專利名稱：羅非魚重組口服蛋白tat-gh及制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及基因生物工程技術領域，具體涉及一種重組口服生長素蛋白TAT-GH，還涉及一種重組口服生長素蛋白TAT-GH的制備方法，還涉及一種能表達重組口服生長素蛋白TAT-GH的基因工程菌株；還涉及一種重組口服生長素蛋白TAT-GH在促進羅非魚生長中的應用。
背景技術：
魚類生長激素(growth hormone,GH)是由魚腦垂體遠端的嗜酸性細胞分泌與合成的一類單鏈多肽。它在魚的生長、能量的固定、性腺的發育等方面都具有重要的調節作用，也是水產養殖中一直備受研究者關注的領域。魚類GH的分離工作始于上世紀70年代，在80年代中后期形成熱點。其最初的分·離技術類似于哺乳類GH的分離，通常將魚的腦垂體或體外培養的分泌液在堿性條件下勻漿，經柱層析分離后，再采用等電點沉淀法得到較高濃度的GH，但此法沉淀得到的GH溶解度低，難以溶解。不少學者改進方法，采用柱層析后經離子交換層析，再用rpHP LC純化，或是通過葡聚糖凝膠過濾和反相高效液相色譜純化兩步法得到GH。目前，國內外已有二十多種魚GH被分離純化出來，并對這些魚類GH的氨基酸全序列進行了分析和鑒定，也證明了不同物種間的同源性與差異性。魚生長激素展現了典型的GH特征，如四個半胱氨酸殘基，能形成兩個二硫鍵的能力，推測其能使GH分子形成三級結構和N糖基化位點。對于骨鰾類魚，GH的序列包含有一組不成對的半胱氨酸殘基，推測起著未知的重要功能。本發明所研究的羅非魚(tilapia)原產于非洲，俗稱非洲鯽魚，隸屬于鱸形目麗魚赴羅非魚屬，為一種中小型魚。羅非魚的肉味鮮美，肉質細嫩，含有多種不飽和脂肪酸和豐富的蛋白質，且被譽為未來動物性蛋白質的主要來源之一，現在已作為世界水產業的重點科研培養的淡水養殖魚類。其cDNA的開放閱讀框為615bp，編碼204個氨基酸，具有魚類生長激素的基本結構特征從起始氨基酸M到第17位氨基酸S是信號肽部分，成熟肽是187個氨基酸。成熟肽中有4個半胱氨酸，位置非常保守，它們在成熟肽中形成兩個二硫鍵(C69與C177位、C194與C202位)，構成特征性的一個大環和一個小環。在第201位上有一個N-糖基化位點，這個糖基化位點是蛋白轉導入膜的信號，也是硬骨魚GH的特征之利用基因工程菌表達魚類生長激素是目前大量生產魚生長激素的主要途徑。目前已有多種魚類GH在大腸桿菌中表達，但由于表達產物通常需要復性處理，耗時耗材，所以不是最理想的表達系統。酵母表達系統可以避免這些缺陷，是一種比較方便和有效的表達系統。而藻類和昆蟲等作為表達載體的宿主，可能會獲得更高表達量或是更經濟的生產魚GH的途徑。細胞生物學研究領域中有一類具有細胞穿透功能的氨基酸序列，長度一般小于20個氨基酸，被命名為細胞穿膜肽或蛋白轉導域(PTD)。如人類免疫缺陷病毒(HIV)后期轉錄的調控子蛋白TAT即為PTD的一種。按照結構和功能的不同可以將TAT蛋白劃分為5個區域①酸性N-末端區(1-20位);②半胱氨酸Cys富積區(21 - 39位)，含7個Cys，在HIV的各亞型屬于中高度保守核心區(40-47位)，含RKGLGI氨基酸序列基本區(48-72位)，含RKKRRQRRR氨基酸序列，且具有TAR RNA結合活性；⑤細胞黏附的C-末端區(73-86位)，含RGD氨基酸序列，TAT可通過RGD與細胞整合素結合。通過對TAT的序列進一步的研究已確定其第48-57位(RKKRRQRRR)堿性肽段是保持其穿膜活性的最小片段。穿膜肽TAT可以攜帶多種物質，大至親水性蛋白和多肽，小到DNA甚至顆粒性物質等，都能高效而快速地進行細胞間或細胞內的傳輸，且對細胞無毒副作用。TAT蛋白介導的細胞內轉運過程存在多種機制。最初推測是非受體、非轉運蛋白介導的和非內吞機制，但最終證實其入胞過程是能量依賴的，且需要細胞表面的蛋白多糖的作用。有研究證明，TAT介導的多種物質的入胞機制與其所攜帶的分子大小密切相關。當TAT連接的是大分子或顆粒性物質時，遵循的是一種能量依賴的內吞途徑，然后從核內體中釋放出來進入胞漿；而單獨的TAT多肽(49-57位)或僅連有小分子的TAT (49-57位)入胞過程則是通過與細胞表面發生靜電作用或氫鍵連接而完成的，該過程是非能量依賴的。總之，TAT穿膜的具體機制還有待研究。
盡管TAT的穿膜機制還不太明了，但以其為代表的系列穿膜肽已經廣泛應用于生物和醫藥學領域，大大推進了分子生物學、細胞生物學、藥學、免疫學等的發展。
發明內容
本發明的主要目的是提供了一種TAT-GH融合蛋白，其序列為SEQ ID NO. 2所示。本發明首次將穿膜肽TAT與魚生長激素(growth hormone, GH)融合表達,獲得的融合蛋白可以順利穿過腸膜細胞，進入血清中直接發揮其促生長作用。本發明的另一個目的在于提供了一種TAT-GH融合蛋白的制備方法，通過PCR重疊延伸技術，以GH基因為模板，采用PCR重疊延伸技術在GH序列的前端分步PCR依次加上長度為33個堿基的TAT序列，PCR擴增得到TAT-GH基因。通過雙酶切重組質粒pGEM_T-TAT_GH和質粒pET-32a，連接得到重組質粒pET-32a-TAT-GH，轉化E. coli DH5a,得到Escherichiacoli DH5a pET-32a_TAT_GH。將質粒 pET-32a_TAT_GH 轉化到表達菌株 Escherichia coliBL21 (DE3)，所得陽性克隆即為本發明涉及的能夠表達TAT-GH的大腸桿菌基因工程菌株，將該菌株轉接到2XYT培養基中，經IPTG誘導，融合蛋白TAT-GH以包涵體的形式高效表達。本發明的另一個目的是提供了一種大腸桿菌基因工程菌株，大腸桿菌(Escherichia coli ) BL21 (DE3) pET-32a-TAT-tmGH, F^ompT hsdSB (rB_mB0 gal dcm(DE3),CCTCC NO :M2012148。該菌株可以表達穿膜肽TAT和羅非魚生長激素(growth hormone)的基因工程融合蛋白TAT-GH，使其能順利穿過細胞膜進入胞內產生作用，該菌株能大量表達TAT-GH蛋白，且操作簡便快捷，可更好的應用于工業化生產中，為制備口服促生長制品提供良好的基礎。本發明還有一個目的是提供了一種TAT-GH表達蛋白在促進羅非魚生長中的應用，通過選取大小不同的幼魚，用一定劑量的融合蛋白分別以不同時間間隔對其口服喂食，觀察其促生長效果的差異性，可得出最優化的飼養方式。為了實現上述的目的，本發明采用以下技術措施
從雄性羅非魚腦垂體內提取總RNA，以Oligo (dT) 20為引物合成cDNA第一條鏈。根據Genbank上已經登錄的GH序列設計引物，運用RT-PCR方法擴增羅非魚GH cDNA序列，與運用搭橋法擴增得到的TAT-GH基因分別克隆到表達載體pET32a (+)上，轉化大腸桿菌表達菌株BL21 (DE3)中，經菌落PCR和雙酶切鑒定得到陽性重組菌，IPTG誘導表達。將純化的GH和TAT-GH蛋白通過酶聯免疫吸附受體測定法(ELISA-RA法)測定其生物學活性，并口服喂食羅非魚，一段時間后抽取魚的血清用間接ELISA法檢測魚體內GH含量，證明TAT多肽穿膜活性。蛋白口服喂食羅非魚苗，檢測促生長作用。一種TAT-GH融合蛋白的制備方法，其步驟是A.羅非魚生長激素基因的制備取已處死的新鮮雄性羅非魚腦垂體，液氮研磨，Trizol法提取魚基因組的總mRNA后，以Oligo (dT)20為引物通過RT-PCR得到cDNA，查詢GeneBank中已經錄入的莫桑比克羅非魚生長激素GH的核苷酸序列(GenBank:AF033805. I),同時設計GH的PCR上下游引物，擴增得到GH基因。最后克隆到pGEM-T載體(由Promega公司購得)中，轉化大腸桿菌JM109 (由Novagen公司購得,本實驗室保種)，得到菌株pGEM-T-GH/E. coli JM109，用于基因的增殖和保藏。B. TAT-GH融合基因的制備以步驟A制備得到的GH基因為模板，采用PCR重疊延伸技術在GH序列的前端分步PCR依次加上長度為33個堿基的TAT序列，PCR擴增得到TAT-GH基因，其核苷酸序列為SEQ ID NO. I所示。最后克隆到pGEM_T載體中，得到重組載體 pGEM-T-TAT-GH，轉化大腸桿菌 JM109，得到菌株 pGEM-T_TAT_GH/E. coli JM109，用于基因的增殖和保藏。C.融合基因表達載體的構建雙酶切重組質粒pGEM-T-TAT-GH和質粒pET_32a(由Novagen公司購得，實驗室保種)，膠回收，T4連接酶進行連接，得到重組質粒pET-32a-TAT-GH，轉化E. coli DH5a(由Novagen公司購得，實驗室保種)，涂布含有100 u g/HilAmp+的LB平板，挑取單菌落，進行菌落PCR鑒定和雙酶切鑒定，所得到的陽性克隆子是TAT-GH融合基因的大腸桿菌，命名為Escherichia coli DH5a pET-32a_TAT_GH，作為載體的增值和保藏。D.大腸桿菌基因工程菌的制備將質粒pET-32a-TAT_GH轉化到表達菌株Escherichia coli BL21 (DE3)(由Novagen公司購得，實驗室保種)中，PCR鑒定篩選出陽性轉化子，所得陽性克隆即為本發明涉及的能夠表達TAT-GH的大腸桿菌基因工程菌株Escherichia coli BL21 (DE3) pET-32a-TAT_tmGH，申請人于 2012 年 4 月 26 日將該菌送至中國典型培養物保藏中心進行保藏，保藏地址中國武漢武漢大學，分類命名大腸桿菌 BL21 (DE3) pET-32a-TAT-tmGH, F^ompT hsdSB (rB_mB_) gal dcm(DE3)，Escherichia coliBL21 (DE3)pET-32a-TAT-tmGH，rompT hsdSBgal dcm (DE3)，CCTCC NO :M2012148。通過上述方法獲得了一種大腸桿菌基因工程菌株Escherichia coli BL21 (DE3)pET-32a-TAT-tmGH,它具有如下特征(I)顯微鏡下觀察，大小1_3微米，周身鞭毛，能運動，無芽孢，為革蘭氏陰性短桿菌。(2)在普通的LB平板中培養，其菌落呈圓形，邊緣整齊，表面光滑，半透明，小凸起。(3)兼性厭氧性菌，最適生長溫度為37°C，可用IPTG或乳糖自動誘導表達，代謝旺盛，誘導表達4-6h即可達蛋白最大表達量。
E.基因工程融合蛋白的制備將上述基因工程菌Escherichia coli BL21 (DE3)pET-32a-TAT-tmGH轉接到2乂￥!'培養基中(該培養基配方IL : 16g蛋白胨、IOg酵母抽提物、8gNaCl)，經IPTG誘導，融合蛋白TAT-GH以包涵體的形式高效表達，其氨基酸序列為SEQ IDNO. 2所示。一種TAT-GH融合蛋白促進羅非魚生長中的應用，其應用過程是A.將大腸桿菌基因工程菌株發酵所得目的蛋白純化，得到GH和TAT-GH蛋白。通過酶聯免疫吸附受體測定法(ELISA-RA法)測定其生物學活性，檢測能否與羅非魚肝膜和腸膜發生較為強烈的特異性反應。B.將純化的GH和TAT-GH 口服喂食羅非魚，一段時間后抽取魚的血清用間接ELISA法檢測魚體內GH含量，檢測TAT多肽能否攜帶GH蛋白穿過魚腸壁，進入血液而得到利用。C.進行促生長實驗，即將有活性的GH蛋白和TAT-GH蛋白與等量PBS分別喂食大小規格相同的羅非魚苗，喂食周期為40天。40天后測其平均體重和體長，研究其促生長效果。
本發明與現有技術相比，具有以下優點和效果A.首次將穿膜肽TAT與魚生長激素GH融合表達，獲得融合蛋白可以順利穿過腸膜細胞，進入血清中直接發揮其促生長作用。B.通過對魚腦垂體的RNA提取，得到完整的總RNA和cDNA序列，保證了基因來源的準確性與完整性，與基因合成相比，更加的經濟快捷。C.選取了大腸桿菌作為表達系統，其操作簡單，生長周期短，產量高，成本低，適用于大規模的工業化生產中。
圖I為一種羅非魚腦垂體總RNA的提取示意圖。用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，由大到小依次是28S、18S、5S。圖2為一種TAT-GH的PCR擴增示意圖。通過PCR重疊延伸技術分3次PCR擴增TAT-GH基因，在GH序列的前端加上TAT序列。擴增產物在1%瓊脂糖膠上顯示其大小與預期值648bp相符。I DNA Marker (DL2000) 2 :擴增的 TAT-GH 基因(648bp)圖3為一種TAT-GH的雙酶切鑒定示意圖。進行EocRI/BamHI雙酶切鑒定，檢測到與預期大小相符的片段。I:DNA Marker (DL2000) 2:EocRI/BamHI 雙酶切結果(5900bp 和 648bp)圖4為一種擴增重組質粒pGEM-T-TAT-GH的構建過程示意圖。同時用EocRI/BamHI雙酶切質粒載體pGEM_T和TAT-GH，再用T4連接酶連接，得到新的重組質粒pGEM-T-TAT-GH。圖5為一種表達重組質粒pET-32a-TAT_GH的構建圖示意圖。用EocRI/BamHI雙酶切重組質粒pGEM-T-TAT-GH和表達質粒pET_32a，得到的片段TAT-GH與缺口質粒pET-32a連接，獲得新的表達重組質粒pET_32a-TAT_GH。圖6為一種重組蛋白GH和TAT-GH經IPTG誘導表達示意圖。將基因工程表達菌株Escherichiacoli BL21(DE3)pET-32a_tmGH和Escherichiacoli BL21 (DE3) pET-32a-TAT_tmGH，用終濃度 0. 6M 的 IPTG 于 37°C恒溫、300rpm 誘導表達5h。收集發酵液離心后的菌體沉淀，經超聲波破碎后，收集破碎上清和沉淀。用12%的SDS-PAGE電泳檢測，發現在沉淀中有與預期大小40kDa和41. 5kDa相符合的目的蛋白帶且大部分以包涵體形式存在，并且表達量較高。I :蛋白Marker ；2 :未誘導的pET32a (BL21)破碎液沉淀；3 :未誘導的pET32a_GH(BL21)破碎液沉淀；4 :未誘導的pET32a-TAT-GH (BL21)破碎液沉淀；5 :未誘導的pET32a (BL21)破碎液上清；6 :未誘導的pET32a_GH (BL21)破碎液上清；7 :未誘導的pET32a-TAT-GH (BL21)破碎液上清；8 :蛋白 Marker ;9: IPTG 誘導的 pET32a (BL21)破碎液上清;10:IPTG 誘導的 pET32a-GH (BL21)破碎液上清;11: IPTG 誘導的 pET32a_TAT_GH(BL21)破碎液上清；12: IPTG誘導的pET32a(BL21)破碎液沉淀；13: IPTG誘導的pET32a_GH(BL21)破碎液沉淀；14: IPTG誘導的pET32a-TAT-GH (BL21)破碎液沉淀。圖7為一種純化的GH和TAT-GH示意圖。發酵液離心得到的菌體，超聲破碎后用2M尿素洗滌并4°C裂解過夜，進行鎳柱純 化，用含有低濃度咪唑的Wash Buffer將鎳柱中的非目的蛋白洗掉。最后用含有高濃度咪唑的Elution Buffer將目的蛋白洗脫下來。4°C復性過夜，透析后，獲得有活性的TAT-GH和GH蛋白，進行SDS-PAGE電泳檢測。圖8為一種Western Blot鑒定不意圖。蛋白樣品經SDS-PAGE分離后，轉移到固相載體NC膜上，使蛋白樣品與NC膜結合。封閉NC膜上未與蛋白樣品結合的其他位點后，依次加入純化的兔抗GH血清(一抗)及HRP標記的羊抗兔IgG抗體(二抗)進行免疫反應，最后經DAB顯色，將表達的目的蛋白條帶顯出。圖9為一種羅非魚肝膜受體與TAT-GH結合活性示意圖。ELISA-RA結果表明了羅非魚肝膜受體和表達的重組生長激素TAT-GH可以發生特異性結合。當肝膜受體濃度一定時(200ug/ml)，隨著重組TAT-GH濃度的提高，光密度值會相應升高；將高溫失活TAT-GH和活性肝膜受體結合時，光密度值有顯著下降；將TAT-GH和肝膜受體同時失活，光密度值進一步降低。圖10為一種羅非魚腸膜受體與TAT-GH結合活性示意圖。羅非魚TAT-GH能夠與魚腸膜受體發生特異性結合。當腸膜受體濃度一定時(200ug/ml),隨著TAT-GH濃度的提高，光密度值會相應升高；將高溫失活的TAT-GH蛋白和活性腸膜受體結合時，光密度值有顯著下降；將TAT-GH蛋白和腸膜受體同時失活時，光密度值進一步降低。圖11為一種羅非魚血清的ELISA檢測示意圖。與GH組和PBS對照組相比，TAT-GH組的OD49tl值有顯著地的升高，即在血清中檢測到TAT-GH蛋白的存在。而GH蛋白由于不能穿過腸壁細胞而未能到達血清中，幾乎未在血清中檢測到。另外，在喂食蛋白6-12h之間，TAT-GH在血清中的含量有所升高，但在12h-24h開始下降，說明TAT-GH在口服12h后開始在腸內降解。
具體實施例方式實施例I :羅非魚TAT-GH生長激素基因的制備方法，其步驟是(I) Trizol法提取羅非魚的總RNA
將處死的羅非魚的腦垂體組織直接放入研體中，加入適量(體積約為垂體組織的3-5倍)液氮研磨。按50 100mg/mL加入Trizol，用勻漿器充分勻漿約1_2分鐘。室溫(20-25 0C，以下相同)放置5min，使其充分裂解。12000rpm離心lOmin，取上清。按200 y L氯仿/mL Trizol加入氯仿,振蕩5分鐘,室溫放置5min。4°C 12000g離心15min,吸取上層水相于另一離心管中，加入等倍體積異丙醇混勻，室溫放置20 30min。4°C 12000g離心lOmin，棄上清，RNA沉于管底。按加入ImL 75% (體積比，以下相同)乙醇洗滌兩次。4°C 5000g離心5min，盡量棄上清。室溫晾干2 3min，用50 y L經DEPC處理H2O溶解RNA樣品。提取的RNA溶解在無RNase的無菌水中，用DNase(RNase-Free)于37°C消化30min以除去DNA的污染。DNase消化完畢進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，如圖I。(2) cDNA第一鏈的合成按照ReverTra Ace qPCR RT Kit試劑盒(購自T0Y0B0公司)說明書，以
Oligo(ClT)20為引物合成cDNA第一鏈。反應體系如下，依次將以下試劑加入經DEPC水處理并滅菌過的PCR管中
Total20|il
5xRT Buffer4 ill
En/ymc MixI \xl
01igo(dT)2o PrimerI \xl
Total RNA8 \xl
NucIcasc-frcc H2O6 |il反應參數為
(5min
37 °C15 min
95 °C5 min(3) GH基因的擴增將反應后的產物儲存于-20°C以作為目的基因克隆的模板。查詢GeneBank中已經錄入的莫桑比克羅非魚生長激素GH的核酸序列(GenBank:AF033805. 1)，同時設計GH的PCR上下游引物。由于本實驗選取pET_32a ( + )質粒(由Novagen公司購得，實驗室保種)作為載體，根據其上的多克隆位點及GH的基因序列，分別選取BamHl和EcoRl作為酶切位點。GH 的上游引物 Pl 5，-CGGGATCCATGAACTCAGTCGTCCTCCA-3，(劃線處為 BamH I 位點)，即為 SEQ ID NO. 3 ；GH 的下游引物 P2 5，-CGGAATTCCTACAGAGTGCAGTTTGCCTC-3，(劃線處為EcoR I位點)JPSSEQ id no. 4 ;以羅非魚gh基因為模板，按照以下反應體系和條件進行PCR擴增。
權利要求
1.一種分離重組的基因，其特征在于，其序列為SEQ ID N0:1所示。
2.一種分離重組的融合蛋白，其特征在于，其序列為SEQ ID N0:2所示。
3.—種表達權利要求2所述融合蛋白的大腸桿菌基因工程菌株，其特征在于大腸桿菌(Escherichia coli ) BL21 (DE3) pET-32a-TAT-tmGH, WompT hsdSB (rBmB) galdcm (DE3) ； CCTCC NO :M2012148。
4.權利要求2所述融合蛋白的制備方法，其步驟為 A.羅非魚生長激素基因的制備取已處死的新鮮雄性羅非魚腦垂體，液氮研磨，Trizol法提取GH的總mRNA后，以Oligo (dT)20為引物通過RT-PCR得到cDNA，同時設計GH的PCR上下游引物，擴增得到GH基因；最后克隆到pGEM-T載體中，轉化大腸桿菌JM109，用于基因的增殖和保藏；GH 的上游引物 Pl :5’ -CGGGATCCATGAACTCAGTCGTCCTCCA-3’ ；GH 的下游引物 P2 :5’ -CGGAAITCCTACAGAGTGCAGITTGCCTC-3’ ； B.TAT-GH融合基因的制備以GH基因為模板，采用PCR重疊延伸技術在GH序列的前端分步PCR依次加上長度為33個堿基的TAT序列，PCR擴增得到TAT-GH基因；最后克隆到pGEM-T載體中，轉化大腸桿菌JM109，用于基因的增殖和保藏； C.融合基因表達載體的構建雙酶切重組質粒pGEM-T-TAT-GH和質粒pET-32a，膠回收，T4連接酶進行連接，轉化疋co7iDH5a,涂布含有100 u g/mlAmp+的LB平板，挑取單菌落，進行菌落PCR鑒定和雙酶切鑒定，所得到的陽性克隆子是含TAT-GH融合基因的大腸桿菌； D.大腸桿菌基因工程菌的制備將質粒pET-32a-TAT-GH轉化到表達菌株BL21(DE3)中，PCR鑒定篩選出陽性轉化子，所得陽性克隆即為本發明涉及的能夠表達TAT-GH的大腸桿菌基因工程菌株； E.基因工程融合蛋白的制備將步驟D中獲得的基因工程菌轉接到2X YT培養基中，經IPTG誘導，融合蛋白TAT-GH以包涵體的形式高效表達。
5.權利要求2所述的TAT-GH融合蛋白在羅非魚促生長中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種羅非魚重組口服蛋白TAT-GH及制備方法和應用。從雄性羅非魚的腦垂體中提取總mRNA，通過RT-PCR得到cDNA，再通過PCR擴增獲得羅非魚生長激素GH的基因，PCR重疊延伸的方法擴增TAT-GH基因；構建重組質粒pET-32a(+)-TAT-GH。將重組質粒pET-32a(+)-TAT-GH轉化大腸桿菌BL21(DE3)，在IPTG誘導下，融合蛋白TAT-GH以包涵體的形式得到高效表達，再通過純化復性得到活性蛋白，喂食羅非魚幼苗后能有效地促進其生長發育。
文檔編號C12N1/21GK102703483SQ20121018910
公開日2012年10月3日 申請日期2012年6月8日 優先權日2012年6月8日
發明者孟小林, 徐進平, 曾輝, 王健 申請人:武漢凱肽來生物科技有限公司