一種基于納米孔器件對生物分子探針標定dna的特異位點進行檢測的方法

一種基于納米孔器件對生物分子探針標定dna的特異位點進行檢測的方法
【專利摘要】本發明公開了一種基于納米孔器件對生物分子探針標定DNA的特異位點進行檢測的方法及其應用。該方法包括下述步驟：1）用生物分子探針對DNA的特異位點進行標定，得到標定的DNA；2）利用納米孔測序裝置對標定DNA的特異位點進行檢測；將標定DNA加入到盛有電解液的正極腔室中，檢測時，向正極腔室引入壓強外場，作為DNA穿孔的驅動外場；并在正極和負極間施加電壓，作為與壓強外場反向的電場外場；測定過程中DNA在納米孔中受到的壓強外場的作用力大于電場力。采用上述方法可以得到了與普通未修飾的DNA截然不同的二級電流信號，通過對二級電流信號的分析和統計，表征出DNA上被修飾過的特異性位點的空間位置和順序，從而得到該長鏈DNA的物理圖譜。
【專利說明】一種基于納米孔器件對生物分子探針標定DNA的特異位點進行檢測的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種基于納米孔器件對生物分子探針標定DNA的特異位點進行檢測的方法。
【背景技術】
[0002]基于固態納米孔器件的DNA單分子探測分析被認為是最有希望實現第三代快速低成本人類基因測序(在24小時內花費1000美元以下實現單個人的基因組測序)的技術路線之一，成為目前研究和應用探索的熱點，除哈佛大學、波士頓大學、布朗大學、加州理工學院、荷蘭代爾夫特工業大學等研究小組外，IBM公司也在2009年10月宣布加入下一代人類基因組測序-1000美元計劃，以基于納米孔器件的測序技術為實現方法，使納米孔的研究由基礎研究開始走向應用(D.Branton, et al.Nature Biotechnology26 (10)，1146 (2008) ;M.Zwolak and M.Di Ventra, Reviews of Modern Physics80(1)，141(2008).)。通過在溶液中電泳驅動分子穿過一個納米尺度的孔可以實現基于納米孔器件的單分子探測和分析能力。在納米孔的有限空間里可以通過各種手段對大量分子進行快速的分析，當高聚物分子穿過納米孔時，高聚物分子的結構信息和探測的信號特征有一一對應關系。利用該特性可以直接對數千堿基對長度的單鏈DNA分子進行表征，避免了擴增或標記實驗準備環節，使得快速低成本DNA測序技術成為可能。目前阻礙這一技術長足發展的最大困難在于在電場驅動電壓下，DNA穿孔速度過快，超出了通用儀器的分辨率，從而無法實現對單堿基的差別進行識別。
[0003]目前國際上較為常用的實驗技術是在納米孔兩端加一個電壓，通過電場驅動，使DNA分子從孔一端電泳通過納米 孔，在外電路收集的離子電流會出現一個突然下降，電流的突然下降值和阻滯時間，可以對應DNA的生物學信息。但是單純使用電場調節，DNA的穿孔速度太快，基本在一個堿基一微秒的量級，而目前儀器的最小分辨率為4微秒，也就是說，如果想要區別不同堿基之間的差別，通過現有手段，時間分辨率是無法達到的。要提高時間分辨率，就必須使DNA分子的穿孔時間延長，有效減慢DNA在孔中的運動速度。減慢DNA的穿孔速度，才有可能實現對不同堿基的分辨。
[0004]另一方面，現有的第二代高通量測序技術的基本原理是將待測物種的全基因組隨機打碎成數百bp的小片段，然后經過體外擴增和修飾標定之后，利用一種“邊合成邊測序”的方法讀取每一個小片段的序列，最后將全部小片段的序列通過一定的算法整合在一起，還原出全基因組的序列。需要指出的是，每個數百bp的小片段相對于人類的全基因組(約3X109bp)來說實在太小，因此在小片段的比對和拼接環節的計算量和算法復雜度是極高的，而且由于人類基因組中存在大量的重復序列，導致現有算法得出的全基因組仍然有5%到10%的不確定度；因此對于精確度要求很高的醫療診斷、藥物篩選以及高端科研領域，需要對整個序列進行十幾甚至上百次的重復測序，無疑大大增加了測序的成本且降低了時間效率。
【發明內容】

[0005]本發明的一個目的是提供一種基于納米孔器件對生物分子探針標定DNA的特異位點進行檢測的方法。
[0006]本發明所提供的基于納米孔器件對生物分子探針標定DNA的特異位點進行檢測的方法，包括下述步驟:1)用生物分子探針對DNA的特異位點進行標定，得到標定的DNA ；
[0007]2)利用納米孔測序裝置對所述標定的DNA的特異位點進行檢測，所述納米孔測序裝置包括:設有正極和負極的電解池、以及分隔所述電解池正極和負極的固態納米孔薄膜；將所述標定的DNA加入到盛有電解液的所述電解池的正極腔室中，檢測時，向所述正極腔室引入壓強外場，作為DNA穿孔的驅動外場；并在正極和負極間施加電壓，作為與壓強外場反向的電場外場；測定過程中所述標定的DNA在納米孔中受到的壓強外場的作用力大于電場力。
[0008]所引入壓強外場產生的壓強可為1.6-2.6個標準大氣壓，所施加電壓的大小可為40_160mv。
[0009]測定時，在具體采用的電解液及納米孔條件下，根據所要達到的穿孔速度(或穿孔時間)，在上述壓強和電壓范圍內進行調節，經過有限次試驗可確定使DNA穿孔速度降低所施加的最佳壓強和電壓。
[0010]測定時，電解液的濃度可為0.1-3.2mol/L,pH值為8-10。所述電解液可為納米孔測序法中所采用的電解液。通常采用氯化鉀溶液作為DNA測序時的電解液，其余比如NaCl，LiCl都是可以的。
[0011]所述固態納米孔薄膜中納米孔的直徑可為10-20nm，孔深可為20_100nm。
[0012]上述方法中，可根據待標定`的DNA的特異位點人工合成合適的生物分子探針；根據特異位點的不同可選擇一種或多種構型或序列的生物分子探針同時進行標定。
[0013]本發明中所述生物分子探針具體可為“人工設計合成的肽核酸(peptide nucleicacids PNA) ”或“去除剪切功能區域的限制性內切酶作為生物大分子”。
[0014]所述人工合成的肽核酸生物分子探針，首先根據需求設計探針序列，然后由PerSeptive Biosystems, Framingham, MA 制備合成，通過 RP-HPLC 進行純化。
[0015]所述去除剪切功能區域的限制性內切酶可利用分子生物學技術獲得，即將限制性內切酶的基因中與“剪切功能區域”對應的序列刪除，再在細胞中經過翻譯表達得到。
[0016]本發明對長鏈DNA分子上的特異性位點進行生物分子探針的修飾標定，然后讓其穿過固體納米孔，得到了與普通未修飾的DNA截然不同的二級電流信號(secondaryblockage),通過對二級電流信號的分析和統計，表征出DNA上被修飾過的特異性位點的空間位置和順序，從而得到該長鏈DNA的物理圖譜。
[0017]基于上述方法，本發明還提供了一種對DNA進行測序的方法。
[0018]該方法包括下述步驟:
[0019]I)采用本發明的方法對生物分子探針標定DNA的特異位點進行檢測，得到了與普通未修飾的DNA截然不同的二級電流信號，通過對二級電流信號的分析和統計，表征出DNA上被修飾過的特異性位點的空間位置和順序，從而得到所述DNA的物理圖譜；
[0020]2)采用第二代高通量測序方法對所述DNA進行測序，將打碎的小片段上存在的特異序列與步驟I)中標定了空間位置和順序的特異性位點進行比對，直接得出小片段在組合成長鏈DNA時的位置，經過拼裝得到長鏈DNA的序列。
[0021]本發明充分挖掘和結合了固態納米孔技術和第二代測序技術的特點，實現優勢互補。通過固態納米孔技術得到的DNA物理圖譜恰好可以作為第二代測序技術中小片段序列拼接的指導，將小片段上存在的特異序列與標定了空間位置和先后順序的特異性位點進行比對就可以直接得出小片段在組合成長鏈時的位置，從而大大減輕了數據分析的工作量和算法的難度。
[0022]在上述方法基礎上，發明人進一步發明了利用多種生物分子探針對一條DNA長鏈進行標定和探測的技術，利用不同構型的生物分子探針在物理尺度和電學性質上的差異，得到了更加復雜且信息量更大的二級電流信號，提高了在長鏈DNA上的修飾標定密度，使不同的標定分子不至于混淆。同時建立了一個標定分子庫，對于需要標定的特異性位點的序列和長度可以進行選擇，以充分滿足測序應用的需要。
[0023]本發明突破傳統的基于固態納米孔器件的DNA測序的方法，引入壓強外場作為驅動DNA穿孔的驅動外場，加電場作為反向外場，在不降低測量信號信噪比的前提下，使用IOnm左右的SiN固態納米孔，有效降低DNA分子穿過納米孔器件的速度，可以將穿孔速度減慢一個數量級以上。顯著提高了現有工作的時間分辨率，既可以保持高的電流信號信噪比，又可以避免引入由于使用很小的納米孔(直徑小于5nm)帶來的DNA分子與納米孔壁不可控的相互作用問題，并且實驗簡單易行，重復性和可控性都比現有技術有顯著提高。但即使是這樣，要直接實現對單堿基的分辨依然達不到。
[0024]發明人考慮在現有的技術條件下，結合固態納米孔DNA穿孔速率快，讀取長度較長(現在可以達到約IOOkbp的讀長，理論上講讓一條染色體上的雙鏈DNA連續通過在不久的將來也有望實現)的特點與現有第二代測序技術在小片段測序方面的高精度、高通量的優勢，在小片段拼接算法方面給予現有測序技術以幫助，有望將人類全基因組的測序成本降低一個數量級(現有技術的成本大約是IOOk美元/人)，從而離實現我們的目標更進一
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[0025]本發明相比于 現有對基于固態納米孔對DNA分子探測的報道，集中的優勢體現在:
[0026]1、現有技術在DNA分子穿孔探測的時間分辨率上距離單堿基的分辨依然遙遙無期，而本發明創造性地將不易做到的單堿基分辨轉換成了對直徑更大、因而也更易探測的標定分子的探測，從而間接實現了對DNA上的特異序列的分辨，在基于固態納米孔對DNA分子進行探測領域是一個長足的進步。同時由于特異序列在DNA長鏈上的標識作用，本發明還具有很廣闊的實用價值。
[0027]2、之前對DNA分子穿孔速率進行減速的研究普遍發現，由于分子布朗運動的存在，DNA分子穿孔速率越慢，布朗運動對其運動不確定度的影響也就越顯著，因此雖然時間分辨率提高了，但是空間分辨率的不確定度卻在增大。而本發明中雖然也使用了壓強驅動DNA減速的技術，但是由于標定分子的二級電流信號特征明顯易于探測，所以對DNA減速的幅度并不大，使得最后對事件的統計結果具有極好的精確度和可信度。
[0028]3、方法簡單，易于操作。用于標定的肽核酸(peptide nucleic acids PNA)生物分子探針最早報道于 1992 年(M.Egholm, P.E.Nielsen, et al.J.Am.Chem.Soc., 1992, 114(5), pp 1895-1897)，其合成制備手段成熟易行，而且獲得的標定分子可以保留建立標定分子庫，以滿足不同的特異性位點的序列和長度對生物分子探針的需求。這種方法可重復性好，非常利于推廣。不需要引入復雜的體系和制作工藝，對技術要求不高，實驗成功率很聞，大大提聞了實驗效率。
[0029]4、之前的研究和報道全部著眼于對DNA本身穿孔事件的研究，試圖解決單堿基分辨的難題。而本發明充分利用了現有技術條件下成熟的技術手段，通過創造性的技術整合和優勢互補，達到挖掘現有技術潛力的目的，也不失為一種很好的思路。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0030]圖1為本發明所用固態納米孔的光刻掩模板的圖形；其中，(a)為4英寸硅片設計的光刻掩模板圖形，(b)對圖1a的局部放大圖，白色圓孔區對應的是每個芯片中的圓形透光區域。(c)對Ib的進一步放大圖,可以清楚看到對應于每個芯片中對應的圓形透光區域。(d)為方便從4英寸大硅片上解理單個小芯片，而特殊設計的劃片線，用白色虛線表示。
[0031]圖2為納米孔器件(3mm*3mm芯片)制作流程示意圖；(a)甩膠，曝光，顯影，去膠，出圖形(b)反應離子束刻蝕刻透一面的氧化娃和氮化娃(C)去掉光刻膠(d) KOH溶液各向異性腐蝕掉硅，露出氧化硅和氮化硅懸空膜(e)用聚焦離子束在氧化硅刻出一個深度為
1.5 μ m的小窗格(f ) RCA反應將剩余0.5 μ m氧化硅層去掉，只暴露出2 μ mX 2 μ m小窗格大小，厚度為70nm的氮化硅懸空膜。
[0032]圖3(a)離子電流測量與壓強加載示意圖；(b)泳池和電極加載裝置圖；(C)壓強加載裝置圖；(d)壓強顯示 計。
[0033]圖4為在IOkb長鏈DNA上利用人工合成的肽核酸(peptide nucleic acidsPNA)生物分子探針(識別位點為CTTCTTT)標定兩個特異性位點，獲得的二級電流信號(secondary blockage)圖。
[0034]圖5為在IOkb長鏈DNA(其序列上每間隔Ikb就有一個可以被分子標定的特異位點)上間距Ikb標定一個生物分子探針，對大量DNA穿孔事件的統計得到標定分子的相對位置分布圖。
[0035]圖6為在長度為48kb的λ -DNA上標定三種不同識別位點和分子構型的生物分子探針(特異性識別位點分別為CTTCTTT，CTAGAT，GCTTCAT)，獲得的強度不同的二級電流信號圖。
【具體實施方式】
[0036]下面通過具體實施例對本發明的方法進行說明，但本發明并不局限于此。
[0037]下述實施例中所述實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法；所述試劑和材料，如無特殊說明，均可從商業途徑獲得。
[0038]實施例、
[0039]I)制備芯片器件
[0040]本步驟的目的是制備可以放入透射電子顯微鏡中進行操作的固態納米孔器件，從而實現利用透射電子顯微鏡中高能會聚電子束對器件懸空薄膜進行打孔操作，從而實現納米孔器件。這其中包括了一系列傳統半導體加工工藝中涉及的微納加工工藝，并且還涉及了一系列現代前沿的納米尺度加工技術。
[0041]具體方法如下:首先，將(100)面4英寸硅片，兩面分別先后生長2微米的氧化硅，用低壓化學氣相沉積方法沉積150到200納米左右的低應力氮化硅。然后制作光刻掩模版，目的是要在4英寸的娃片上做成很多3mmX3mm的小基片周期分布(圖1a),每個3mmX3mm小基片圖形中心有一個直徑為584 μ m的圓形透光區域(圖lb，C)。為保證后期在4英寸硅片上分離每個3mmX3mm的小基片，保證分離劃片時走刀的準確，又使得硅片不會破損成隨機小片，在每個小基片圖案邊界加了一些透光的短劃線:透光條的寬度為5 μ m，長度為20 μ m(圖1d)。光刻掩模版的具體制作參數為:制版尺寸:5英寸；圖形分布范圍:Φ IOOmm圓形分布；晶向條:距離中心49mm,長50mm,寬0.8mm。然后利用光刻(圖2a)和反應離子束刻蝕(圖2b)將Si片一面的二氧化娃和氮化娃按照光刻掩模版的圖形刻透,露出Si表面。隨后去掉光刻膠(圖2c)，使用KOH各向異性腐蝕，(40%K0H，80°C，6小時)腐蝕硅，腐蝕沿著(111)面進行。腐蝕穿的標準是:小窗格透光后再過腐蝕一段時間。光學顯微鏡下氧化硅面很平整，沒有島狀結構。這樣就實現了一面只有二氧化硅和氮化硅的小窗格(20~80μπι)懸空膜，下面有娃襯底作支撐(圖2d)。接下來,為了從4英寸的大娃片上分離3mmX3mm小基片，需要進行劃片操作。劃片時需要在硅片背面貼上一層強力藍膠做保護，因為在劃片過后，撕開藍膠時容易把懸空膜撕破，所以必須做好防護。辦法是:用高溫熱融蠟把待劃硅片和另一保護硅片用高溫熱融蠟粘在一起。然后把藍膠粘在保護硅片的背面，放進劃片機進行劃片，劃片深度為200到250微米左右。劃片過后，把藍膠撕下。把熱融蠟粘在一起的硅片放在熱板上加熱，蠟融化，把硅片分開。上面的蠟用丙酮沖洗干凈即可。這一步可以保證順利解理得到大量3mmX3mm小基片。一般來講，一張4英寸的硅片，可以解理得到800片3mmX3mm小基片。之后將3mmX3mm小基片放入熱磷酸160°C加熱減薄氮化娃膜厚度,減薄速率為f5nm每分鐘，減薄到70納米或其它需要的厚度，厚度可以通過橢偏儀監控。之后為了降低暴露在溶液中氮化硅膜的面積以減小電容噪聲，并且降低氮化硅膜在溶液中破裂的可能，我們使用聚焦離子束(FIB，DB 235，FEI)刻蝕2微米氧化硅，離子束流300pA，大約刻蝕I分鐘，可以在氮化娃下面形成一個I~2 μ mX I~2 μ mX 1.5 μ m的小窗格，1.5 μ m是深度。目前我們得到了還剩余500nm厚氧化娃，I~2 μ mX I~2 μ m的小窗格(圖2e)。然后使用RCA反應，將剩余的500nm厚`氧化硅腐蝕掉，只剩下I~2μπιΧ1~2μπι小窗格大小，厚度為70nm的氮化硅懸空膜(圖2f)。其中RCA反應為:NH3.H2O:H202=1:1:5 (v/v)，70° C加熱10分鐘，去除硅片上的有機污染，也為了下一步BOE腐蝕時更好的浸潤；B0E(HF =NH4F:H2O=1:2:3)腐蝕6分鐘(腐蝕速率為100nm/min)，可以把剩余的500nm氧化硅去除干凈得到懸空的氮化硅膜；HC1 =H2O2 =H2O=1:1:5 (v/v/v)，，70° C，清洗10分鐘，去除無機雜質。
[0042]2)透射電子顯微鏡進行納米孔制作
[0043]芯片器件加工好之后,放入透射電子顯微鏡(FEI Tecnai F30)進行打孔操作，放大倍數調整到520k-890k，束斑大小為:1，電子束聚到最小或稍大，5分鐘左右，即可得到直徑IOnm左右、深度為60nm的納米孔。打孔前后，樣品桿要放在等離子體清洗儀中(O2:Ar=l: 3, v/v)里清洗一分鐘，去除有機污染。納米孔器件制作好后，儲存在真空干燥箱里備用。
[0044]3)制備用于對DNA分子上的特異性位點進行修飾標定的生物分子探針[0045]肽核酸(peptide nucleic acids PNA)生物分子探針是將核酸分子中帶電荷的磷酸戊糖骨架置換成電中性、非手性、類似多肽骨架而得到的一種DNA類似物，其骨架由酰胺鍵連接的N(2-氨乙基)-甘氨酸單元重復組成，AGCT四種堿基與骨架之間以亞甲基羰基相連，可以通過堿基互補配對原理與DNA上的特異序列相互作用，而且具有特異性強，親和性及穩定性好的特點。PNA最早報道于1992年(MEgholm，P.E.Nielsen, etal.J.Am.Chem.Soc., 1992, 114 (5), pp 1895 - 1897),隨后 Egholm和 Nielsen 等人又合成出了具有不同構型和雜交模式的 PNA,例如 bis_PNA(M.Egholm, P.E.Nielsen, et al.NucleicAcid.Res.1995, 23 (2), 217 - 222.)和 pcPNA (P.E.Nielsen, et al.Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.1999,96(21), 11804 - 11808.)等。目前商業化的PNA探針合成手段已經非常成熟。
[0046]本發明所使用的肽核酸(peptide nucleic acids PNA)生物分子探針,首先根據需要設計特異序列并選擇合適的構型(PNA單體、bis-PNA或pcPNA等),然后由PerSeptiveBiosystems, Framingham, MA制備合成,通過RP-HPLC (高效液相色譜)進行純化,其濃度可以用紫外分光光度計在UV260nm處定量。制備得到的具有不同序列、構型和雜交模式的PNA分子探針用于4)和5)的后續實驗。
[0047]4)單分子標定DNA穿過固態納米孔的探測
[0048]我們通過一系列浸潤過程用PDMS墊片將芯片封裝入由PEEK制成的電泳池中，泳池由Cis腔和Trans腔構成，兩個腔之間只通過納米孔進行連接，無其他連接通道(圖3a)。然后向兩個腔中注入濃度為1.6摩爾每升的氯化鉀溶液。溶液中含有ImM的EDTA和IOmM的Tris (pH=8)。我們使用兩個Ag/AgCl電極分別插入Cis腔和Trans腔中(圖3a)。
[0049]我們將預先制備好的單種PNA生物分子探針溶液(識別位點為CTTCTTT)與IOkb的長鏈DNA溶液混合，調節混合溶液的pH = 8，其中長鏈DNA的序列已知(見圖4)，上面有兩個可被選定的分子標定特異性結合的位點。混合溶液放在熱臺上水浴30min,溫度設定為.37°C，以提高特異性結合的效率(限制性內切酶的活性在37°C時最佳)。
[0050]然后向Cis腔注入混合水浴后的DNA溶液，在從Cis到Trans的方向引入壓強外場。具體做法:在與Cis腔相連的導管上連接于氣瓶相連的導管，使得氣瓶產生的壓強可以被引入到Cis腔中(圖3b，C)。引入壓強的示數通過氣壓計顯示(圖3d)。通過調節氣瓶上的壓強真空計，就可以調節被引入到Cis腔中的壓強大小。這樣我們就實現了 Cis到Trans方向的壓強外場驅動。然后我們再從反向加載IOOmV電壓(圖3a)，這樣可以利用膜片鉗放大器系統給出離子電流測量信號。由于DNA和其上的分子標定在溶液中帶負電，反向電壓的施加起到減速DNA，提高時間分辨率的作用。未經標定的DNA分子通過固態納米孔時由于占據了孔內的離子通道，因此使得離子電流信號產生了一個降低(blockage)，而當有標定的DNA分子從孔內穿過時，生物分子探針和DNA特異性結合的區域會產生構象改變，因此對離子通道的堵塞作用更加顯著，從而在電流信號降低的情況下進一步產生一個新的降低信號(secondary blockage)(見圖4),成為表征DNA上具有某些特異性序列的有力證據。通過對大量DNA穿孔事件的信號數據進行統計分析，我們精確地確定了兩個特異性序列位點之間的空間距離，與已知序列的比對證明本發明的實驗方法精確度很高。
[0051]在以上實驗的基礎上，發明人設計合成了另一種長度為IOkb的DNA雙鏈分子，在其序列上每間隔Ikb就有一個可以被分子標定的特異位點(特異性識別位點為CTTCTTT)，即一條鏈上總共有9個可標定位點。最后我們經過大量的穿孔事件統計分析，得到了這9個標定位點的相對距離(見圖5)，實驗結果與我們的模擬和預期非常吻合，同時我們還發現:作為標定的生物分子探針與DNA的親和性及特異性很好，超過90%的穿孔事件都有且僅有9個二級電流信號，說明這些穿孔的DNA上有且僅有9個結合的標定分子。這表明利用本發明的方法對現有測序手段實現改進的想法不僅可行，而且非常可靠。
[0052]5)混合分子標定DNA穿過固態納米孔的探測
[0053]購買商業化的λ-DNA分子溶液(長度為48kb)，根據已知的序列從我們建立的標定分子庫中選擇了三種不同的標定分子(特異性識別位點分別為CTTCTTT，CTAGAT，GCTTCAT)，它們的特異性識別位點長度分別為7bp、6bp和7bp，這些特異性位點在48kb的序列上相隔排列，同時三種標定分子與DNA結合后產生的構象改變各不相同。我們將三種標定分子與λ -DNA分子混合，37°C水浴30min后注入電泳池的Cis腔，在壓強驅動反向電場減速的條件下測量離子電流信號，結果得到了三種強度的二級電流信號(見圖6)，分別對應三種不同的標定分子，從而對應地獲得了三種特異性位點在λ -DNA鏈上的排列順序和空間距離。這一實驗一方面是對分子標定DNA探測技術的穩定性和精確性進行進一步的驗證，另一方面也更加符合現有測序技術對小片段拼接方面的要求，因為所需拼接的小片段上很有可能帶有不同的特異序 列，需要我們在長鏈DNA上做不同的標定。
【權利要求】
1.一種基于納米孔器件對生物分子探針標定DNA的特異位點進行檢測的方法，包括下述步驟:1)用生物分子探針對DNA的特異位點進行標定，得到標定的DNA ； 2)利用納米孔測序裝置對所述標定的DNA的特異位點進行檢測，所述納米孔測序裝置包括:設有正極和負極的電解池、以及分隔所述電解池正極和負極的固態納米孔薄膜；將所述標定的DNA加入到盛有電解液的所述電解池的正極腔室中，檢測時，向所述正極腔室引入壓強外場，作為DNA穿孔的驅動外場；并在正極和負極間施加電壓，作為與壓強外場反向的電場外場；測定過程中所述標定的DNA在納米孔中受到的壓強外場的作用力大于電場力。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于:所述引入壓強外場產生的壓強為1.6-2.6個標準大氣壓，所述施加電壓的大小為40-160mv。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述電解液的濃度為0.1-3.2mol/L,pH值為8-10 ;所述固態納米孔薄膜中納米孔的直徑為10-20nm，孔深為20_100nm。
4.根據權利要求1-3中任一項所述的方法，其特征在于:所述生物分子探針為人工設計合成的肽核酸或去除剪切功能區域的限制性內切酶作為生物大分子。
5.根據權利要求1-4中任一項所述的方法，其特征在于:采用不同的生物分子探針同時對DNA的不同的特異位點進行標定。
6.權利要求1-5中任一項所述方法在繪制DNA物理圖譜中的應用。
7.一種對DNA進行測序的方法，包括下述步驟: 1)采用權利要求1-5中任一項所述方法對生物分子探針標定的DNA的特異位點進行檢測，得到了二級電流信號，通過對所述二級電流信號的分析和統計，表征出DNA上被標定過的特異性位點的空間位置和順序，從而得到所述DNA的物理圖譜； 2)采用第二代高通量測序方法對所述DNA進行測序，將打碎的小片段上存在的特異序列與步驟I)中標定了空間位置和順序的特異性位點進行比對，直接得出小片段在組合成DNA時的位置，經過拼裝得到DNA的序列。
【文檔編號】C12Q1/68GK103509852SQ201210207703
【公開日】2014年1月15日 申請日期:2012年6月18日 優先權日:2012年6月18日
【發明者】趙清, 唐智鵬, 魯鉑, 俞大鵬, 李松崗 申請人:北京大學