專利名稱：一種基于抑癌基因的抗肝癌制劑及制備工藝的制作方法
技術領域：
本發明專利涉及一種基于腺病毒特異性表達的抑癌基因PTEN，可用于抑制腫瘤生長的抗癌制劑——甘露聚糖修飾的腺病毒-抑癌基因PTEN，即Manan-Ad5-PTEN，屬于生物醫藥技術領域。背景技術：
目前對于腫瘤的治療主要集中于手術、放療和化療等常規手段，但很多惡性腫瘤還是難以治愈，生物治療已經成為腫瘤綜合治療的新模式，并受到越來越多的關注。由于癌癥的產生是病毒或化學致癌物的作用使原癌基因激活成為癌基因，以及抑癌基因失活，引起細胞生長失控而形成，因此基因治療的目的是通過外源基因的導入以修復或糾正病人體內基因表達系統，從根入手，阻斷腫瘤的病理過程。
抑癌基因 PTEN (Phosphatase and tensin homologue deleted on chromosometen gene, PTEN)是1997年由Steck等3個研究小組分別發現并命名的一種新的抑癌基因。現已證實該基因的突變、失活與多種腫瘤的發生發展密切相關，成為繼pl6、p27和p53后又一具有重要意義的抑癌基因。目前已發現在多種腫瘤中存在PTEN基因的突變，如錯構瘤綜合征(Cow den syndrome)、膠質瘤、前列腺癌、乳腺癌、甲狀腺癌、子宮內膜癌、黑色素瘤、肺癌、腎癌、肝癌、膀胱癌、消化道腫瘤等。研究發現，PTEN基因的缺失、突變或表達產物的失活等，影響腫瘤的發生與發展。基因的導入，根據載體的不同，可分為病毒轉基因和質粒轉基因兩種。其中，以質粒為載體的基因治療存在基因轉染率較低的問題；病毒載體則具有更高的轉染效率。腺病毒是目前基因治療研究和臨床試驗中應用最廣泛的病毒載體之一。由于腺病毒具有載體宿主范圍寬廣，感染效率高，可插入外源基因片段大，無插入突變等特點，因而受到特別的重視。但腺病毒載體介導的基因轉移缺乏靶向特異性。在基因治療的載體研究中，其中一個重要的研究方向是用配體或單克隆抗體對載體系統進行修飾，以提高靶組織、靶細胞對載體系統的攝取能力。研究發現，肝非實質細胞(如KupfTer細胞和肝竇內皮細胞)和巨噬細胞的細胞膜上存在有甘露糖受體，它可以與含糖基的復合物結合。因此，通過一定的方式，利用甘露糖受體介導系統將腺病毒與甘露糖受體結合，可達到對肝臟的靶向性。由于腺病毒存在潛在的免疫原性和毒性，并且體內應用時易被廣泛存在的腺病毒抗體中和。為克服腺病毒的無靶向性、免疫原性以及在體內應用時易被腺病毒抗體中和等缺點，有研究者對病毒的衣殼蛋白進行聚乙二醇化，形成一種“隱形病毒”，逃避免疫系統的監視，降低了 T細胞毒性和抗體的產生，進而延長了基因表達。本發明將腺病毒的衣殼蛋白通過甘露聚糖糖基化，可將重組腺病毒在體內靶向至DC細胞和肝癌細胞，誘導了抗腫瘤抗原的免疫應答；可延長基因表達，降低其免疫原性和毒性。三、發明目的
本發明的目的在于充分利用腺病毒載體高效率轉導基因的優點，避免其免疫原性和毒性的產生，制備一種利用抑癌基因原理有效抑制腫瘤生長的新型的抗肝癌制劑，為惡性腫瘤的治療提供一種有效的治療途徑。
四
發明內容
本發明利用腺病毒轉運抑癌基因PTEN，并利用甘露聚糖修飾腺病毒載體，從而制備了一種新型的抗肝癌制劑。本發明涉及的抑癌制劑的具體制備方法如下
第一步特異性表達PTEN基因的重組腺病毒即Ad5-PTEN的大量擴增。利用微量的商品化的Ad5-PTEN腺病毒種源感染293細胞，48h后95%的細胞胞質收縮變圓呈葡萄串樣，即判斷為出現細胞病變效應(CPE);收集細胞懸液，4°C，5000 rpm離心10 min，上清備用；將細胞重懸于2.0 mL完全培養基中，于液氮中凍結細胞，37°C水浴溶解，劇烈振蕩，此步驟共進行4次；然后4°C, 5000 rpm離心10 min,收集上清后合并前一步驟的病毒上清進一步感染100 _培養皿中的細胞；細胞出現病變效應后，按照前述方法收集病毒，并進而將其感 染150 mm培養皿中的293細胞，以獲得足夠量的病毒。第二步Ad5_PTEN的純化。采用氯化銫(CsCl)密度梯度離心法純化重組腺病毒，氯化銫密度分別為I. 45 g/m!^P1.25 g/mL。操作步驟如下各個超速離心管依次加入I. 25區/1111氯化銫1.25 mL,然后各管管底小心加入I. 45 g/mL氯化銫I. 25 mL以頂起低密度的氯化銫溶液；最上層加入2. 4 mL待純化樣品，100000Xg，4°C離心3 h，收集第二層乳白色病毒條帶。接著進行第二次密度梯度離心各個超速離心管同上依次加入I. 65 mL I. 25g/mL氯化銫和I. 65 mL I. 45 g/mL氯化銫,最上層加入I. 6 mL第一步離心后收集的病毒條帶，IOOOOOXg 4°C離心15-18 h。第一次密度梯度超速離心后，上層為一些細胞碎片和一些缺陷型病毒顆粒，第二條有白色乳光的帶層為病毒層；第二次離心后出現一條分界清晰的乳白色半透明的薄層病毒帶即為所需腺病毒。第三步抑癌制劑的制備。I)透析袋處理制備氧化型甘露聚糖前，對透析袋進行預處理，以激活透析袋；處理步驟如下將透析袋剪成適當長度(10-20 cm)的小段；置于2% (W/V)碳酸氫鈉和ImM EDTA (pH 8. 0)混合溶液中煮沸10分鐘；蒸餾水徹底清洗；ImM EDTA (pH 8.0)中煮沸10分鐘；冷卻后，加上封蓋存放于4°C，透析袋始終浸沒在溶液內，取用透析袋時必須戴手套；用前在透析袋內裝滿緩沖液清洗干凈。2)氧化型甘露聚糖的制備反應按照圖I進行，反應步驟如下甘露聚糖以0. I M磷酸緩沖液(pH 6. 0)配成一定濃度的溶液，用0.01-1.0 M的高碘酸鈉于適當溫度氧化60分鐘，加入10 mL乙二醇于適當溫度再孵育30分鐘。反應產物加入透析袋以碳酸鹽緩沖液適當溫度下平衡透析5小時。3)目標化合物一抗癌制劑的制備氧化型甘露聚糖與Ad5-PTEN反應，將純化后的腺病毒Ad5-PTEN與一定濃度的氧化型甘露聚糖溶液混合，室溫孵育過夜，產物保存于一 80°C冰箱。五具體實施例方式 本發明制備的抗癌制劑，工藝簡單，反應步驟較少，我們依托本校科研平臺對這種抗癌制劑進行了動物試驗，臨床研究正在積極籌備中。已經進行的動物實驗主要步驟為(I)小鼠肝癌細胞H22接種小鼠；6天后，將動物隨機分為四組，每組10只小鼠，各組給藥情況如下(采用瘤內注射，體積 100 mL) I Ad5-PTEN ； II =Docetaxel ；III PBS ；IV :Man-Ad5_PTEN。給藥后每天用游標卡尺測量實體瘤長徑和短徑，按照公式V=0. 52'長徑’短徑’短徑，計算出各組每只動物的腫瘤體積和每組每一個測量點的平均值，第19天，繪出各組給藥后腫瘤體積增長曲線(圖2);處死各組小鼠，分離瘤塊，并稱重，結果見圖3。
六、有益效果
本發明涉及的抗肝癌制劑從腫瘤的發病機理入手，利用抑癌基因PTEN從根源上抑制腫瘤的生長，利用甘露聚糖修飾腺病毒表面，避免了腺病毒的免疫原性和毒性的產生，提高了腺病毒在體內的穩定性。將此新型抑癌制劑應用于荷瘤小鼠瘤內給藥，產生了顯著的腫瘤抑制效應。對附圖
的說明
圖I是甘露聚糖修飾腺病毒表面的反應過程 圖2是小鼠腫瘤生長體積變化曲線圖 圖3是荷瘤小鼠瘤塊重量比較圖
權利要求
1.一種具有抑制腫瘤生長的抗肝癌制劑Manan-Ad5-PTEN的組成要素，其特征是，中心要素包括抑癌基因PTEN，PTEN的表達載體腺病毒，以及對腺病毒進行表面修飾的化學物質甘露聚糖。
2.根據權利要求I所述的抗癌制劑Manan-Ad5-PTEN的制備方法，其特征是甘露聚糖以0. I M磷酸緩沖液(pH 6. 0)配成一定濃度的溶液，用0. 01-1. 0 M的高碘酸鈉于適當溫度氧化60分鐘，加入10 mL乙二醇于適當溫度再孵育30分鐘；反應產物加入透析袋以透析液適當溫度下平衡透析5小時；制備好的氧化型甘露聚糖與純化后的Ad5-PTEN反應，室溫孵育過夜，產物保存于-80°C冰箱。
3.根據權利要求I所述的抗癌制劑Manan-Ad5-PTEN的制備方法，其特征是所述的甘露聚糖溶液的濃度為20-50 mg/mL。
4.根據權利要求I所述的抗癌制劑Manan-Ad5-PTEN的制備方法,其特征是所述的適當溫度是4°C -30°C。
5.根據權利要求I所述的抗癌制劑Manan-Ad5-PTEN的制備方法,其特征是所述的透析液為碳酸鹽緩沖液(pH 6. 0 - 9. 0)。
全文摘要
本發明涉及一種可用于抑制小鼠腫瘤增長的抗肝癌制劑及其制備工藝。本發明的目的在于以腺病毒表達的PTEN抑癌基因為治療藥物，利用腺病毒載體高效轉導基因的優勢，通過化學方法對腺病毒表面進行修飾以避免其免疫原性和毒性的產生，制備一種從根源入手利用抑癌基因原理有效抑制腫瘤生長的新型的抗癌制劑，為惡性腫瘤的治療提供一種有效的治療途徑。本發明的抑肝癌制劑制備工藝簡單，不需要特殊的生產條件。
文檔編號C12N15/64GK102743766SQ20121024327
公開日2012年10月24日 申請日期2012年7月13日 優先權日2012年7月13日
發明者劉中兵, 李勁薇, 柯發敏, 鐘志容 申請人:鐘志容