酸循環的重要中間產物之一，在生物體內參與氨基酸、蛋白質和維生素的合成以及能量代謝。α -酮戊二酸在醫藥工業、飼料工業、有機合成和功能性食品等領域應用廣泛。醫藥工業方面，α-酮戊二 酸主要作為生化試劑和測肝功能的配套試劑，另外α-酮戊二酸還具有抗氰作用，可以起到抗驚厥作用；飼料工業方面，作為飼料添加劑可以提高動物抗應激能力，增強免疫功能，促進骨骼發育和提高繁殖率；有機合成方面，α -酮戊二酸也是重要的化工合成中間體，用于多種衍生化學品的合成；功能性食品方面，α-酮戊二酸主要作為運動營養飲料的成分，同時可以降低術后患者和長期病人的機體損耗。目前α-酮戊二酸的合成主要采用化學合成法。與化學合成法相比較，微生物發酵法用于α-酮戊二酸的合成在產品制備過程和產品品質方面均優勢明顯。因此隨著優良生產菌種的選育和發酵技術的不斷成熟，微生物發酵法必將會取代化學合成法成為α -酮戊二酸的主要合成方式。多種微生物被報道可以用于α-酮戊二酸的發酵生產，包括解脂假絲酵母(Candida lipolytica)、解脂亞洛酵母(Yarrowia Iipolytica)、光滑球擬酵母(Torulopsis glabrata)以及谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)等細菌。而大腸桿菌用于α-酮戊二酸的發酵生產未見報道。大腸桿菌作為遺傳背景最為清晰的微生物之一，被廣泛的用于包括人類在內的生命體代謝相關機理的研究。隨著大腸桿菌代謝網絡和分子水平上調控機理的不斷被揭示和闡明，單一代謝中間體在大腸桿菌中的積累研究成果豐碩。目前，乙醇，乙酸，丙酮酸，琥珀酸，蘋果酸，乳酸等多個代謝中間物的大量合成均可以在大腸桿菌中實現。一分子葡萄糖通過EMP途徑形成兩分子丙酮酸的過程中會形成兩分子NADH，兩分子丙酮酸形成乙酰輔酶A的過程則會再產生兩分子NADH。乙酰輔酶A進入TCA循環后會形成更多NADH用于產生能 量合理高能化合物ATP等。大腸桿菌中，丙酮酸主要有四個流向。一是磷酸烯醇式丙酮酸合酶(pps)作用下回流形成磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)。二是經丙酮酸氧化酶(pox)作用下直接形成乙酸。三是經乳酸脫氫酶(IdhA)作用還原形成乳酸。四是形成乙酰-CoA。丙酮酸形成乙酰-CoA存在兩條途徑，一條途徑是，丙酮酸在甲酸裂解酶(Pf I)的作用下形成甲酸和乙酰-CoA，該途徑主要在氧氣不足時發揮作用。另一條途徑是，氧氣存在條件下，丙酮酸在丙酮酸脫氫酶復合體(Pdh)的作用下脫羧氧化形成乙酰-CoA。因此，失活磷酸烯醇式丙酮酸合酶(pps)、丙酮酸氧化酶(pox)、甲酸裂解酶(pfl)和乳酸脫氫酶(IdhA)后，丙酮酸主要在丙酮酸脫氫酶復合體(pdh)作用下流向乙酰-CoA，進而進入TCA循環。在此基礎上阻斷α-酮戊二酸的分解代謝途徑，獲得的菌株即為α-酮戊二酸發酵生產菌株。由于α-酮戊二酸的下行代謝途徑主要由α-酮戊二酸脫氫酶復合體催化完成。因此可以通過失活脫氫酶復合體實現上述設想。然而α-酮戊二酸脫氫酶復合體和丙酮酸脫氫酶復合體同屬于α-酮酸脫氫酶復合體，其催化單元屬于同一個催化酶系。因此，α-酮酸脫氫酶復合體主要酶系(如Ε1，Ε2和Ε3)的輔因子同時參與α-酮戊二酸脫氫酶復合體和丙酮酸脫氫酶復合體。有益的是，這些輔因子會優先作用于丙酮酸的脫氫酶復合體形成乙酰-CoA，因此控制細胞中該酶系輔因子的水平可以有效的實現丙酮酸形成乙酰-CoA途徑順暢的同時使得α -酮戊二酸下行分解代謝受阻，進而實現α-酮戊二酸的過量積累。本發明正是基于這一策略成功構建了高效合成α -酮戊二酸的重組大腸桿菌，并建立了對應的簡潔發酵工藝。
大腸桿菌利用葡萄糖合成α-酮戊二酸的過程與菌體生長是部分偶聯的，采用兩階段發酵工藝可以更好的實現α-酮戊二酸的快速合成。理想的α-酮戊二酸合成模式是，菌體生長階段α-酮戊二酸不積累，而α-酮戊二酸快速合成階段菌體不生長或緩慢生長。即菌體生長階段保留α -酮酸脫氫酶復合體的功能，而在發酵產酸階段限制其功能的繼續發揮，進而實現α-酮戊二酸的過量積累。大腸桿菌除了自身可以合成α-酮酸脫氫酶復合體輔因子外，也可以以外源的添加物為底物，合成相應的輔因子。這一特點為實現大腸桿菌輔因子合成能力的人為調控提供了可能。以此，通過失活輔因子關鍵編碼基因，阻斷其原有的合成途徑，進而通過添加硫胺素實現對輔因子合成的調控。菌體生長階段添加丙酮酸脫氫酶系輔因子獲得足夠的菌體，α -酮戊二酸合成階段適量補加輔因子，阻斷α -酮戊二酸分解代謝的途徑。上述過程意味著大腸桿菌代謝流的重新分配和氧化還原平衡的重新構建。本發明通過敲除部分關鍵酶的編碼基因阻斷旁路代謝途徑，并通過對α -酮酸脫氫酶系輔因子合成過程的調控，實現了對丙酮酸進入TCA循環的途徑動態控制，最終完成了氧化還原平衡下的α -酮戊二酸高強度合成。本發明經適當修改后，也可以用于其他生產菌種從葡萄糖或木糖以及淀粉或纖維素水解液或生物柴油來源的粗甘油等原料高效單一生產L-乳酸、丙酮酸、蘋果酸、丁二酸、D-丙氨酸等其它有機酸或蛋白質等。
發明內容
本發明的目的是通過基因工程手段構建丙酮酸代謝可動態調控的α -酮戊二酸高產菌。并根據菌種的生長和代謝特性調整相關發酵工藝，實現丙酮酸積累和α-酮戊二酸合成的代謝平衡，建立一種α -酮戊二酸高效制備方法，獲得少有或沒有副產物，光學純度高的產品，同時形成一套簡潔易控的α-酮戊二酸發酵工藝。本發明的技術方案一株產Ct -酮戍二酸的菌株，其分類命名為大腸桿菌(Escherichia coli) B0013-090A,該菌株已保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號CCTCC NO M 2012173，動態調控發酵過程，該菌株在添加丙酮酸脫氫酶系輔因子的情況下在好氧培養階段快速生長，在發酵產酸階段菌體生長受限快速合成α -酮戊二酸。
用所述的產α-酮戊二酸的菌株發酵生產α-酮戊二酸的方法，出發菌株為本發明構建的α-酮戊二酸高產菌株CCTCC NO Μ 2012173，動態調控發酵過程，丙酮酸脫氫酶系輔因子在發酵開始添加，發酵過程中不再添加，丙酮酸脫氫酶系輔因子的添加量為r200ng/L ;在發酵初期的8 12h內，培養溫度控制在2(T30°C，pH維持7. 0，初始糖濃度為3%，充分供氧控制溶氧不低于30%，該階段菌體利用葡萄糖快速生長，檢測糖濃度低于O. 2%時，停止通氧；之后為厭氧發酵階段，培養溫度控制在37 45°C，pH維持7. 2，停止供氧并兩次分批補加葡萄糖至終濃度10%，控制第二次補糖前殘糖不低于1%，該階段菌體利用葡萄糖快速合成α -酮戊二酸；發酵36 48h產α -酮戊二酸水平達到9%，α -酮戊二酸的化學純度達到95%以上，幾乎無其它有機酸產生。好氧階段菌種較完全的利用葡萄糖快速生長，形成菌體，但不形成各種副產有機酸；厭氧階段菌體保持較高活性，快 速利用葡萄糖合成α -酮戊二酸，并幾乎不形成其它有機酸。發酵過程中多個工藝參數被調控，所涉及到的工藝參數包括溫度、pH、溶氧、殘糖和丙酮酸脫氫酶系輔因子。本發明主要應用于大腸桿菌，但不僅僅局限于大腸桿菌，還應用于芽孢桿菌類細菌、腸桿菌科細菌、或酵母。本發明主要應用于代謝葡萄糖合成α -酮戊二酸，但不僅限于此，還能代謝木糖、淀粉水解液、纖維素水解液、糖蜜或生物柴油副產甘油之多種碳源，或用于合成L-乳酸、丙酮酸、蘋果酸、丁二酸、D-丙氨酸之一種。發酵生產過程全程采用質量濃度25%的Ca(OH)2調節pH，好氧階段的控制過程不通過測定菌體量而通過檢測殘留葡萄糖的濃度來確定轉厭氧的節點。本發明特征是在pH 7.0，2(T30°C生長溫度下，提供足夠的通氧，在添加丙酮酸脫氫酶系輔因子或輔因子合成相關底物后，α-酮戊二酸生產菌株較完全的利用葡萄糖快速生長，積累菌體；在pH 7.2，37 451下，停止供氧，菌體利用葡萄糖快速合成α -酮戊二酸，并幾乎不形成其它有機酸和乙醇。本發明α-酮戊二酸的生產工藝特征為2(T45°C的條件下，發酵36 48h產α-酮戊二酸水平達到9%，α-酮戊二酸的化學純度達到95%以上。本發明涉及的重組菌，其基因組中的一個或多個基因被刪除或表達。所涉及到的基因產物包括NAD依賴性α -酮戊二酸脫氫酶、FAD依賴性的α -酮戊二酸脫氫酶、FAD依賴性L-乳酸脫氫酶、丙酮酸氧化酶、丙酮酸甲酸裂解酶、丙酮酸脫氫酶、乙酸激酶、乙醇脫氫酶、蘋果酸脫氫酶、蘋果酸合酶、硫胺素合酶、腺苷酰(基)轉移酶、噻唑合酶、酪氨酸裂解酶、半胱氨酸脫硫酶、磷酸硫胺素合酶、硫胺素激酶、磷酸硫胺素激酶、二氫硫辛酸脫氫酶、二氫硫辛酰轉乙基酶等。所涉及到的工藝控制參數包括溫度、pH、溶氧、殘糖濃度、輔因子添加量。本發明使用菌種、培養基和工藝控制方法菌種本發明使用的菌種為經過基因改造大腸桿菌(Escherichia coli)B0013-090A ( Δ pf IB, Δ did, Δ frd, Δ ack-pta, Δ adh, Δ IdhA, Δ thiE),該菌株中，甲酸、乙酸、琥珀酸等多種有機酸和乙醇的合成代謝途徑以及丙酮酸脫氫酶系輔因子中的多個關鍵酶編碼基因被敲除。培養基本發明使用的培養基為基本培養基(簡稱MG培養基)添加葡萄糖為碳源。
溫度控制策略本發明中涉及的大腸桿菌最適生長溫度為2(T30°C，最適產酸溫度為37 45°C。發酵過程采用兩階段控制，前期采用2(T30°C利于菌體快速生長獲得足夠的菌體量；后期采用37 45°C利于α -酮戊二酸的合成。pH控制策略本發明中涉及的大腸桿菌最適生長pH為7. 0，后期產酸階段維持pH7. 2既有利于減少發酵液中游離α -酮戊二酸的濃度提高產酸速率，又有利于維持細胞的活性。因此發酵過程采用兩階段PH控制策略，菌體生長階段維持pH 7.0，利于菌體快速生長獲得足夠的菌體量；后期產酸階段維持PH 7. 2，提高產酸速率。溶氧控制策略本發明中涉及的大腸桿菌為兼性厭氧菌，有氧條件下菌體快速生長，無氧條件下菌體利用葡萄糖快速合成α-酮戊二酸。發酵過程前期采用充分供氧策略，利于菌體快速生長，少生成或不生成各種有機酸等副產物；后期厭氧階段，停止供氧，菌體在微好氧條件下維持一定的菌體活性，并快速代謝葡萄糖合成α -酮戊二酸。殘糖控制策略本發明中涉及的大腸桿菌可以代謝葡萄糖合成α-酮戊二酸，其 合成甲酸，琥珀酸和乙醇的代謝途徑被有效阻斷。盡管該菌株多個乙酸代謝相關的關鍵基因被敲除，在丙酮酸濃度較高的情況下該菌株仍然可以大量積累乙酸。好氧階段后期通過維持低殘糖可以有效避免轉厭氧后丙酮酸的過量積累，從而達到了丙酮酸積累和α-酮戊二酸合成的代謝平衡，避免了乙酸的積累，提高了 α-酮戊二酸的合成效率。前期菌體生長階段添加適當的葡萄糖，待葡萄糖耗盡并獲得足夠的菌體量后轉為厭氧發酵產酸，發酵產酸階段分批間歇補加葡萄糖，從而實現了 α -酮戊二酸的高效制備。丙酮酸脫氫酶系輔因子添加策略本發明中丙酮酸脫氫酶系輔因子在發酵開始添力口，發酵過程中不再添加。丙酮酸脫氫酶系輔因子的添加量是關鍵所在。通過多次梯度摸索試驗最終確定了丙酮酸脫氫酶系輔因子的添加量為f200ng/L.本發明的突出的實質性特點和顯著進步主要體現在I、本發明構建的基因工程重組α-酮戊二酸高產菌，其丙酮酸的代謝過程可以動態調控，實現了菌體生長階段丙酮酸主要用于菌體細胞的合成，而在發酵產酸階段丙酮酸主要用于α-酮戊二酸的高效合成。2、本發明的建立的發酵工藝操作簡單，易于實現，發酵過程不需要復雜的過程監控，丙酮酸脫氫酶系輔因子的添加在發酵伊始即可完成，后續發酵過程中不需要額外的操作。3、本發明的建立的發酵工藝中，發酵過程中添加的丙酮酸脫氫酶系輔因子，添加量屬于痕量級別，不僅不會增加發酵成本和后提取成本，且其添加有效的減少的副產物的生成，對于高品質α-酮戊二酸的后提取作用顯著。4、本發明建立的發酵工藝可以制備高化學純度的α -酮戊二酸，菌株在2(T45°C的條件下發酵36 48h，產α-酮戊二酸水平達到9%，所產α -酮戊二酸的光學純度達到95%以上；本發酵過程采用無機鹽培養基，且基本沒有雜酸等副產物的合成，保障了 α -酮戊二酸的高品質。生物材料樣品保藏一株產α-酮戊二酸的菌株，其分類命名為大腸桿菌(Escherichia coli ) B0013-090A，該菌株已保藏于中國典型培養物保藏中心，簡寫CCTCC，地址中國武漢武漢大學，保藏編號CCTCC NO M 2012173，保藏日期2012年5月20日。
圖I輔因子濃度對(Escherichia coli) B0013-090A菌體生長的抑制作用((Escherichia coli) B0013-070B 為對照)。圖2實施案例4中的產α -酮戊二酸情況。
具體實施例方式種子的培養采用LB培養基37°C的條件下，搖床轉速200r/min培養至對數生長期中后期，獲得一級種子；5%接種量轉接至MG培養基，370C的條件下，搖床轉速200r/min培養至對數生長期中后期，獲得二級種子，用于發酵罐接種。發酵方式本發明建立的具體發酵方式如下采用MG培養基作為發酵培養基，7L發酵罐裝液量3L，5%接種量。好氧階段初始糖濃度3%，培養溫度為2(T30°C，控制溶氧不低于30%，Ca(OH)2維持pH為7.0 ;檢測糖濃度低于O. 2%時，停止通氧，補加葡萄糖至終濃度10%，Ca (OH) 2維持pH為7. 2，發酵溫度維持37 45°C，發酵過程中測定殘糖濃度，殘糖濃度低于1%時，二次補糖至終濃度10%。發酵過程中定時取樣用于高壓液相分析。樣品的分析發酵樣品一部分離心取上清測定糖濃度，另一部分硫酸酸化處理后，離心取上清，經10%三氯乙酸沉淀，再次離心，上清液經O. 45 μ m微孔濾膜過濾后，用于高壓液相分析。高壓液相采用Shodex SUGAR SHlOlI，柱溫50°C，紫外檢測，波長為210nm。流動相為 O. 01mol/L H2SO4,流速 O. 7ml/L,柱壓 44Bar。實施例I—刪除乳酸脫氫酶的編碼基因合成的寡核苷酸引物Pl (序列表中SEQ ID No 1)5' -TAAGGATCCT TATGAAACTC GCCGTTTATA GCACA-3'合成的寡核苷酸引物P2 (序列表中SEQ ID No 2)5' -CTTGAATTCG CTGCCGGAAA TCATCATTTT TT-3/以合成的寡核苷酸引物Pl和Ρ2為引物，以大腸桿菌947染色體DNA為模板，運用PCR從基因組中擴增獲得乳酸脫氫酶基因(ldhA，序列表中SEQ ID No :3)，將此PCR產物克隆入PUC18的EcoRI位點中，獲得重組質粒pUC-ldhA。用PstI酶切去除其中的400bp的片段并用T4DNA Polymerase將粘性末端平滑化，再與difEe-GmK連接，獲得 重組質粒pUC-ldhA::GmKdif，用EcoRI酶切該重組質粒，獲得丙酮酸甲酸裂解酶的基因刪除序列，pfl' -dif-GmK-dif-ldhA,即ldhA: :GmEdif0將此基因刪除序列轉化入大腸桿菌(Escherichia coli ) B0013-070B ( Δ pf IB, Δ did, Δ frd, Δ ack-pta, Δ adh ) 在選擇性培養基上選擇培養出轉化子。再在非選擇性培養基上傳代，篩選出選擇性標記消失的轉化子。提取轉化子染色體DNA，用PCR驗證目的基因突變，獲得轉化子大腸桿菌(Escherichiacoli ) B0013-080A ( Δ pf IB, Δ did, Δ frd, Δ ack-pta, Δ adh, △ IdhA)并用于后續研究。實施例2—刪除磷酸硫胺素酶的編碼基因合成的寡核苷酸引物P3 (序列表中SEQ ID No 4)5' -AGAGAATTCA TTCATCGCCA ACTCCTGCA-3'
合成的寡核苷酸引物P4 (序列表中SEQ ID No 5)5' -AGAGAATTCG GTGGACAGCG TACAGTGGAT CG-3,以合成的寡核苷酸引物P3和P4為引物，以大腸桿菌947染色體DNA為模板，運用PCR從基因組中擴增獲得硫胺素酶基因(thiE，序列表中SEQ IDNo :6)，將此PCR產物克隆入PUC18的EcoRI位點中，獲得重組質粒pUC-thiE'。用StuI酶切并與difEe_GmK連接，獲得重組質粒pUC-thiE' : :dif-GmK，用EcoRI酶切該重組質粒，獲得硫胺素酶的基因刪除序列，ThiE' -dif-GmR-dif-ThiE/，即ThiE' : :GmKdif。將此基因刪除序列轉化入大腸桿菌大腸桿菌(Escherichia coli ) B0013-080A ( Δ pf IB, Δ did, Δ frd, Δ ack-pta, Δ adh,AldhA)。在選擇性培養基上選擇培養出轉化子。再在非選擇性培養基上傳代，篩選出選擇性標記消失的轉化子。提取轉化子染色體DNA，用PCR驗證目的基因突變，獲得轉化子大腸桿菌(Escherichia coli ) B0013-090A ( Δ pf IB, Δ did, Δ frd, Δ ack-pta, Δ adh, Δ IdhA,Λ thiE)并用于后續研究。實施例3—輔因子添加濃度對菌體生長的影響發酵液中添加不同濃度的輔因子(如VB1，硫辛酰胺等)對本發明中所涉及的菌種大腸桿菌(Escherichia coli)B0013_090A的生長狀況的影響。當輔因子濃度低于10ng/L時，已經對菌體生長產生了嚴重的抑制作用。實施例4——B0013-090A發酵產α -酮戊二酸情況
發酵工藝采用具體實施方式
中建立的控制策略。菌種大腸桿菌(Escherichiacoli)B0013-090A發酵36h后α -酮戊二酸產量已超過6%，發酵48h后α -酮戊二酸產量接近9%。
權利要求
1.一株產a -酮戍二酸的菌株，其分類命名為大腸桿菌{Escherichia coli )B0013-090A，該菌株已保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號CCTCC NO M 2012173，動態調控發酵過程，該菌株在添加丙酮酸脫氫酶系輔因子的情況下在好氧培養階段快速生長，在發酵產酸階段菌體生長受限快速合成a-酮戊二酸。
2.用權利要求I所述的產a-酮戊二酸的菌株發酵生產a-酮戊二酸的方法，其特征在于出發菌株為本發明構建的a -酮戊二酸高產菌株CCTCC NO M 2012173，動態調控發酵過程，丙酮酸脫氫酶系輔因子在發酵開始添加，發酵過程中不再添加，丙酮酸脫氫酶系輔因子的添加量為廣200 ng/L ;在發酵初期的8 12h內，培養溫度控制在2(T30°C，pH維持7. 0，初始糖濃度為3%，充分供氧控制溶氧不低于30%，該階段菌體利用葡萄糖快速生長，檢測糖濃度低于0. 2%時，停止通氧；之后為厭氧發酵階段，培養溫度控制在37 45°C，pH維持7. 2，停止供氧并兩次分批補加葡萄糖至終濃度10%，控制第二次補糖前殘糖不低于1%，該階段菌體利用葡萄糖快速合成a -酮戊二酸；發酵36 48h產a -酮戊二酸水平達到9%，a -酮戊二酸的化學純度達到95%以上，幾乎無其它有機酸產生。
3.根據權利要求2所述的發酵生產a-酮戊二酸的方法，其特征在于好氧階段菌種較完全的利用葡萄糖快速生長，形成菌體，但不形成各種副產有機酸；厭氧階段菌體保持較高活性，快速利用葡萄糖合成a -酮戊二酸，并幾乎不形成其它有機酸。
4.根據權利要求2所述的發酵生產a-酮戊二酸的方法，其特征在于發酵過程中多個工藝參數被調控，所涉及到的工藝參數包括溫度、pH、溶氧、殘糖和丙酮酸脫氫酶系輔因子。
5.根據權利要求2、3、4所述的發酵生產a-酮戊二酸的方法，其特征在于主要應用于大腸桿菌，但不僅僅局限于大腸桿菌，還應用于芽孢桿菌類細菌、腸桿菌科細菌、或酵母。
6.根據權利要求2、3、4所述的發酵生產a-酮戊二酸的方法，其特征在于主要應用于代謝葡萄糖合成a -酮戊二酸，但不僅限于此，還能代謝木糖、淀粉水解液、纖維素水解液、糖蜜或生物柴油副產甘油之多種碳源，或用于合成L-乳酸、丙酮酸、蘋果酸、丁二酸、D-丙氨酸之一種。
7.根據權利要求2所述的發酵生產a-酮戊二酸的方法，其特征在于發酵生產過程全程采用質量濃度25%的Ca(OH)2調節pH，好氧階段的控制過程不通過測定菌體量而通過檢測殘留葡萄糖的濃度來確定轉厭氧的節點。
全文摘要
一株產α-酮戊二酸的菌株及用其發酵生產α-酮戊二酸的方法，屬于微生物基因工程技術領域。本重組菌命名為大腸桿菌(Escherichiacoli)B0013-090A，已保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號CCTCCNOM2012173，該菌株由大腸桿菌(Escherichiacoli)B0013-070B(保藏編號CCTCCNOM2012071)經基因工程改造獲得。用其動態調控發酵生產α-酮戊二酸，發酵36~48h產α-酮戊二酸水平達到9%，且所產α-酮戊二酸化學純度達到95%以上。該工藝以葡萄糖或淀粉、糖蜜或生物柴油副產甘油為原料，工業化生產α-酮戊二酸，其使用價值非常巨大。本發明發酵培養基簡單清潔，既有利于降低生產成本，也有利于簡化后提取步驟獲得高品質產品。操作工藝簡單易行，有利于在工業化規模生產中推廣使用。
文檔編號C12R1/19GK102676438SQ20121018901
公開日2012年9月19日 申請日期2012年6月8日 優先權日2012年6月8日
發明者周麗, 沈微, 王正祥, 田康明 申請人:江南大學