專利名稱：一種提取梨果實蔗糖合酶和蔗糖磷酸合成酶及其活性測定方法
技術領域：
本發明屬于植物生理學領域，涉及一種提取梨果實蔗糖合酶和蔗糖磷酸合成酶及其活性測定方法。
背景技術：
梨果實中的可溶性糖是直接影響果實品質的關鍵因素，在果實品質風味的形成中有著重要的作用，因而成為衡量果實品質優劣的重要標準之一。梨果實中糖分主要有蔗糖，葡萄糖，果糖，山梨醇等。果實中糖分的積累跟果實中糖代謝酶有著密切的關系，尤其是蔗糖代謝酶中的蔗糖合酶和蔗糖磷酸合成酶。在蔗糖積累的庫組織中，蔗糖磷酸合成酶對蔗 糖的積累有著重要的作用，梨、桃、橙、甜瓜、香蕉等果實中蔗糖磷酸合成酶活性的上升有利于蔗糖的積累；而蔗糖合酶催化蔗糖形成果糖的反應是可逆的，分解方向形成的果糖為果實的形態建構提供物質基礎，同時也是呼吸作用的能量來源，蔗糖合酶合成方向的活性能夠通過保持蔗糖的濃度，進一步影響果實中糖分的積累。因此，準確測定蔗糖合酶和蔗糖磷酸合成酶的活性對于準確了解糖分的積累特征有著重要作用，同時有利于了解糖風味形成的生理機制。目前，國內外有測定梨果實中蔗糖合酶和蔗糖磷酸合成酶活性的方法報道，但是，由于處理方法的不科學性，應用范圍的局限性，造成轉化酶活性的測定不準確或低效，按照已經發表的方法步驟甚至無法測定出相應酶的活性。
發明內容
本發明的目的是針對現有技術的上述不足，提供一種提取梨果實蔗糖合酶和蔗糖磷酸合成酶的方法。本發明的另一目的是提供一種梨果實蔗糖合酶和蔗糖磷酸合成酶活性的測定方法。本發明的目的可通過如下技術方案實現—種提取梨果實中蔗糖合酶(SS)和蔗糖磷酸合成酶(SPS)的方法，其特征在于準確稱取梨果肉，放入預冷的研缽中，冰浴下研磨，加入提取緩沖液，充分勻漿后，0 4°C條件下180000 20000g離心30 40min，取上清液，逐漸加入硫酸銨至80%的飽和度，靜置20 30min后，0 4°C條件下180000 20000g離心20 30min，去除上清液，加入脫鹽緩沖液重新溶解沉淀，再用D27mm透析袋透析脫鹽得蔗糖合酶和蔗糖磷酸合成酶混合酶液，所述的提取緩沖液配方為200mmol L 1Hepes-NaOH, 5mmol L 1MgCl2, 0. 1%3 -巰基乙醇(體積百分比，下同)，0. 05%Triton-X 100, 0. 05%BSA (質量體積百分比，g/100ml,下同)，2%PVPP (質量百分比，下同)，lmmol .L 1EDTA, lmmol .L 1EGTA, 10mmol .L 1 抗壞血酸鈉,IOmM半胱氨酸-鹽酸，2%甘油(體積百分比，下同)，pH 7. 5;提取緩沖液與梨果肉的體積質量比是 3 IOml lg ;所述的脫鹽緩沖液的配方為 20mmol .L 1Hepes-NaOH,0. 25mmol .L 1MgCl2,Immol L^1EDTA, lmmol L^1EGTA, 0. 01% 3 -巰基乙醇，0. 05%BSA，0. 2% 甘油，pH 7. 5 ;脫鹽緩沖液與梨果肉的體積質量比是I 5ml lg ;所述的透析使用的透析液為稀釋10倍的不含PVPP的提取緩沖液。所述的梨果實中蔗糖轉化酶的整個提取過程在0 4°C的條件下進行。所述的提取緩沖液與梨果肉的體積質量比優選5ml :lg。所述的脫鹽緩沖液與梨果肉的體積質量比優選3ml :lg。
所述的透析時間優選6 10小時,進一步優選8小時。一種測定梨果實中蔗糖合酶和蔗糖磷酸合成酶活性的方法，包括如下步驟(I)按照上述的方法提取梨果實中蔗糖合酶和蔗糖磷酸合成酶；(2)蔗糖合酶(分解方向)活性的測定在490 ii L的反應液中加入490 ii L的脫鹽后的蔗糖合酶和蔗糖磷酸合成酶混合酶液，30°C反應30min后，加入490 u L的DNS，準確沸水浴5min,冷卻后至室溫,在波長540nm下測定OD540值,對照為不含底物的反應液；通過制定果糖標準曲線即可計算相應酶的活性；所述的反應液配方為SOmmol L-1Mes緩沖液，5mmoI L 1NaF, IOOmmol L 1 鹿糖，SmmoI L 1UDP, pH 5. 5。一種測定梨果實中蔗糖合酶和蔗糖磷酸合成酶活性的方法，包括如下步驟(I)按照上述的方法提取梨果實中蔗糖合酶和蔗糖磷酸合成酶；(2)蔗糖酸性轉化酶活性的測定在50ii L的反應液中加入50ii L的脫鹽后的蔗糖合酶和蔗糖磷酸合成酶混合酶液，34°C反應Ih后加入0. 2mL的30%K0H，準確沸水浴IOmin終止反應,冷卻至室溫,加入3mL蒽酮(0. 15g的蒽酮溶于100mL81%硫酸中),40°C溫浴20min，冷卻至室溫后，在波長620nm下測定OD62tl值。對照為不含底物的反應液；再通過制定蔗糖標準曲線即可計算相應酶的活性；所述的反應液配方為0. Immol L—1磷酸緩沖液4mmol L 1UDP-葡萄糖，0. 06mmol L 1 果糖，15mmol L 1MgCl2, pH 8. O。一種測定梨果實中蔗糖合酶和蔗糖磷酸合成酶活性的方法，包括如下步驟(I)按照上述的方法提取梨果實中蔗糖合酶和蔗糖磷酸合成酶；(2)蔗糖磷酸合成酶活性的測定在50 ii L的反應液中加入50 ii L脫鹽后的蔗糖合酶和蔗糖磷酸合成酶混合酶液，34°C反應Ih后加入0. 2mL的30%K0H，準確沸水浴IOmin終止反應,冷卻至室溫,加入3mL蒽酮(0. 15g的蒽酮溶于100mL81%硫酸中),40°C溫浴30min，冷卻至室溫后，在波長620nm下測定OD62tl值。對照為不含底物的反應液；再通過制定蔗糖標準曲線即可計算相應酶的活性；所述的反應液配方為0. Imol L—1硼酸緩沖液，IOmmol L^1UDP-葡萄糖，5mmol L—1 果糖-6-磷酸,15mmol L—1 葡萄糖-6-磷酸，15mmol L 1MgCl2, mmol L 1EDTA 蔗糖合酶(分解方向)活性測定原理根據蔗糖合酶(分解方向)能夠將果實中的蔗糖轉化成尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)和果糖的特性，通過測定其果糖轉化量的多少可反應酶活性的高低。酶提取液能夠將反應液中的蔗糖轉化成尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)和果糖，再與DNS顯色反應，通過分光光度計測定的OD54tl值，即可反映轉化糖的含量。OD值越高，表示轉化量越高，酶的活性就越高，反之，酶的活性越低。每次測酶之前，必須制定相應的標準曲線，根據標準曲線回歸方程，將OD值代入公式可以算出轉化成的果糖含量，從而反應酶活性的高低。當OD值為負值時，不能用于計算相應酶的活性。蔗糖合酶(合成方向)活性測定原理根據蔗糖合酶(合成方向)能夠將果糖和尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)轉化成蔗糖的特性，通過測定其蔗糖轉化量的多少可反應酶活性的高低。酶提取液能夠將反應液中的尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)和果糖轉化成蔗糖，再與蒽酮顯色反應，通過分光光度計測定的OD62tl值，即可反映轉化糖的含量。OD值越高，表示轉化量越高，酶的活性就越高，反之，酶的活性越低。每次測酶之前，必須制定相應的標準曲線，根據標準曲線回歸方程，將OD值代入公式可以算出轉化成的蔗糖含量，從而反應酶活性的高低。當OD值為負值時，不能用于計算相應酶的活性。蔗糖磷酸合成酶活性測定原理根據蔗糖磷酸合成酶能夠將UDPG和6磷酸果糖形成蔗糖磷酸，并進一步形成蔗糖和磷酸。通過測定其蔗糖轉化量的多少可以反應酶活性的高低。酶提取液能夠將反應液中UDPG和6-磷酸果糖轉化成蔗糖，再與蒽酮顯色反應，通過分光光度計測定的OD62tl值，即可反映轉化糖的含量。OD值越高，表示轉化量越高，酶的活性就越高，反之，酶的活性越低。每次測酶之前，必須制定相應的標準曲線，根據標準曲線回歸方程，將OD值代入公式可以算出轉化成的蔗糖含量，從而反應酶活性的高低。當OD值為負 值時，不能用于計算相應酶的活性。有益效果本發明針對現有技術測定梨果實中轉化酶活性是因處理方法不當造成轉化酶活性的測定不準確或低效的問題，提供了一種有效的梨果實中蔗糖轉化酶提取方法，在初提取酶液中逐漸加入硫酸銨至80%的飽和度，能夠有效地將酶蛋白充分的鹽析出來，減少初提取液中所含的糖分對測定結果的影響；再對初酶液進行充分地透析，能夠有效地將酶液中的離子等小分子物質過濾掉，從而較少對酶活性的影響，有利于酶活性測定結果的準確性。以此梨果實中蔗糖轉化酶為基礎，能夠更加準確、有效地測定轉化酶的活性，對深入糖風味形成的生理機制，改善果實品質有著重要的意義。
具體實施例方式實施例I(一)實驗方法I、供試材料為鴨梨(Pyrus bretschneideri Rehd ‘yali’)。2、樣品采集采取鴨梨花后105天時的果實，采樣時按照樹冠的上，東，南，西，北的5個方向隨機選取無病害的果實5個，置于冰盒中，帶回實驗室處理。3、樣品的處理將采集的果實清洗干凈，去皮去核，將果肉混勻后四分法取樣，在液氮中速凍后，置于_70°C冰箱中，用于蔗糖合酶和蔗糖磷酸合成酶活性的測定。4、蔗糖合酶和蔗糖合成酶酶的提取酶液的提取均在0 4°C的條件下進行。準確稱取梨果肉lg，放入預冷的研缽中，冰浴下研磨，加入 5mL 提取緩沖液(200mmol L^1Hepes-NaOH, Smmol L^1MgCl2, 0. 1%^ -疏基乙醇，0. 05%Triton-X 100，0. 05%BSA, 2%PVPP, lmmol L^1EDTA, lmmol L^1EGTA, IOmmol I71抗壞血酸鈉，IOmM半胱氨酸-鹽酸，2%甘油，pH 7. 5)，充分勻漿，4°C條件下20000g離心30min，取上清液，逐漸加入硫酸銨至80%的飽和度，靜置30min后，4°C條件下20000g離心20min,去除上清液，加入 3mL 脫鹽緩沖液(20mmol L^1Hepes-NaOH,0. 2Smmol L-1MgCl2,lmmol L^1EDTA, lmmol L^1EGTA, 0. 01%^-巰基乙醇，0. 05%BSA，0. 2% 甘油，pH 7. 5)重新溶解沉淀，再用D27mm透析袋脫鹽，透析液為稀釋10倍的提取液(不含PVPP)，脫鹽后的酶液用于酶活性分析。5、轉化酶的測定a)鹿糖合酶(分解方向)活性的測定在490 U L的反應液(80mmol L^1Mes緩沖液，5mmol L-1NaF, IOOmmol I71 鹿糖，5mmol L-1UDP, pH 5. 5)中加入 490 u L 的脫鹽后的酶液，30°C反應30min后，加入490 y L的DNS，準確沸水浴5min，冷卻后測定OD54tl值，對照為不含底物的反應液。b)鹿糖合酶(合成方向)活性的測定在50li L的反應液(0. Immol L-1磷酸緩沖液 4mmol L 1UDP-葡萄糖，0. 06mmol L 1 果糖，15mmol L 1MgCl2, pH 8. 0)中加入 50 u L 的脫鹽后的酶液，34°C反應Ih后加入0. 2mL的30%K0H，準確沸水浴IOmin終止反應，冷卻，冷卻至室溫，加入3mL蒽酮(0. 15g的蒽酮溶于100mL81%硫酸中),40°C溫浴20min,冷卻至室溫后測定OD62tl值。對照為不含底物的反應液。c)蔗糖磷酸合成酶(SPS)活性的測定在50ii L的反應液(0. Imol L-1硼酸緩沖液，IOmmol L^1UDP-葡萄糖，5mmol L—1 果糖-6-磷酸,15mmol L—1 葡萄糖-6-磷酸，15mmol L-1MgCl2, lmmol L^1EDTA)中加入 50 y L 脫鹽后的酶液,34°C 反應 Ih 后加入 0. 2mL的30%K0H，準確沸水浴IOmin終止反應，冷卻至室溫，加入3mL蒽酮(0. 15g的蒽酮溶于100mL81%硫酸中)，40°C溫浴30min，冷卻至室溫后測定OD62tl值。對照為不含底物的反應液。(二)結果分析表I中經過鹽析和透析方法提取的SS (分解方向)、SS (合成方向)和SPS酶液測定的OD值，分別0. 023,0. 274和0. 155，說明在經過鹽析和透析的情況下，酶液得到純化，酶活性比較高，測定結果較好。表I中不經過鹽析的酶液SS(分解方向)、SS(合成方向)和SPS酶活性的OD值，分別是-0. 008,0. 008和-0. 114，由于測定樣品為花后105天的果實，SPS和SS (合成方向)的活性是比較高的，能夠形成較多的蔗糖，測定結果不應該出現負值或者是OD較低，這說明在粗提取的酶液沒有經過鹽析時，果實中本身所含有的糖在測定時與蒽酮發生了反應，導致結果OD值較低和負值。表I中不經過透析的酶液SS (分解方向)、SS (合成方向)和SPS酶活性的OD值，分別為0.014，-0.024，-0. 009, SPS和SS (合成方向)酶活性的OD值是負值，說明在沒有經過透析的情況下，果實中所含有的一些小分子物質，離子等對OD值的測定也有很大的影響，而SS (分解方向)酶活性的OD值只有0. 014，對照和實驗組之間的顏色差異幾乎相同，這可能是由于分光光度計在比色時所形成的誤差。表I SS和SPS粗酶液經過不同處理后測定的OD值
權利要求
1.一種提取梨果實中蔗糖合酶和蔗糖磷酸合成酶的方法，其特征在于稱取梨果肉，放入預冷的研缽中，冰浴下研磨，加入提取緩沖液，充分勻漿后，O 4°C條件下180000 20000g離心30 40min，取上清液，逐漸加入硫酸銨至80%的飽和度，靜置20 30min后，0 4°C條件下180000 20000g離心20 30min，去除上清液，加入脫鹽緩沖液重新溶解沉淀，再用D27mm透析袋透析脫鹽得蔗糖合酶和蔗糖磷酸合成酶混合酶液，所述的提取緩沖液配方為 200mmol L 1Hepes-NaOH, 5mmol L 1MgCl2,0. 1% ^ -疏基乙醇，0. 05% Triton-X100，0. 05% BSA, 2% PVPP, Immol L-1EDTA, Immol L-1EGTA, IOmmol L-1 抗壞血酸鈉，IOmM半胱氨酸-鹽酸，2%甘油，pH 7. 5 ;提取緩沖液與梨果肉的體積質量比是3 IOml :lg ;所述的脫鹽緩沖液的配方為 20mmol L 1Hepes-NaOH,0. 2Smmol L 1MgCI2- 1mmo1 L 1EDTA,lmmol L-1EGTAJ. 01% @ -巰基乙醇，0. 05% BSA，0. 2%甘油，pH 7. 5 ;脫鹽緩沖液與梨果肉的體積質量比是I 5ml lg ;所述的透析使用的透析液為稀釋10倍的不含PVPP的提取緩沖液。
2.根據權利要求I所述的提取梨果實中蔗糖合酶和蔗糖磷酸合成酶的方法，其特征在于所述的梨果實中蔗糖合酶和蔗糖磷酸合成酶的整個提取過程在0 4°C的條件下進行。
3.根據權利要求I所述的提取梨果實中蔗糖合酶和蔗糖磷酸合成酶的方法，其特征在于所述的提取緩沖液與梨果肉的體積質量比是5ml :lg。
4.根據權利要求I所述的提取梨果實中蔗糖合酶和蔗糖磷酸合成酶的方法，其特征在于所述的脫鹽緩沖液與梨果肉的體積質量比是3ml :lg。
5.根據權利要求I所述的提取梨果實中蔗糖合酶和蔗糖磷酸合成酶的方法，其特征在于所述的透析時間為6 10小時,優選8小時。
6.一種測定梨果實中分解方向的蔗糖合酶活性的方法，其特征在于包括如下步驟 (1)按照權利要求I所述的方法提取梨果實中蔗糖合酶和蔗糖磷酸合成酶； (2)分解方向蔗糖合酶活性的測定在490u L的反應液中加入490 u L權利要求I提取的脫鹽后的蔗糖合酶和蔗糖磷酸合成酶混合酶液，30°C反應30min后，加入490 u L的DNS,沸水浴5min，冷卻后測定OD54tl值，對照為不含底物的反應液；通過制定果糖標準曲線即可計算相應酶的活性；所述的反應液配方為80mmol L4Mes緩沖液，5mmol L4NaF,IOOmmol L 1 鹿糖，SmmoI L 1UDP, pH 5. 5。
7.一種測定梨果實中合成方向蔗糖合酶活性的方法，其特征在于包括如下步驟 (1)按照權利要求I所述的方法提取梨果實中蔗糖合酶和蔗糖磷酸合成酶； (2)合成方向蔗糖合酶活性的測定在50ii L的反應液中加入50 y L權利要求I提取的脫鹽后的蔗糖合酶和蔗糖磷酸合成酶混合酶液，34°C反應Ih后加入0. 2mL的30% K0H，沸水浴IOmin終止反應，冷卻至室溫，加入3mL蒽酮溶液，40°C溫浴20min，冷卻至室溫后測定OD62tl值。對照為不含底物的反應液；再通過制定蔗糖標準曲線即可計算相應酶的活性；所述的反應液配方為0. Immol L—1磷酸緩沖液4mmol L-1UDP-葡萄糖,0. 06mmol L—1果糖，15mmol L^1MgCl2, pH 8. 0 ;所述的蒽酮溶液為0. 15g的蒽酮溶于100mL81 %硫酸中制得。
8.一種測定梨果實中蔗糖磷酸合成酶活性的方法，其特征在于包括如下步驟 (1)按照權利要求I所述的方法提取梨果實中蔗糖合酶和蔗糖磷酸合成酶； (2)蔗糖磷酸合成酶活性測定在50ii L的反應液中加入50 ii L脫鹽后的酶液，340C反應Ih后加入0. 2mL的30% K0H,準確沸水浴IOmin終止反應，冷卻至室溫，加入3mL蒽酮溶液，40°C溫浴30min，冷卻至室溫后測定OD62tl值。對照為不含底物的反應液；再通過制定蔗糖標準曲線即可計算相應酶的活性；所述的反應液配方為0. Imol L—1硼酸緩沖液，IOmmol L^1UDP-葡萄糖，5mmol L—1 果糖-6-磷酸,15mmol L—1 葡萄糖-6-磷酸，15mmol L^1MgCl2, ImMEDTA ;所述的蒽酮溶液為0. 15g的蒽酮溶于 100mL81 %硫酸中制得。
全文摘要
本發明屬于植物生理學領域，公開了一種提取梨果實蔗糖合酶和蔗糖磷酸合成酶及其活性測定方法。本發明通過在蔗糖合酶和蔗糖磷酸合成酶提取過程中增加鹽析和透析步驟，常能夠將初提取酶液中的糖分和離子等小分子物質除去，從而更能夠精確地測定果實中果實蔗糖合酶和蔗糖磷酸合成酶的活性，為揭示果實內糖分的積累差異提供生理基礎，進一步為果實甜度風味品質的改良提供理論依據。
文檔編號C12N9/10GK102747055SQ20121020458
公開日2012年10月24日 申請日期2012年6月19日 優先權日2012年6月19日
發明者吳俊 , 吳巨友, 張紹鈴, 楊志軍, 陶書田, 齊開杰 申請人:南京農業大學