專利名稱：堿性裂解提取dna的方法
技術領域：
本發明涉及DNA的提取方法，尤其涉及一種堿性裂解提取DNA的方法。
背景技術：
隨著我國DNA數據庫建設的不斷深入，國家庫DNA數據量飛速增加，全國的生物檢材檢驗資金消耗也與日俱增，據統計，一年全國需投入DNA檢驗經費約2個億。如何在保障DNA檢驗結果準確的前提下，建立一種新的DNA檢驗方法，大幅降低DNA數據庫生物檢材檢驗成本，具有重要意義。目前DNA數據庫生物檢材的檢驗方法主要分二類
第一類是用Chelex-100或磁珠等方法將生物檢材中DNA提取后再擴增。 第二類是直接用直擴試劑盒進行擴增。在節約檢驗成本方面，兩類方法在提取及擴增階段各有優勢及不足。在生物檢材提取階段，第一類方法有Chelex-100或磁珠等試劑消耗，第二類方法無需提取直接擴增，因此，第一類方法在提取階段成本高，第二類方法具有優勢。但第一類方法較第二類方法在擴增方面有明顯優勢，第二類方法的模板DNA為固態，具有一定的體積和吸水性，故其擴增體系不能太小，目前只能做到5微升體系，且穩定性不好，而第一類方法的模板DNA為液態，其擴增體系目前能做到I微升，且穩定性好，且由于生物檢材DNA檢驗的擴增試劑成本遠遠高于提取試劑成本，因此，如果想大幅降低DNA數據庫檢驗成本，生物檢材的DNA檢驗應選擇第一類方法。而在第一類方法中，堿性裂解法是DNA提取成本最低、所需時間最短的方法。所謂堿性裂解提取法，即在強堿作用下，使構成細胞的蛋白質成分谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、酪氨酸殘基等迅速發生電離，從而快速破壞蛋白質的一級結構，正因為強堿對蛋白質有強烈的變性乃至裂解作用，所以，檢材在強堿性PH條件及一定溫度狀況下能迅速破碎細胞及核膜，使核酸酶變性及DNA釋放。但是現有的堿性裂解法也存在一些不足之處，例如生物檢材DNA不能常溫保存；不適用于全部生物檢材；不同種類的生物檢材提取方法各不同。這些不足之處導致其不能滿足現有的各類常規法醫生物檢材在相同的設備及實驗條件下同時進行自動化DNA提取工作。因此，確有必要提供一種能滿足現有的各類常規法醫生物檢材的需要，并能在相同的設備及實驗條件下同時進行自動化DNA提取工作的堿性裂解提取DNA的方法來解決上述技術問題。
發明內容
本發明所解決的技術問題在于提供一種堿性裂解提取DNA的方法，其能有效降低成本，并能提高效率，能滿足現有的各類常規法醫生物檢材在相同的設備及實驗條件下同時進行自動化DNA提取工作。
為解決上述技術問題，本發明采用如下技術方案一種堿性裂解提取DNA的方法，包括如下步驟第一將檢材放入濃度為0. 05-0. 6 M的NaOH溶液中；第二 對上述溶液進行孵化，孵化溫度為90°C _99°C，孵化時間為5-10分鐘；第三對所述孵化后的溶液置于振蕩器進行振蕩；第四加入濃度為0. 01-0. 1M、pH值為5-8的Tris-HCl溶液并進行離心振蕩；第五將提取物置于-20°C環境中冷凍保存。作為本技術方案的進一步改進，所述NaOH溶液的濃度為0. 25M。作為本技術方案的進一步改進，所述孵化溫度為99°C，孵化時間為8分鐘。作為本技術方案的進一步改進，所述Tris-HCl溶液的濃度為0.05M，PH值為6. 5。與現有技術相比，本發明通過改變試劑的濃度、pH值、孵化時間及孵化溫度等參數，使其能滿足現有的各類常規法醫生物檢材的需要，并能在相同的設備及實驗條件下同時進行自動化DNA提取工作。
圖I為本發明所述的NaOH溶液濃度(0. 05-0. 6M)與峰值的變化。圖2為本發明所述的Tris-HCl溶液濃度(0. 01-0. 1M)與峰值的變化。圖3為本發明所述的Tris-HCl溶液PH值(5_9)與峰值的變化。圖4為本發明所述的孵化溫度與峰值的變化。圖5為本發明所述的孵化時間與峰值的變化。圖6為本發明所述的提取物保存時間與峰值的變化，上方線條為冷凍保存，下方線條為室溫保存。
具體實施方式
本發明提供一種堿性裂解提取DNA的方法，包括如下步驟
第一將檢材放入濃度為0. 05-0. 6M的NaOH溶液中，其中，NaOH溶液的最佳濃度為
0.25 M ；
第二 對上述溶液進行孵化，孵化溫度為90°C _99°C，孵化時間為5-10分鐘，其中，最佳孵化溫度為99°C，最佳孵化時間為8分鐘。第三對所述孵化后的溶液置于振蕩器進行振蕩；
第四加入濃度為0. 01-0. lM、pH值為5-8的TriS-HCl溶液并進行離心振蕩；
第五將提取物置于-20°C環境中冷凍保存。對所述提取物進行的擴增，采用美國AB公司AmpFLSTR IdentifiIer PCR擴增試劑盒，總反應體系為10 yl，其中DNA模板I yl。擴增條件按試劑盒說明書在9700型PCR儀擴增進行復合擴增。本發明所述的NaOH濃度、Tris-HCl濃度及pH值、孵化溫度及孵化時間對整個提取過程具有極其重要的作用，是經過復雜的、多次的試驗才得到的最佳參數，也是本發明相對于現有的堿性裂解提取法的最大改良，為了闡述這些參數所帶來的優勢，以下結合具體試驗進行闡述。試驗過程中，利用的儀器及試劑分別為AB公司9700型PCR熱循環儀；AB公司3130x1測序儀；IdentifiIerTM試劑盒；NaOH、Tris及HCl溶液。針對的檢材主要包括抗凝血、帶毛囊毛發、血斑、精液、唾液等。關于NaOH的濃度各取 5W 抗凝血分別用濃度為 0. 05M、0. I M、0. 15 M、0. 2 M、0. 25 M、0. 3 M、0. 35 M、0. 4M、0. 45 M、0. 5 M、0. 55 M、0. 6 M 的 20W 的 NaOH 及 Tris-HCl (0. 05M 且 pH=6. 5)溶液提取
DNA。實驗證明，檢驗結果峰值隨NaOH濃度增大而升高，當NaOH濃度為0. 25M時，峰值達到最高，但當NaOH濃度超過0.25M時，峰值隨NaOH濃度增加而降低(參圖I)。當NaOH濃度小于0. 15M或大于0. 35M時，樣本擴增產物同一熒光標記物的不同基因座之間的均衡性差，大于50%，尤其是大片段STR基因座峰值較小片段明顯下降，易引起等位基因缺失。由此可見當NaOH濃度為0.25 M時，最適合抗凝血DNA的提取。經實驗證明，此濃度的NaOH溶液同樣適用于其它類法醫生物檢材的DNA提取 。因此，改良后的堿性裂解法NaOH濃度最佳應采用0. 25 M0同時，由于NaOH溶液可從空氣中吸收二氧化碳，所以在保存NaOH溶液時需注意將瓶蓋嚴。關于Tris-HCl的濃度
各取 5W 抗凝血分別用濃度為 0. 01M、0. 02M、0. 03M、0. 04M、0. 05M、0. 06M、0. 07M、
0.08M、0. 09M、0. IOM 的 Tris-HCl (pH=6. 5)溶液及 0. 25M 的 NaOH 溶液提取 DNA。實驗證明，檢驗結果峰值隨Tris-HCl濃度增加(0. 01-0. 1M)無明顯變化(參圖2)。由此可見，Tris-HCl濃度在0. 01-0. IM范圍內適合抗凝血DNA的提取。本發明的堿性裂解法使用的Tris-HCl濃度最佳值為0. 05M，經實驗證明，此濃度的Tris-HCl溶液同樣適用于其它類法醫生物檢材DNA的提取。同時，由于Tris-HCl溶液可從空氣中吸收二氧化碳或揮發HCl，故在保存Tris-HCl溶液時注意將瓶蓋嚴。關于Tris-HCl 的 pH 值
各取 5m 抗凝血分別用 PH=5. O、PH=5. 5、PH=6. O、PH=6. 5、PH=7. 0、PH=7. 5、PH=8. 0、PH=8. 5、PH=9. 0 的 Tris-HCl (0. 05M)溶液及 0. 25M 的 NaOH 溶液提取 DNA。實驗證明，峰值隨Tris-HCl PH值(5. 0至8. 0)增加變化不大，但當Tris-HCl PH大于8. 0時，峰值隨PH值的增加而明顯下降(參圖3)，且樣本擴增產物同一熒光標記物的不同基因座之間的均衡性差，大于50%，尤其是大片段STR基因座峰值較小片段明顯下降，易引起等位基因缺失。由此可見，當Tris-HCl PH值在5.0至8.0范圍內適合鮮血DNA的提取。改良后的堿性裂解法使用的Tris-HCl的最佳PH值為6. 5，經實驗證明，此濃度的Tris-HCl溶液同樣適用于其它類法醫生物檢材DNA的提取。關于孵化溫度
各取 5W 抗凝血用 NaOH (0. 05M)及 Tris-HCl (0. 05M pH=6. 5)溶液分別在 20°C、30°C、40°C、50°C、60°C、70°C、80°C、90°C、99°C時提取 DNA。實驗證明，峰值隨著孵化溫度的增加而升高，當達到90度時達到最高值(參圖4)，但當孵化溫度低于80°C時，樣本擴增產物同一熒光標記物的不同基因座之間的均衡性差，大于50%，尤其是大片段STR基因座峰值較小片段明顯下降，易引起等位基因缺失。由此可見，樣本孵化溫度在90°C _99°C之間適合抗凝血DNA的提取。而在室溫條件下提取抗凝血，大片段STR基因座等位基因缺失嚴重，故用堿性提取法在室溫下幾乎僅需一分鐘，便可有效的從全血中提出DNA的論述，是不科學的，其只適合小片段DNA的提取，不適合熒光STR檢測。為了能同時適合其它類法醫生物檢材的提取，改良后的堿性裂解法孵化溫度采用990C，經實驗證明此孵化溫度適用于其它各類法醫生物檢材的DNA提取。
關于孵化時間
各取5W抗凝血用NaOH (0. 05M)及Tris-HCl (0. 05M、pH=6. 5)溶液在99°C分別孵化
1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 分鐘后提取 DNA0實驗證明，樣本在99°C孵化時其檢驗結果峰值隨孵化時間的增加(1-10分鐘)而無明顯變化(圖5)，但當孵化時間低于4分鐘時，樣本擴增產物同一熒光標記物的不同基因座之間的均衡性較差，尤其是大片段STR基因座峰值較小片段明顯下降，但不會引起等位基因缺失。由此可見孵化時間在5-10分
權利要求
1.一種堿性裂解提取DNA的方法，包括如下步驟 第一將檢材放入濃度為0. 05-0. 6 M的NaOH溶液中； 第二 對上述溶液進行孵化，孵化溫度為90°C _99°C，孵化時間為5-10分鐘； 第三對所述孵化后的溶液置于振蕩器進行振蕩； 第四加入濃度為0. 01-0. lM、pH值為5-8的Tris-HCl溶液并進行離心振蕩； 第五將提取物置于-20°C環境中冷凍保存。
2.根據權利要求I所述的提取DNA的方法，其特征在于所述NaOH溶液的濃度為0.25M。
3.根據權利要求2所述的提取DNA的方法，其特征在于所述孵化溫度為99°C，孵化時間為8分鐘。
4.根據權利要求3所述的提取DNA的方法，其特征在于所述Tris-HCl溶液的濃度為0.05M，PH 值為 6. 5。
全文摘要
本發明提供了一種堿性裂解提取DNA的方法，包括如下步驟第一將檢材放入濃度為0.05-0.6M的NaOH溶液中；第二對上述溶液進行孵化，孵化溫度為90℃-99℃，孵化時間為5-10分鐘；第三對所述孵化后的溶液置于振蕩器進行振蕩；第四加入濃度為0.01-0.1M、pH值為5-8的Tris-HCl溶液并進行離心振蕩；第五將提取物置于-20℃環境中冷凍保存。與現有技術相比，本發明通過改變試劑的濃度、pH值、孵化時間及孵化溫度等參數，使其能滿足現有的各類常規法醫生物檢材的需要，并能在相同的設備及實驗條件下同時進行自動化DNA提取工作。
文檔編號C12N15/10GK102719427SQ20121024286
公開日2012年10月10日 申請日期2012年7月14日 優先權日2012年7月14日 公開號201210242862.發明者宋金平, 崔江平, 張艷霞, 李愛強, 王項華, 趙麗, 陳力清 申請人:李愛強