一種調節蔗糖合成的水稻基因及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于分子生物學領域，特別涉及一種調節蔗糖合成的水稻基因Os-ER-ANTl 及其編碼的蛋白與應用。
【背景技術】
[0002] 水稻是我國的重要糧食作物，中國水稻播種面占全國糧食作物的1/4,水稻的有效 穗、結實率、千粒重和籽粒充實度是構成產量的重要因素，這些因素與糖代謝有著一定的關 系。
[0003] 蔗糖是光合作用的主要終產物之一，是多數植物體內長距離運輸碳水化合物的主 要形式，它不僅為庫器官進行的各項生理活動提供能量，同時也是某些植物如甘蔗、甜菜、 胡蘿卜等貯藏的主要化合物。
[0004]植物中與蔗糖代謝有關的酶有三類，分別是轉化酶或G-呋喃果糖苷酶（Inv)、蔗 糖磷酸合成酶（SPS)、蔗糖合成酶（SUSy)，其中蔗糖合成酶是催化蔗糖代謝的關鍵酶之一。 除此之外，尋找調節蔗糖合成相關基因，將為作物改良提供新的選擇。
[0005] 三磷酸腺苷（ATP)是生物體內主要的能源載體。ATP/ADP轉運蛋白是真核生物的 一種腺苷酸轉運載體，是質體ATP濃度的主要調節者。發明人通過對編碼水稻ATP/ADP轉 運蛋白的編碼基因Os-ER-ANTl基因的研究，發現該基因能夠調節植物的蔗糖合成，該基因 與光合作用密切相關。
【發明內容】
[0006] 為研究植物蔗糖合成的機理以及光合作用的機理，本發明目的是同一種調節蔗糖 合成的基因Os-ER-ANTl及其編碼蛋白與應用。
[0007] 本發明提供了 Os-ER-ANTl基因在調節植物蔗糖合成中的應用，所述Os-ER-ANTl 基因的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示，氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。Os-ER-ANTl基 因為編碼ATP/ADP轉運蛋白的水稻基因。
[0008] 優選地，所述的植物為水稻。
[0009] 本發明提供了 Os-ER-ANTl基因在植物育種中的應用。
[0010] 本發明還提供了 Os-ER-ANTl基因在培育轉基因植物中的應用。
[0011] 本發明還提供用于擴增Os-ER-ANTl編碼區基因的引物對。
[0012] 其中，該引物對其中的每一個引物的長度為15到25個堿基，例如：
[0013]上游引物：5' -GGATCCAAATCCGCCGTCGACGATGCCA-3'（如 SEQ ID No. 3 所示的核苷 酸序列）
[0014] 下游引物：
[0015] 5,-ACTAGirCATCTAGAITTCAATGCCCCTTTCATCTTG-3，（如 SEQ ID No. 4 所示的核苷 酸序列）
[0016] 本發明的有益效果在于：本發明的Os-ER-ANTl基因缺失，表現為水稻Os-ER-ANTl 基因失活，直接引起蔗糖合成受阻，造成突變體3葉期后迅速死亡，通過本發明的實驗，證 實了 Os-ER-ANTl是具有重要功能的看家基因，能夠調節植物體內蔗糖合成，對植物體內蔗 糖代謝具有重要的正向調節作用，為培育植物新品種提供了基因資源。
【附圖說明】
[0017] 圖1為實施例1中Os-ER-ANTl突變體表型，圖中分別為12天，15天以及25天時 的水稻Os-ER-ANTl突變體表型，其中WT為中花11。
[0018] 圖2為實施例2中Os-ER-ANTl突變體Ds插入突變位點，其中A圖為er-antl突 變體在基因組上的插入位點；B圖為ER-ANT1基因的結構示意圖。
[0019] 圖3為實施例3中RNAi株系的表型照片。A圖為野生型和RNAi轉基因植株的表 型，B圖為野生型和RNAi轉基因株系中Os-ER-ANTl基因表達。
[0020] 圖4為實施例4中回復突變體的表型照片。A圖為缺失突變體以及回復突變測序 結果，B圖為回復突變的表型，C圖為回復突變體中OsER-ANTl基因的表達豐度。
[0021] 圖5為實施例5中WT和突變體中在播種第10天、13天以及16天不同時間點可溶 性糖含量分析。圖5A為果糖的變化曲線，圖5B為葡萄糖的變化曲線，圖5C為蔗糖的變化 曲線。
[0022] 圖6為實施例6中突變體在無蔗糖和有蔗糖的條件下的表型。
【具體實施方式】
[0023] 以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。在不背離本發明精神 和實質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發明的保護范 圍。
[0024] 實施例中pCUbil390載體為常用的載體，pEasy-Tl可市購；水稻品種為粳稻中花 11 ;農桿菌GV3101和EHA105菌株常用的菌株，多數分子生物學實驗室均有保存。
[0025] 實施例中的主要試劑為：限制性內切酶、Taq酶、T4連接酶、Pyrobest Taq酶、K0D、 RNase A、M_MLV反轉錄酶等購自于TAKARA(大連）、？1'〇1116〖3、呢13、1'〇7〇13〇等生物公司；(11'01:>8 購自于Genestar公司；質粒小提試劑盒和瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自于上海捷瑞生物工 程公司；TRLzol RNA提取試劑盒購自于Invitrogen公司；MS培養基，瓊脂粉，瓊脂糖，氨 芐青霉素（Amp)、卡那霉素（Kan)、硫酸慶大霉素（Gen)、利福平（Rif)等抗生素以及DEPC、 Galactose、Glucose、BSA、尼龍膜、硝酸纖維素膜、LBMedium等購自Sigma，硝酸纖維素膜購 自Amersham、Bio-Rad等公司；實施例中所使用的其它化學試劑均為進口或國產分析純。
[0026] 實施例中所使用的引物由Invitrogen公司合成，并進行測序。
[0027] 實施例lOs-ER-ANTl突變體表型分析
[0028]WT和0s-er-antl突變體植株在稻田中生長，12天，15天以及25天時，取材，洗凈， 拍照。突變表型見圖1。er-antl突變體2葉期前葉色與野生型無明顯差異（圖1中12天 圖），三葉期后突變體變為淡綠色（圖1中15天圖），并迅速焦枯（圖1中25天圖）。
[0029] 實施例20S-ER-ANT1突變位點分析
[0030] 提取突變體葉片中的基因組DNA，利用TAIL-PCR的方法擴增Ds插入突變的5'和 3'末端，Ds插入位點位于11號染色體上的編碼OsER-ANTl的基因上，詳見圖2。
[0031]采用TAIL-PCR的方法Liu等（1995)【LiuYG，Mitsukawa N，0osumi T et al. Efficient isolation and mapping of Arab i dop s i s thaliana T-DNA insert junctions by thermal asymmetric interlaced PCR.Plant Journal,1995, 8 (3) : 457-463】來擴增Ds插入子兩側的序列，具體操作如下：
[0032] 左右邊界的特異引物設計采用Primer Premier5。反應條件參照Liu等（1995)的 方法進行(表1 )，反應所用引物見表2,特異擴增得到的第三輪PCR產物用來測序。
[0033] 突變體的Ds3'端TAIL-PCR擴增。Ds插入位點的旁側序列擴增采用TAIL-PCR，3 輪特異引物依次為Ds3< -la、Ds3< -2a、Ds3< -3a，隨機引物用AD3。第3輪PCR產物電 泳檢測后送公司測序，測序所用的引物為TAIL-PCR第3輪引物。
[0034] 突變體的Ds5 '端TAIL-PCR擴增。Ds插入位點的旁側序列擴增采用TAIL-PCR， 擴增的條件見表1，3輪特異引物依次為Ds5' -la、Ds5' -2a、Ds5' -3a，隨機引物用AD1。 第3輪PCR產物電泳檢測后送公司測序，測序所用的引物為Ds5' -3a。
[0035] 表1TAIL-PCR循環條件
[0036]
【主權項】
1. Os-ER-ANTl基因在調節植物蔗糖合成中的應用，其特征在于，所述Os-ER-ANTl基因 核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示，其編碼的氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。
2. 如權利要求1所述的應用，其特征在于，所述的植物為水稻。 3. Os-ER-ANTl基因在植物育種中的應用，所述Os-ER-ANTl基因核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。 4. Os-ER-ANTl基因在培育轉基因植物中的應用，所述Os-ER-ANTl基因核苷酸序列如 SEQ ID No. 1 所示。
5. 用于擴增Os-ER-ANTl基因的特異性引物，其特征在于，核苷酸序列為：上游引物：5' -GGATCCAAATCCGCCGTCGACGATGCCA-3' ；下游引物：5' -ACTAGTTCATCTAGATTTCAATGCCCCTTTCA TCTTG-3，。
【專利摘要】本發明提供一種調節蔗糖合成的水稻基因Os-ER-ANT1，該基因缺失導致水稻Os-ER-ANT1基因失活，引起蔗糖合成受阻，造成突變體3葉期后迅速死亡，表明Os-ER-ANT1是具有重要功能的看家基因，對水稻蔗糖代謝具有重要的正向調節作用。本發明不僅為研究水稻蔗糖合成的機制奠定基礎，而且為研究Os-ER-ANT1蛋白的生物學功能及應用水稻Os-ER-ANT1基因改良作物品種提供了基礎。
【IPC分類】A01H5-00, C07K14-415, C12N15-82, C12N15-11, C12N15-29
【公開號】CN104673804
【申請號】CN201310629419
【發明人】張向前, 楊建平, 宋梅芳, 郭林, 鄭旭, 蘇亮
【申請人】華南農業大學, 中國農業科學院作物科學研究所
【公開日】2015年6月3日
【申請日】2013年11月29日