專利名稱：生長因子基因藥物在應激性胃腸損傷防治中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及細胞生長因子基因藥物在應激性胃腸損傷防治中的應用，特別涉及低氧誘導因子-1 α (hypoxia-inducible factor-1 α，HIF-I α )和角質細胞生長因子(keratinocyte growth factor, KGF)的聯合在預防和/或治療應激性胃腸損傷疾病中的應用，更特別涉及其在預防和/或治療急性應激致胃腸損傷疾病中的應用。
背景技術：
胃腸黏膜是營養物質消化、吸收的重要場所，然而多種應激因素，包括病原微生物
因素、物理因素、化學因素、機械性因素等多種因素，作為應激源均易引起胃腸道黏膜損傷。同時胃腸黏膜屏障作為應激反應的中心器官之一，參與多種疾病的發生、發展和轉歸，其損傷的機制包括胃腸黏膜缺血、缺氧及氧自由基的損傷、細胞因子的損傷、腸道免疫功能受損和細胞凋亡。其中缺氧是造成胃腸黏膜損傷的關鍵，尤其是在高海抜地區，與低海抜地區相比，氣候有很大不同，低壓、缺氧、寒冷、干燥、輻射強、氣候多變，這些因素尤其是缺氧，對進入高海抜地區的人群造成不同程度的胃腸道應激性急性損傷。此外，由于氣候環境的影響，高海抜地區疾病的發生、發展具有獨特的特征，胃腸黏膜屏障參與多種高原疾病的發生、生發展和轉歸，其急性應激損傷后，輕者產生急性炎癥反應，影響動物營養物質的吸收，胃腸道菌群失調，產生毒素；重者，胃腸道黏膜形成潰瘍，甚至穿孔，從而嚴重影響人們的生活質量，甚至威脅人的生命。另外急性應激性胃腸道損傷常作為其他許多疾病的繼發癥狀出現，其對其他疾病的發展、轉歸有著重要的決定作用。總之，急性應激性胃腸道損傷對人類的健康造成了極大的威脅。因此胃腸道急性應激性損傷疾病的防治，尤其是高海拔胃腸道急性應激性損傷疾病的防治顯得至關重要。當前胃腸黏膜損傷的治療手段主要有抗生素、微生態制劑、腸外營養、中藥，雖然以上各種治療方法具有一定的治療效果，但未從源頭改變損傷部位缺氧環境；且由于胃腸黏膜屏障的損傷，吸收功能會大大降低，有效的藥效濃度很難控制和維持；使胃腸黏膜損傷的修復不盡如意。而對原本缺氧高海拔的環境下的胃腸應激損傷的防治更是顯得無力。因此，研究新型的、高效的防治胃腸應激性損傷的藥物尤其是防治高海抜胃腸應激性損傷的藥物成為當今生命科學亟待解決的問題。
發明內容
為了解決上述問題，即預防和/或治療胃腸道應激性損傷，本發明人作了不懈的努力。結果意外地發現，低氧誘導因子-la (HIF-Ia)和角質細胞生長因子(KGF)的聯合對于急性應激性胃腸道損傷性疾病具有甚為良好的治療效果。具體地說，本發明人發現，含有同時攜帶并可在真核細胞中表達HIF-Ia基因和KGF基因的重組載體的重組減毒沙門氏菌制劑在經ロ服之后，可以將HIF-I α基因和KGF基因兩者轉染到胃腸組織細胞，表達HIF-I α和KGF活性蛋白，從而對急性應激性胃腸道損傷性疾病特別是缺氧應激致胃腸道損傷性疾病及其他急性應激因素致胃腸道損傷性疾病起到良好的防治效果。此外，通過急進高海抜地區建立缺氧應激致胃腸道損傷模型，并通過ロ服含有同時攜帶并可在真核細胞中表達HIF-I α和KGF基因的重組載體的減毒沙門氏菌制劑進行治療，取得了良好的治療防治效果。此外，本發明人還發現，HIF-Ια和KGF的聯合對其他急性應激因素致胃腸道損傷如急性應激性潰瘍性結腸炎、急性應激胃潰瘍均具有良好的防治效果。基于以上發現，本發明人完成了以下發明。概括地說，本發明第一方面提供了 HIF-I α和KGF聯合用于制備預防和/或治療急性應激性胃腸道損傷性疾病的藥物中的用途。
在一個優選的實施方案中，所述HIF-I α和KGF以攜帶HIF-I α和KGF基因的重組質粒或重組減毒沙門氏菌的形式提供。本發明第二方面提供了ー種重組載體，其同時攜帶并可在真核細胞中表達HIF-I α基因和KGF基因。在一個優選的實施方案中，所述載體為同時攜帶并可在真核細胞中表達表達HIF-I α基因和KGF基因的pIRES質粒。本發明第三方面提供了ー種重組細菌，其含有本發明第二方面所述的重組載體。在一個優選的實施方案中，所述重組細菌為重組減毒沙門氏菌。本發明第四方面提供了ー種藥物組合物，其包含治療有效量的HIF-Ia和KGF，或者包含治療有效量的本發明第二方面所述的重組載體，或者包含治療有效量的本發明第三方面所述的重組細菌。在一個優選的實施方案中，所述藥物組合物為含有同時攜帶并可在真核細胞中表達HIF-I α和KGF基因的pIRES質粒或者含有所述質粒的重組減毒沙門氏菌Ty21a。通過采用本發明的重組質粒或者重組減毒菌，可以有效地治療急性應激性胃腸道損傷性疾病，特別是缺氧應激致胃腸道損傷性疾病，如高原應激反應、及其他急性的全身或胃腸道局部缺血缺氧性疾病引起的急性胃腸道損傷。
圖I示出KGF基因的PCR擴增產物的電泳結果。圖2示出pIRES-HIF-Ι α基因質粒酶切鑒定結果。圖中，M為250 bp DNA LadderMarker, I 為 piRES 質粒，2 為 pIRES-HIF-l α，3 為 Nhe I 酶 /Mlu I 酶酶切產物。圖3 示出 pIRES-HIF-1 a-KGF 酶切鑒定結果。圖中，M 為 250 bp DNA LadderMarker, I 為 piRES 質粒，2 為 pIRES-HIF-l a -KGF, 3 為 Xba I/Not I 酶酶切產物，4 為 Nhel酶/Mlu I酶酶切產物。圖4示出用重組減毒沙門氏菌TPHK治療的潰瘍性結腸炎大鼠的結腸的一般形態學觀察結果。圖5示出用重組減毒沙門氏菌TPHK防治的潰瘍性結腸炎大鼠的結腸的組織病理學觀察結果。圖6示出用重組減毒沙門氏菌TPHK防治的高海拔缺氧腸應激損傷大鼠的小腸的組織病理學觀察結果。圖7示出用重組減毒沙門氏菌TPHK防治的高海拔缺氧腸應激損傷大鼠的血漿丙ニ醛(MDA)的含量檢測結果。圖中，舞 vs N(^i，P<0.01;1#vsT(^i，P<0.01;fvsPTPH組，P < O. 01, · vsPTPK 組，P < O. 01 ;O vsTTPH 組，P < O. 05。圖8示出用重組減毒沙門氏菌TPHK防治的高海拔缺氧腸應激損傷大鼠的血漿超氧化物歧化酶(SOD)的活力檢測結果。圖中，來vs NC組，P < O. 01，合vsTC組，P < O. 01 ；ψ vsPTPH 組，P < O. 01, · vsPTPK 組，P < O. 01 ；# vsTTPH 組，P < O. 01, ★ vsTTPK 組，P
<O. 01。圖9示出用重組減毒沙門氏菌TPHK防治的高海拔缺氧腸應激損傷大鼠的腸組織中丙ニ醛(MDA)的含量檢測結果。圖中パ灰vs NC組，P < O. 01 ；φ vsTC組，P < O. 01 ；Q vsPTPH 組，P < O. 05, ψ' vsPTPH 組，P < O. 01 vsTTPH 組，P < O. 01, ★ vsTTPK 組，P
<O. 01。圖10示出用重組減毒沙門氏菌TPHK防治的高海拔缺氧腸應激損傷大鼠的腸組織
中超氧化物歧化酶(SOD)的活力檢測結果。圖中，U vsTTPH組，P < O. 05，來vs NC組，P
<O. 01，要 vsTC 組，P < O. 05 ;# vsTC 組，P < O. 01 ;擎 vsPTPH 組，P < O. 01， · vsPTPK組，P < O. 01 vsTTPH 組，P < O. 01, ★ vsTTPK 組，P < O. 01。圖11示出采用ELISA檢測用重組減毒沙門氏菌TPHK防治的高海拔缺氧腸應激損傷大鼠的腸組織中的KGF和HIF-Ia的表達結果。圖中，來vs NC組，P < O. 01，螽vsTC組，P < O. 01 灣 vsPTPH 組，P < O. 01, · vsPTPK 組，P < O. 01 ;φ vsTTPH 組，P < O. 05 ；#vsTTPH 組，P < O. 01, ★ vsTTPK 組，P < O. 01。圖12示出用重組減毒沙門氏菌TPHK防治的應激性胃黏膜潰瘍大鼠的胃的一般形態學觀察結果。圖13示出用重組減毒沙門氏菌TPHK防治的應激性胃黏膜潰瘍大鼠的胃的病例組織學觀察結果。圖 14-17 分別是是 pIRES、pIRES-HIF-l a、piRES-KGF, pIRES-HIF-l a -KGF 的質粒圖。序列說明SEQ ID NO :1 :人 HIF-1 α 正向擴增引物SEQ ID NO :2:人 HIF-I α 反向擴增引物SEQ ID NO 3 :人 HIF-1 a cDNA 序列SEQ ID NO :4 :人KGF正向擴增引物SEQ ID NO :5 :人KGF反向擴增引物SEQ ID NO :6 :人 KGF cDNA 序列SEQ ID NO :7 :重組質粒 pIRES-HIF-l α 序列SEQ ID NO 8 :重組質粒 pIRES-HIF-l a -KGF 序列SEQ ID NO 9 =CMV 正向擴增引物SEQ ID NO 10 CMV 反向擴增引物SEQ ID NO 11 :人 β-actin 正向擴增引物SEQ ID NO :12 :人 β -acti 反向擴增引物SEQ ID NO 13 :重組質粒 pIRES-KGF 序列
具體實施方式
如上所述，本發明人在尋求對急性應激性胃腸道損傷的治療和/或預防方法的過程中，意外地發現，低氧誘導因子-Ia即HIF-Ια和角質細胞生長因子即KGF的聯合對于急性應激性胃腸道損傷性疾病具有甚為良好的治療效果。因此在本發明第一方面，提供了 HIF-Ια和KGF聯合用于制備預防和/或治療急性應激性胃腸道損傷性疾病的藥物中的用途。“低氧誘導因子-1 α ” 或“ HIF-1 α，，是 Semenza (Semenza GL, Wang GLMol CellBiol，1992，12u2) :5447-5454. A nuclear factor induced by hypoxia via de novoprotein synthesis binds to the human erythropoietin gene enhancer at a siterequired for transcriptional activation.)于1992年在低氧誘導的肝細胞癌細胞株Hep3B細胞的核提取物中發現的ー種蛋白質，它能與人紅細胞生成素(erythropoietin，ΕΡ0)基因的V端增強子的寡核苷酸序列特異性結合，促進EPO轉錄。HIF-I屬于低氧誘導因子蛋白家族(HIF)。HIF-I α是受氧濃度調節的重要因子，在氧濃度低于6 %時(相
當于氧分壓在46 mmHg)，HIF- α成倍增加，迅速達到最大值，并與HIF-I β形成結構穩定的HIF-I分子。HIF-Ia隨著缺氧時間的延長而被大量激活。HIF-I是機體細胞在低氧環境中產生的一種結合DNA蛋白質因子，在低氧信號轉導中起到ー個重要的中介作用。在缺氧條件下，HIF促進對一系列的低氧反應基因(hypoxia repensive gene, HRG)(袁源、鐘竑.現代生物醫學進展.2010，10(5)961-963.缺氧誘導因子-1結構及功能的研究進展)進行轉錄調節，從而產生一系列的生理適應紅細胞生成增多，攜氧能力增強；血管再生和重建；糖酵解能力增強，使無氧條件下ATP生成增多，以滿足組織細胞的能量代謝，同時激活細胞的自嗷(autophagy) (Junichi Sadoshima. Landes Bioscience, 20084 (4), 402-403.ihe role of autophagy during ischemia/reperfusion ；Marco T,Luana S,Tahira A，etal.Landes Bioscience,2008,4(8) : 1042-1053. Induction of autophagic cell death bya novel molecule is increased by hypoxia ；Chen YQ, Elizabeth S. H, Jeannick C，etal.Landes Bioscience,20084(2) :195-204. Hypoxia induces autophagic cell death inapoptosis-competent cells through a mechanism involving BNIP3 ；Zhang HF，MartaBosch-M，Larissa A. S，et al. The journal of biological chemistry，2008，283(16)10892-10903. Mitochondrial Autophagy Is an HIF-l-dependent Adaptive MetabolicResponse to Hypoxia.),增強細胞在缺氧條件下的能力，為損傷腸粘膜的修復爭取更多的時間。“角質生長因子”或“KGF” 是由 Rubin (Rubin JS, Osada H, Finch Pff, Proc. Natl.Sci. U. S. A. 1989 86 :802-806. Acad.)等首先從人胚胎肺成纖維細胞M426的培養液中分離純化出來的細胞因子，具有促進小鼠角質細胞有絲分裂的作用。該因子從屬于成纖維細胞生長因子(FGF)家族，又稱為FGF-7。KGF是各種上皮組織來源細胞特異性的旁分泌介質，其主要活性是通過間質上皮相互交流的作用方式促進上皮細胞的増殖、移行、分化。KGF在整個胃腸系統中均有表達，具有刺激胃腸系統的上皮細胞的増殖和分化的功能，對保持胃腸系統粘膜的完整性和促進損傷修復有很重要的作用。早期體外研究顯示，KGF刺激角質細胞DNA合成的能力比轉化生長因子TGF-α和表皮生長因子EGF強2_10倍。而在上皮發生損傷時其表達量會迅速増加。將這兩種因子聯合起來，本發明人驚喜地發現，它們可以有效地治療急性應激性胃腸道損傷性疾病，并且與分別單獨使用所述兩種因子相比具有協同效應。正如下文實施例部分所詳細記載，在將HIF- α和KGF同時給予有潰瘍性結腸炎大鼠(參見實施例4、圖4和圖5)、高海拔缺氧應激腸損傷大鼠(參見實施例5、圖6、圖7、圖8、圖9和圖10)和應激性胃黏膜潰瘍大鼠(參見實施例6、圖12和圖13)后，其組織學宏觀和微觀結構和生化指標均得到顯著改善。本發明中使用的術語“低氧誘導因子-Ia ”或“ HIF-Ia ”可以是人的HIF-Ia，也可以是鼠或其它哺乳動物的HIF-I α。優選地，本發明的HIF-I α是人HIF-I α，包括人HIF-I α的ー個亞群。本領域技術人員清楚，“人HIF-I α ”具有本領域公知的含義。本發明中使用的術語“角質細胞生長因子”或“KGF”可以是人的角質細胞生長因子(hKGF)，也可以是鼠或其它哺乳動物的KGF。優選地，本發明的KGF是hKGF，包括人KGF的所有分類，例如亞類，亞組，亞群，亞族等。本領域技術人員清楚，“hKGF”具有本領域公知
的含義。本發明中使用的術語“預防”和“治療”具有它們一般意義上的含義。在一些實施方案中，HIF-I α和KGF以同時攜帶并可在真核細胞中表達HIF-I α和KGF基因的重組載體的形式提供。所述載體可以是同時攜帶并可在真核細胞中表達HIF-I α和KGF基因的質粒、噬菌體、病毒或粘粒等，優選質粒。在一個優選的實施方案中，所述質粒可以是氨芐青霉素抗性的真核表達質粒，例如本發明人自行改構的pIRES-HIF-l a -KGF(PHK)，或者其他攜帶并可表達HIF-I α和KGF基因的真核表達質粒如PCDNA3-HIF-1 a -KGF質粒。在ー個具體的實施方案中，所述質粒為PHK，其序列如SEQ ID N0:8所示。在另ー些實施方案中，HIF-I α和KGF以含有上述重組載體的重組細菌的形式提供。所述重組細菌是對人體無毒或者減毒的可直接將真核表達質粒帶入動物細胞內的細菌，包括但不限于減毒沙門氏菌、減毒雙歧桿菌、減毒大腸桿菌，優選沙門氏菌。本發明人發現，以沙門氏菌作為治療基因HIF-I α和KGF的載體，可以成功地實現這兩種蛋白在目標位點的表達。基因治療(gene therapy)是ー種新的治療手段，其被認為是21世紀醫療革命的關鍵。該治療方法是通過以下方式實現治療將治療性蛋白的功能基因導入患者體內，使之在其中表達，從而發揮治療作用。在這一方法中，合適載體的選擇是基因治療成敗的關鍵。本發明人針對腸道寄生有大量菌群的獨特微環境，選用沙門氏菌作為基因治療的載體，成功地將功能基因導入體內并實現其表達。沙門氏菌為一群寄生于人和動物腸道內的無芽孢、革蘭氏陰性直桿菌，可引起人和動物腸熱癥、胃腸炎、敗血癥等。減毒后的沙門氏菌仍保持對腸粘膜組織的強親嗜性。減毒沙門氏菌通過侵襲派伊爾結(Payer' s pathches,PPs)下的濾泡相關上皮中的M細胞，M細胞對其進行吞飲，進而穿過小腸上皮屏障進入細胞內。此外，減毒沙門氏菌還可以被樹突狀細胞(Dendritic cell, DC)直接攝取進入機體(Fournier B, Williams IR, GewirtzAT, et al Infect Immun,2009 ；77 (9) :4121-4129. Toll-like receptor 5-dependentregulation of inflammation in systemic Salmonella enterica Serovar typhimuriuminfection.) 0且減毒沙門氏菌已被實驗性地用做外源抗原基因載體，并已初步證明能直接將真核表達質粒攜帶進入動物細胞內，表達相應的蛋白(Chen D, Guo ff, Xu Z, at clSheng Wu Gong Cheng Xue Bao,2009,25(3) :341-347. Construction of a dual-promoterexpression plasmid delivered by Salmonella choleraesuis C500)。因此，特別優選地沙門氏菌，所述重組細菌為包含上述重組載體的減毒沙門氏菌。在ー個具體的實施方案中，所述重組細菌為本發明人構建的包含同時攜帶并可在真核細胞中表達HIF-I α和KGF基因真核表達質粒(序列如SEQ ID NO 8所示)的減毒沙門氏菌Ty21a 的菌株 Ty21a-pIRES-HI F_l a -KGF (TPHK)。本發明的TPHK具備對胃腸道黏膜的親嗜功能，因此在給予到胃腸道之后，其更容易停留于此，并在此表達治療性HIF-I α和KGF蛋白。因此，與直接給予蛋白或質粒相比，給予本發明的TPHK可以延長給藥間隔，減少給藥次數，更有針對性。另外，由于蛋白或質粒的制備、純化和保存相對繁瑣、昂貴，因此采用本發明的TPHK可以更為經濟地實現對胃腸道損傷的防治。再有，TPHK只在局部分泌KGF和HIF-I α，無進入血流而引起誘發腫瘤的危險的顧慮。在本發明中，本發明采用急進高原建立高海拔缺氧腸應激損傷模型以及急性應激性結腸炎模型和急性應激性胃潰瘍模型，通過灌胃給予TPHK進行治療，驗證了治療效果。在本發明中，所述急性應激性胃腸道損傷性疾病特別是缺氧應激致胃腸道損傷性疾病可以為高原應激反應及其他急性的全身或胃腸道局部缺血缺氧性疾病繼發引起的的急性胃腸道損傷；所述的高海拔缺氧應激致胃腸道損傷性疾病還可以是直接的急進高海抜缺氧應激致胃腸道黏膜損傷。所述其他急性應激性胃腸道損傷性疾病特別是急性應激性潰瘍性結腸炎、急性應激胃潰瘍，可以為物理的如射線、化學的如各種有機農藥及微生物毒素、微生物的如各種胃腸道致病菌等因素以及極端環境因素如缺氧、高寒或其他的突發事件如地震作為應激源引起的急性胃腸道損傷性疾病。在本發明第二方面，提供了ー種重組載體，其同時攜帶并可在真核細胞中表達HIF-I α 和 KGF 基因。所述載體可以是同時攜帶并可在真核細胞中表達HIF- α和KGF基因的質粒、噬菌體、病毒或者粘粒，但優選質粒。在一個優選的實施方案中，所述質粒可以是氨芐青霉素抗性的真核表達質粒，例如本發明人自行改構的pIRES-HIF-l a -KGF(PHK)，或者其他攜帶并可在真核細胞中表達HIF-Ia和KGF基因的真核表達質粒如pAH質粒。在ー個具體的實施方案中，所述質粒為PHK，其序列如SEQ ID N0:8所示。所述HIF-I α可以是人的HIF_1 a，也可以是鼠或其它哺乳動物的HIF-I α。優選地，本發明的HIF-I α是人HIF-1 a，包括人HIF-I α的ー個亞群。所述KGF可以是人的角質細胞生長因子(hKGF)，也可以是鼠或其它哺乳動物的KGF0優選地，本發明的KGF是hKGF，包括人KGF的所有分類，例如亞類，亞組，亞群，亞族等。在本發明第三方面，提供了ー種重組細菌，其含有本發明第二方面所述的重組載體。所述重組細菌可以是含有本發明第二方面所述的重組載體的減毒沙門氏菌或者對人體無毒或者減毒的可直接將真核表達質粒帶入動物細胞內的其他細菌，所述其他細菌包括但不限于減毒的雙歧桿菌、減毒的大腸桿菌。所述重組細菌為含有本發明第二方面所述的重組載體的減毒沙門氏菌。在ー個具體的實施方案中，所述重組細菌為本發明人構建的含有同時攜帶并可在真核細胞中表達HIF-I α和KGF基因的真核表達質粒(序列如SEQID Ν0:8 所示)的減毒沙門氏菌(Ty21a)的菌株 Ty21a-pIRES-HIF_l a-KGF (TPHK)。所述HIF-I α可以是人的HIF-1 α，也可以是鼠或其它哺乳動物的HIF-I α。優選地，本發明的HIF- α是人HIF-1 a，包括人HIF-I α的ー個亞群。所述KGF可以是人的角質細胞生長因子(hKGF)，也可以是鼠或其它哺乳動物的KGF0優選地，本發明的KGF是hKGF，包括人KGF的所有分類，例如亞類，亞組，亞群，亞族等。本發明的TPHK具備對胃腸道黏膜的親嗜功能，因此在給予到胃腸道之后，其更容易停留于此，并在此表達治療性HIF-I α和KGF蛋白。因此，與直接給予蛋白或質粒相比，給予本發明的TPHK可以延長給藥間隔，減少給藥次數，更有針對性。另外，由于蛋白或質粒的制備、純化和保存相對繁瑣、昂貴，因此采用本發明的TPHK可以更為經濟地實現對胃腸道損傷的防治。再有，TPHK只在局部分泌KGF和HIF-1 a，無進入血流而引起誘發腫瘤的
危險的顧慮。本發明人認為，KGF具有促進腸黏膜損傷修復功能，HIF-I α在缺氧條件下誘導分泌一系列的低氧反應元件，調節機體低氧適應性，增強細胞的耐受能力，為修復創造時間，兩者聯合應用具有治療效果。在本發明中，本發明采用急進高原建立高海拔缺氧腸應激損傷模型以及急性應激性結腸炎模型和急性應激性胃潰瘍模型，通過灌胃給予TPHK進行治療，驗證了治療效果。在本發明第四方面，提供了ー種藥物組合物，其包含治療有效量的HIF-I α和KGF，或者包含治療有效量的本發明第二方面所述的重組載體，或者包含治療有效量的本發明第三方面所述的重組細菌。所述載體可以是同時攜帶并可在真核細胞中表達HIF-I α和KGF基因的質粒、噬菌體、病毒或粘粒等，但優選質粒。在一個優選的實施方案中，所述質粒可以是氨芐青霉素抗性的真核表達質粒，例如本發明人自行改構的pIRES-HIF-l a -KGF(PHK)，或者其他攜帶并可在真核細胞中表達HIF-Ia和KGF基因的真核表達質粒如pAH質粒。在ー個具體的實施方案中，所述質粒為PHK，其序列如SEQ ID N0:8所示。所述重組細菌可以是包含本發明第二方面所述的重組載體的減毒沙門氏菌或者對人體無毒或者減毒的可直接將真核表達質粒帶入動物細胞內的其他細菌，所述其他細菌包括但不限于減毒的雙歧桿菌、減毒的大腸桿菌。所述重組細菌為包含本發明第二方面所述的重組載體的減毒沙門氏菌。在ー個具體的實施方案中，所述重組細菌為本發明人構建的含有同時攜帶并可在真核細胞中表達HIF-I α和KGF基因真核表達質粒(序列如SEQ IDNO 8 所示)的減毒沙門氏菌 Ty21a 的菌株 Ty21a-pIRES-HIF_l a -KGF (TPHK)。所述HIF-I α可以是人的HIF-1 α，也可以是鼠或其它哺乳動物的HIF-I α。優選地，本發明的HIF- α是人HIF-1 a，包括人HIF-I α的ー個亞群。所述KGF可以人的角質細胞生長因子(hKGF)，也可以是鼠或其它哺乳動物的KGF。優選地，本發明的KGF是hKGF，包括人KGF的所有分類，例如亞類，亞組，亞群，亞族等。文所使用的“治療有效量”指的是足以預防或改善胃腸道損傷的量。治療有效量或劑量將取決于患者的年齡、性別及體重，以及患者的當前醫療狀況。本領域技術人員能夠依據本公開以及這些和其他因素來確定合適的劑量。例如，對于包含所述重組細菌的藥物組合物，所述重組細菌的治療有效量為5X 106-5X IO9 cfu/kg，優選為1-9X108 cfu/kg。
任選地，所述藥物組合物還可以包含可藥用輔助劑，例如賦形劑、穩定劑、防腐剤、載體等。在一個優選的實施方案中，所述藥物組合物為ロ服膠囊制劑。根據本發明，所述藥物組合物可以有效地預防和/或治療急性應激性胃腸道損傷性疾病特別是缺氧應激致胃腸道損傷性疾病，例如高原應激反應以及其他急性的全身或胃腸道局部缺血性疾病引起的胃腸道損傷疾病；高海拔缺氧應激致胃腸道損傷性疾病還可以是直接的急進高海拔缺氧應激致胃腸道黏膜損傷。所述其他急性胃腸道損傷性疾病包括急性應激性潰瘍性結腸炎、急性應激胃潰瘍，可以為物理的如射線、化學的如各種有機農藥及微生物毒素、微生物的如各種胃腸道致病菌等因素以及高原應激如高海拔各種特殊的自然環境因素或其他的突發事件作為應激源引起的急性胃腸道損傷性疾病。通過本發明，可以更科學、更有效地治療急性應激性胃腸道損傷性疾病。在目前針對急性應激性胃腸道損傷性疾病特別是缺氧應激致胃腸道損傷性疾病臨床治療不盡如意的情況下，本發明提供了一種新的治療途徑，并且比以往的治療手段更為科學、療效更明確。
實施例下面通過具體實施例進ー步說明本發明。但是，應當理解為，這些實施例僅僅是用于更詳細具體地說明之用，而不應理解為用于以任何形式限制本發明。這些實施例描述了攜帶并可表達HIF-I α和KGF基因的重組質粒或重組減毒沙門氏菌的制備以及急性應激性胃腸道損傷性疾病的治療作用，以進ー步闡述本發明。本發明對試驗中所使用到的材料以及試驗方法進行一般性和/或具體的描述。雖然為實現本發明目的所使用的許多材料和操作方法是本領域公知的，但是本發明仍然在此作盡可能詳細描述。本領域技術人員清楚，在下文中，如果未特別說明，本發明所用材料和操作方法是本領域公知的。實施例I.重組減毒沙門氏菌SPH的構津與制備I. HIFl a cDNA 的克隆按文獻報道(MiyazawaK, et al BBRC，1989，163 :967-973 ；Nakamura T, etal. Progress in Growth Factor Research 1991,3:67-85)的人低氧誘導因子 hypoxiainducible factor-1 α , HIFl α ) cDNA序列設計引物，并在正向引物中引入Nhe I酶切位點，反向引物中引入Mlu I酶切位點。正向引物的寡核苷酸序列為5' -cat gctagc caccga ttc accatg gag ggc~3/ (SEQ ID NO :1),反向引物的寡核苷酸序列為 5' -gtc acgcgttea gtt aac ttg ate caa age tctg-3' (SEQ ID NO :2)。在本文中，如果未特別說明，所提及引物均為Takara公司所合成。用25ml的細胞培養瓶1640培養基(Gibco)于三氣培養箱37°C 5% CO2條件下，誘導培養Hela細胞，細胞生長貼壁率達到80%時，棄去培養液。每瓶細胞用PBS(PH=7.4)沖洗I次，各加Iml Trizol裂解5min左右，加200 μ I氯仿，充分顛倒混勻，靜置5min,4 °C 12000rpm 離心 IOmin,轉移上清至 DEPC (diethypyrocarbonate,焦碳酸ニ こ酷)水處理過的I. 5ml EP管，加5倍體積的冰無水こ醇_20°C沉淀過夜。次日，4°C 12000rpm離心lOmin，棄去こ醇超凈臺吹干，加入20 μ I DEPC水完全融解RNA。取I μ I RNA加入DEPC水99 μ I (100倍稀釋)，紫外分光光度計下測OD26。及OD28tl。計算OD26tl / OD28。的比值，留取比值在I. 8-2. O的樣本進行逆轉錄。根據公式RNA 濃度(μ g / ml) =OD260X40X 100,計算 RNA 的濃度 O. I μ g / μ I,
并進行電泳檢測。取10 μ I總RNA進行反轉錄，合成CDNA (方法參見PrimcScrippRT
reagent Kit (Perfect Real Time)試劑盒(購自Takara公司)操作說明)。反應體系RNA(I μ g) 10 μ I, 5XPrimeScript TM buffer 4 μ I, Random 6 mers (100 μ Μ) I μ I, OligodT Primer (50 μ Μ) I μ I,PrimeScript TM RT Enzyme Mix I I μ I,無 RNase 水補足 20 μ I。反應參數:37°C，15min，85°C 5s。將合成的cDNA分別以上述特異引物(SEQ ID No 1和SEQ ID NO :2，)和人
β-actin引物(SEQ ID NO :11和SEQ ID No 12)進行PCR擴增，鑒定cDNA模板質量。HIF-Ia反應體系:cDNA模板10μ l，HIF-la上游引物(20 μ Μ)和下游引物(20 μ Μ)各2μ 1，TaKaRa Taq (5U / μ I) O. 5 μ 1，dNTP (各 2. 5mM) 4 μ 1，10 XPCR buffer 5μ1，滅菌蒸餾水補足50μ I反應條件退火溫度，94°C預變性5min ;94°C變性30s，60°C退火30s，72°C延伸3min, 30 個循環；最后 72°C 延伸 lOmin。β -actin 反應體系cDNA 模板 10μ 1，β -aetin上游引物(20 μ Μ)和下游引物(20 μ Μ)各 2μ1，TaKaRa Taq (5U / μ 1)0. 5 μ 1，dNTP (各2. 5mM) 4 μ I, IOXPCR buffer 5 μ I,滅菌蒸懼水補足50 μ I。反應條件94°C預變性5min ;94°C變性30s，60°C退火30s，72°C延伸lmin，30個循環；最后72°C延伸IOmin0 1%瓊脂糖電泳，擴增出HIF-Ia在大約2500bp左右處有ー特異條帶，β -actin在大約200bp處有ー很亮的特異性條帶，如圖I所示。測定人HIF-Ia cDNA序列(上海生エ生物工程技術服務公司)。將測得的人HIF-IacDNA序列與文獻報道的人HIF-Ia cDNA序列進行比較分析。結果表明，克隆的人HIF-I αcDNA序列與文獻報道的人HIF-1 a cDNA序列完全一致，其序列如SEQ ID NO 3所示。2.攜帶人HIF- α基因的質粒的構津在上述電泳膠中切掉2500_3000bp的條帶，用回收試劑盒(TIANgel MidiPurification Kit,購自 TIANGEN 公司)回收。用 Nhe I (購自 Takara)和 Mlu I 酶(購自Takara)酶對pIRES載體(獸研所惠贈，其質粒圖如圖14所示)進行酶切，然后將其與上述PCR產物進行連接，連接反應體系純化的PCR產物2 μ L，載體1.5 μ L，Solution I0. 5yL, T4連接酶I μ L，滅菌蒸餾水補足10yL，16°C連接12h。所得的重組質粒命名為pIRES-HIF-l α，其質粒圖如圖15所示。測定人重組質粒pIRES-HIF-l α序列(上海生エ生物工程技術服務公司)，如SEQID NO 7 所示。3.攜帶HIF- α基因的減毒沙門氏菌菌株的制備3. I電穿孔轉化將減毒沙門氏菌Ty21a (購于北京生物制品檢定所，編號50218)凍存菌液50 μ L接種于5ml不含抗生素的LB培養液，震蕩培養至對數生長中期(菌液A值約0. 4)，4°C條件下，4000r. min-1離心收集菌體，用預冷的無菌去離子水洗滌細胞2次，洗滌后的細菌懸于Iml冰預冷的無菌去離子水。用電穿孔法(Μμ Itiporator 4308 Eppendorf電轉儀)將pIRES-HIFl α質粒0. 2 μ g轉化200 μ L預處理的減毒沙門氏菌。電穿孔條件電壓2. 5kV,電容25 μ F，電阻200 Ω，放電時間O. 5s。加入SOC培養基1ml，37°C輕柔震蕩培養45min,涂布于含氨節青霉素(lOOmg. L-1)固體LB培養基平皿,37°C培養16h后各挑取2個菌落進行鑒定。3. 2陽性工程菌的篩選從培養板各挑取2個單菌落，分別接種于3mL含氨芐青霉素的LB培養液中，37°C震搖培養。轉入pIRES-HIFla質粒的減毒沙門氏菌菌株的篩選通過氨芐青霉素抗性、PCR (利用菌液為模板，擴增真核表達啟動子CMV及目的基因HIFl a )及提取質粒后通過Nhe 1/Mlu I雙酶切鑒定；轉入pIRES的減毒沙門氏菌菌株的篩選通過卡那霉素抗性及PCR篩選(利用菌液為模板，擴增真核表達啟動子CMV)。擴增真核表達啟動子CMV的引物為上游 5' -CCC agt aca tga cct tat ggg-31 (SEQ ID NO :9)，下游 5' -gga gac ttg gaaate ccc gt-3' (SEQ ID NO :10)，PCR 參數為94で 30sec,55°C 30sec,72°C lmin，循環數
為 30，72°C延伸 5min。擴增 HIFl α 的引物為 SEQ ID NO :1 和 SEQ ID NO :2。PCR 參數為94°C 60sec,55°C 60sec,72°C 90sec，循環數為 30，72で延伸 7min。3. 3工程菌TPH的制備將攜帶HIFl α基因真核表達載體的減毒沙門氏菌菌種(TPH)接種于含氨芐青霉素(O. lmg/mL)的LB培養基中，35 37oC 8% C02培養箱中培養24h做為一代菌種，將ー代菌種接種至含完全培養基的克氏瓶中擴大培養做為ニ代菌種，并在無菌條件下取一代菌種和ニ代菌種樣涂片，革蘭氏染色后顯微鏡下可見呈革蘭氏陰性桿菌，長鏈多，菌形一致。將ニ代克氏瓶菌種刮于IOOmL滅菌生理鹽水菌種瓶中，比濁結果為1.7X1010f/mL，30L發酵罐發酵12h后3000 r/min離心20min,收集菌體73g,加入70mL脫脂牛奶充分混勻，置于不銹鋼盤中冷凍干燥，制備成無菌干粉約26g。實施例2.攜帶KGF基因的重組減毒沙門氏菌(Ty21a-DlRES_KGF (TPK))的構津與制備I. KGF cDNA 的克降按文獻報道(RubinJS, et al Proc Natl Acad Sei USA1989. 86 :302-306 ；FinchPff,et al Science 1989,245(49 19) :752-755)的人 KGF cDNA 序列設計引物，在正向引物中引入Xbal酶切位點，反向引物中引入NotI酶切位點。正向引物的寡核苷酸序列為5’-TATTCTCAGAATGAGCTATGATTACATGGAAG-3’ (SEQ ID NO :4)，反向引物的寡核苷酸序列為 5’_GACGCGGCCGCTTAAGTGATTGCCATAGGCAG-3’ (SEQ ID NO :5)。從人胎盤 cDNA文庫(購自 Clontech)克隆人角質細胞生長因子(KGF)基因。反應體系模板cDNAly 1，KGF上游引物(20 μ M)和下游引物(20 μ Μ) # I μ I, dNTP 3 μ 1，10XPCR buffer 5 μ I,TaKaRa Taq(5U/ μ 1)0. 5 μ 1，滅菌蒸餾水補足50 μ I。PCR參數為94°C預變性5min ;94°C變性30s，56°C退火30s，72°C延伸lmin，30個循環；最后72°C延伸lOmin。然后，將PCR產物進行電泳。電泳結果參見圖2。測定人KGF cDNA序列(上海生エ生物工程技術服務公司)。將測得的人KGF cDNA序列與文獻報道的人KGF cDNA序列進行比較分析。結果表明，克隆的人KGF cDNA序列與文獻報道的人KGF cDNA序列完全一致，其序列如SEQ ID N0:6所示。2.攜帶人KGF基因的質粒的構津在上述電泳膠中切掉400bp左右的條帶，用回收試劑盒(TIANgel MidiPurif ication Kit,購自 TIANGEN 公司)回收。用 Xba I (購自 Takara)和 Not I 酶(購自Takara)酶對pIRES載體進行酶切，然后將其與上述PCR產物進行連接，連接反應體系純化的PCR產物2 μ L，載體I. 5 μ L，溶液I O. 5 μ L，Τ4連接酶I μ L，滅菌蒸餾水補足10 μ L，16°C連接12h。所得的重組質粒命名為pIRES-KGF，其質粒圖如圖16所示。測定人重組質粒pIRES-KGF序列(上海生エ生物工程技術服務公司)，如SEQ IDNO 13所示。3.攜帶KGF基因的減毒沙門氏菌菌株的制備3. I電穿孔轉化將減毒沙門氏菌Ty21a(購于北京生物制品檢定所，編號50218)凍存菌液50 μ L接種于5ml不含抗生素的LB培養液，震蕩培養至對數生長中期(菌液A值約O. 4)，4°C條
件下，4000r. min-1離心收集菌體，用預冷的無菌去離子水洗滌細胞2次，洗滌后的細菌懸于Iml冰預冷的無菌去離子水。用電穿孔法(Μμ Itiporator 4308 Eppendorf電轉儀)將pIRES-KGF質粒O. 2 μ g轉化200 μ L預處理的減毒沙門氏菌。電穿孔條件電壓2. 5kV，電容25 μ F，電阻200 Ω，放電時間O. 5s。加入SOC培養基1ml，37°C輕柔震蕩培養45min，涂布于含氨芐青霉素(lOOmg. L-1)固體LB培養基平皿，37°C培養16h后各挑取2個菌落進行鑒定。3. 2陽性工程菌的篩選從培養板各挑取2個單菌落，分別接種于3mL含氨芐青霉素的LB培養液中，37°C震搖培養。轉入pIRES-KGF質粒的減毒沙門氏菌菌株的篩選通過氨芐青霉素抗性、PCR(利用菌液為模板，擴增真核表達啟動子CMV及目的基因KGF)及提取質粒后通過XbaL和Not I雙酶切鑒定；轉入pIRES的減毒沙門氏菌菌株的篩選通過卡那霉素抗性及PCR篩選(利用菌液為模板，擴增真核表達啟動子CMV)。擴增真核表達啟動子CMV的引物為SEQ ID NO 9和SEQID NO 10, PCR 參數為94°C 30sec，55°C 30sec，72°C lmin，循環數為 30，72°C延伸 5min。擴增 KGF 的引物為 SEQ ID NO :4 和 SEQ ID NO :5。PCR 參數為94°C 60sec，55°C 60sec,72°C 90sec，循環數為 30，72°C延伸 7min。3.3工程菌TPK的制備將攜帶KGF基因真核表達載體的減毒沙門氏菌菌種(TPK)接種于含氨芐青霉素(0. lmg/mL)的LB培養基中，于35_37°C、8% C02培養箱中培養24h做為一代菌種，將一代菌種接種至含完全培養基的克氏瓶中擴大培養做為ニ代菌種，并在無菌條件下取一代菌種和ニ代菌種樣涂片，革蘭氏染色后顯微鏡下可見呈革蘭氏陰性桿菌，長鏈多，菌形一致。將ニ代克氏瓶菌種刮于IOOmL滅菌生理鹽水菌種瓶中，比濁結果為I. TXlOVmLf/mLdOL,酵罐發酵12h后40000r/min離心20min，收集菌體70g，加入70mL脫脂牛奶充分混勻，置于不銹鋼盤中冷凍干燥，制備成無菌干粉約20g。實施例3.攜帶HIF-I α基因和KGF基因的重組減毒沙門氏菌(Ty2la-pIRES-HIFl a -KGF (TPHK))的構津與制備I.攜帶人KGF和HIF-I α雙基因質粒的構建將實施例2中KGF基因的PCR產物切膠回收，與pIRES-HIF-l α載體的Xba I和Not I (均購自Takara)雙酶切產物連接，并將所得重組質粒命名為pIRES_HIF_l a -KGF,其質粒圖如圖17所示。測定人HIFl a cDNA序列(上海生エ生物工程技術服務公司)。所得pIRES-HIF-l a -KGF 的序列如 SEQ ID NO 8 所示。3.含有真核表達質粒pIRES-HIF-l a -KGF的減毒沙門氏菌菌株(Ty21a-pIRES-HIFl a -KGF (TPHK))的篩選與制備3. I.電穿孔轉化將減毒沙門氏菌Ty21a凍存菌液50 μ L接種于5ml不含抗生素的LB培養液，震蕩培養至對數生長中期(菌液A值約O. 4)，4°C條件下，4000r. mirT1離心收集菌體，用預冷的無菌去離子水洗滌細胞2次，洗滌后的細菌懸于Iml冰預冷的無菌去離子水。用電穿孔法(Multiporator 4308 Eppendorf 電轉儀)將 pIRES-HIF-l a -KGF 質粒 O. 2 μ g 轉化 200 μ L經預處理的減毒沙門氏菌。電穿孔條件電壓2. 5kV，電容25 μ F，電阻200 Ω，放電時間
0.5s。加入SOC培養基lml，37°C輕柔震蕩培養45min，涂布于含氨芐青霉素(lOOmg.じ1)固體LB培養基平皿，37°C培養16h后各挑取2個菌落進行鑒定。3. 2.陽件工程菌菌株 Tv21a-pIRES-HIF-l a -KGF 的篩詵從培養板各挑取2個單菌落，分別接種于3mL含氨芐青霉素O. lmg/ml的LB培養液中，37°C在ZD-85恒溫振蕩器(國華企業)搖菌擴增培養。轉入pIRES-HIF-l a -KGF的減毒沙門氏菌菌株的篩選通過氨芐青霉素抗性、PCR(利用菌液為模板，擴增真核表達啟動子CMV及目的基因HIF-I α和KGF)及提取質粒后Xba I/Notl酶或Nhel/Mlu I酶酶切鑒定(圖3)。擴增真核表達啟動子CMV的引物為SEQ ID NO :9和SEQ ID N0:10;PCR參數為:94°C預變性30sec ;55°C變性30sec，72°C延伸lmin，30個循環；72°C延伸5min。擴增 HIF-I α 的引物 SEQ ID NO :1 和 SEQ ID NO :2。PCR 參數為94°C變性 60sec，55°C退火60sec，72°C延伸 90sec，30 個循環；72°C延伸 7min。擴增 KGF 的引物為 SEQ ID NO :4 和 SEQID NO :5，PCR 參數為:94°C預變性 5min ;94°C變性 30s，56°C退火 30s，72°C延伸 lmin, 30 個循環；72°C延伸lOmin。HIF-I α反應體系菌液模板10μ l，HIF_la上游引物(20 μ M)和下游引物(20 μ Μ)各 2μ I, dNTP 4μ 1,10XPCR buffer 5 μ LTaKaRa Taq (5U/ μ 1)0. 5 μ 1，滅菌蒸餾水補足 50μ1。退火溫度 64°C，94°C 5min ;94°C 30s, 60 °C 30s, 72 °C 3min。將篩選的陽性工程菌株命名為Tyl21 a -pIRES-HIFl a -KGF(簡稱ΤΡΗΚ)。3.工程菌 Ty21a-pIRES-HIF-l a -KGF 的制備將攜帶HIF-I α基因和KGF基因的真核表達載體的減毒沙門氏菌菌種(Ty21a-pIRES-HIF-l a -KGF)接種于含氨芐青霉素(0. lmg/ml)的LB培養基中，于35-37°C,8% CO2培養箱中培養24h，作為一代菌種。將一代菌種接種至含完全培養基的克氏瓶中擴大培養，作為ニ代菌種。在無菌條件下取一代菌種和ニ代菌種樣涂片，革蘭氏染色后顯微鏡下可見呈革蘭氏陰性桿菌，長鏈多，菌形一致。將ニ代克氏瓶菌種刮于IOOmL滅菌生理鹽水菌種瓶中，比濁結果為I. 7X 101°個/mL，30L發酵罐發酵12_14h后4000r/min離心20min。收集菌體70g，加入70mL脫脂牛奶充分混勻，置于不銹鋼盤中冷凍干燥，制備成無菌干粉約20g。實施例4.重組減毒沙門氏菌TPHK治療大鼠潰瘍性結腸炎的效果觀察I.實驗動物及模型Wistar健康大鼠50只，體重180_220g，清潔級，由甘肅中醫學院動物中心(SPF)提供。50只Wistar大鼠實驗前禁食不禁水48h，隨機取40只大鼠于第3天使其吸入こ醚麻醉。于仰臥位將ー根聚こ烯管(直徑約2mm)經肛門插入腸道,深度8cm。將150mg/kg 2,4,6-三硝基苯橫酸(2,4,6-trinitro picrylsulfonic acid, TNBS)與 50% こ醇等體積溶液(V/V)注入腸道，保持肛門高位5min，以防止液體流出。余下的10只大鼠以等量生理鹽水取代TNBS灌腸液灌腸，其余過程均相同。2.動物分組及治療將TNBS灌腸的40只大鼠隨機分為5組TPHK治療組、TPK治療組、TPH治療組、模型對照組(TC組)。生理鹽水灌腸大鼠設為正常對照組(NC組)，每組50只。灌腸后第3天開始灌胃治療，隔日一次，每只O. 5ml菌液，連續給藥3次。TPK、TPH、TPHK菌液分別接種于含氨節青霉素O. lmg/ml的LB培養基中在恒溫振蕩器中搖菌擴增,9h后收集菌體,PBS洗滌后，用100g/L NaHCO3溶液懸浮，調整細菌數為2 X IO9Cfu (菌落形成単位)/mL，立即灌胃。模型對照組和正常對照組給予同體積100g/L NaHC03。 3.樣品采集和處理連續灌胃3次，次日3%戊巴比妥鈉40mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，仰臥位固定于操作板上，之后常規碘酒、酒精消毒腹部皮膚，無菌開腹。取自距回盲部5 IOcm以上部分的小腸樣品2cm用于病理組織學測定。4.病理組織學檢測操作步驟大鼠處死后立即取小腸標本10%中性福爾馬林固定24hI脫水24h后,石臘包埋、切片I脫蠟ニ甲苯I、ニ甲苯 II 各 IOmin ;ニ甲苯 IIIlOminI水化無水こ醇I、無水こ醇11、95%こ醇、85%こ醇各IminI流水沖洗I復染蘇木素lmin，清水沖洗I分化I %的酒精鹽酸涮幾下，清水沖洗I返藍10%氨水IOsec清水沖洗I伊紅液(95 %こ醇溶液)I 3minI脫水85%こ醇、95%こ醇、無水こ醇I、無水こ醇II各2minI透明ニ甲苯I、ニ甲苯II、ニ甲苯III各2min
I封片樹脂封片I光學顯微鏡觀察分析。4. I 一般形態學觀察NC組大鼠腸管黏膜皺襞紋理清晰，未見糜爛及潰瘍。TC組大鼠腸管變粗，腸壁部分甚至膨脹巨大變薄，腸管黏膜壞死組織，潰瘍及糜爛面的上面有灰黒色膜狀物附著，其附
近黏膜充血、水腫明顯。TPH和TPK治療組較模型組有所改善，但大鼠腸壁仍有輕度充血。TPHK治療組較TC組和TPH、TPK治療組在形態上均有顯著改善(圖4)。4. 2組織學觀察光鏡下觀察大鼠結腸組織可見，NC組黏膜、腺體結構清晰，黏膜下血管豐富；TC組黏膜糜爛、剝脫程度較重，潰瘍數量多，潰瘍面大，黏膜及黏膜下層有大量炎性細胞浸潤，腺體破壞，組織壞死，未見明顯增生現象；TPK和TPH治療組與TC組比較結腸黏膜炎癥充血、水腫、炎性細胞浸潤程度減輕，潰瘍面縮小；ΤΡΗΚ組較其他各組結腸黏膜炎癥充血、水腫、炎性細胞的浸潤明顯降低，潰瘍面顯著縮小或完全消失，腸腺增生，潰瘍底部可見黏膜下層有新生肉芽組織增生，且有豐富的毛細血管增生(圖5)。5.實驗結論本實驗觀察到TPHK對Wistar大鼠潰瘍性結腸炎難愈合創面修復有良好的促進作用，表現在能明顯減輕TNBS誘發潰瘍性結腸炎模型大鼠的癥狀及炎癥，促進黏膜上皮細胞的再生，加快損傷部位血運的重建，對已形成的黏膜損傷及潰瘍有促修復作用。實施例5.重組TPHK治療大鼠高海拔缺氧腸應激損傷的效果觀察I.材料I. I主要試劑3%戊巴比妥鈉、丙ニ醛(MDA)測試盒(南京建成)、超氧化物歧化酶(SOD)測試盒(南京建成)、KGF ELISA檢測試劑盒(R&D) ,HIFl ELISA檢測試劑盒(R&D)。I. 2實驗動物Wistar大鼠，質量為200_220g，雄性大鼠，清潔級，由蘭州大學動物實驗中心提供。I. 3實驗菌株減毒沙門氏菌(Ty21a)、攜帶HIF- α基因的減毒沙門氏菌(TPH)、攜帶KGF基因的減毒沙門氏菌(TPK)、攜帯人HIF-I α基因和KGF的減毒沙門氏菌(TPHK)，后三者按照上述實施例制備。I. 4 儀器酶聯免疫檢測儀(南京華東電子集団醫療裝備有限責任公司)紫外/可見分光光度計(uvlOOl，上海天美科學儀器有限公司)Electronic Balance(AUW120D, SHIMADZU CORPORATION JANPAN)80-2離心機(上海手術機械廠)MM-2A微型振蕩器(北京市長風儀器儀表公司)超速低溫臺式離心機(Heraeus,德國)。Olympus BX5ITF 光學顯微鏡(日本 Olympus 公司)
P310型數碼相機(日本Olympus公司)97-1型磁力加熱攪拌器(江蘇周莊科研儀器廠)熱恒溫水浴箱(上海醫療器械七廠)ZD-85恒溫振蕩器(國華企業)2.方法2. I動物分組及防治健康雄性Wistar大鼠64只，體重200 220克。動物購進后在本單位動物實驗室
飼養I周，適應后投入實驗。隨機分為TPHK治療組(TTPHK組),PTHK預防組(PTPHK組)、TPH治療組(TTPH組)、TPH預防組(PTPH組)、TPK治療組(TTPK組)、TPK預防組(PTPK組)、模型對照組(TC組)和正常對照組(NC組)，每組8只動物。將TPK、TPH和TPHK菌種分別接種于含氨芐青霉素O. lmg/ml的LB培養基中震蕩培養，8h后收集菌液，PBS洗滌后，用10%的NaHCO3溶液懸浮，調整細菌數為lX109cfu/ml，灌胃。TTPH組、TTPK組和TTPHK組建模后開始灌胃IO9Cfu/只，每隔一天灌胃一次，共4次，7天后處死大鼠；PTPH組、PTPK組和PTPHK組于建模前第3天開始灌胃IO9Cfu/只，每隔I天灌胃I次，共4次，7天后處死；R組于建模4天后處死；C組于建模第4天處死。2. 2模型制作采用急進海拔為3800m的馬銜山之后通過腸系膜上動脈缺血再灌注(I/R)建立高海抜缺氧應激致大鼠腸黏膜損傷模型。具體操作大鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉40mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，仰臥位固定于操作板上，消毒后取腹正中切ロ長約3cm，用溫鹽水紗布將腸管推向左側腹腔，暴露右腎內上方的腸系膜根部，找到腸系膜上動脈(superior mesenteric artery, SMA)SMA),在其根部用無創傷血管夾夾閉阻斷SMA 60min，造成腸缺血模型，然后松夾，再灌注60min，之后關閉腹腔，并腹腔注射IOml/生理鹽水。2. 3樣品采集和處理依據上述指定時間，用3%戊巴比妥鈉麻醉大鼠心臟采血5ml :常規碘酒、酒精消毒腹部皮膚，無菌開腹，全血離心(4°C /1000rpm/20min)后分裝血漿，_80°C冰箱保存備用于生化分析、S0D、MDA檢測。小腸組組織樣品取自距回盲部5-lOcm以上部分，2cm用于組織病理學學測定，IOcm在液氮中凍存，用于ELISA測定。3.結果3. I臟器功能的檢測血漿AST (天門冬氨酸轉氨酶)、ALT (丙氨酸氨基轉移酶)、BUN (尿素)、UREA (肌酐)、CK-MB (肌酸激酶同エ酶)使用7170自動生化分析儀測，結果如下(表I)。
權利要求
1.HIF-I α和KGF聯合用于制備預防和/或治療急性應激性胃腸道損傷性疾病的藥物中的用途。
2.權利要求I的用途，其中所述HIF-Ia和KGF以同時攜帶并可在真核細胞中表達HIF-I a和KGF基因的重組真核表達質粒的形式提供。
3.權利要求2的用途，其中所述重組真核表達質粒為pIRES-HIF-1a -KGF(PHK)，其序列如SEQ ID NO 8所示。
4.權利要求I的用途，其中所述HIF-Ia和KGF以含有權利要求2所述的重組真核表 達質粒并可直接將所述重組真核表達質粒帶入動物細胞內的重組細菌的形式提供。
5.權利要求4的用途，其中所述重組細菌為減毒沙門氏菌或者對人體無毒或者減毒的可直接將真核表達質粒帶入動物細胞內的其他細菌，所述其他細菌包括但不限于減毒的雙歧桿菌、減毒的大腸桿菌。
6.權利要求5的用途，其中所述減毒沙門氏菌為含有PIRES-HIF-1a -KGF質粒的Ty21a 菌株，即 TPHK, pIRES-HIF-l a -KGF 質粒的序列如 SEQ ID NO 8 所示。
7.權利要求1-6任ー項的用途，其中所述HIF-Ia和KGF是人源HIF_1a和KGF或者鼠或其他哺乳動物的HIF-I a和KGF，優選人源HIF-I a和KGF。
8.權利要求I的用途，其中所述急性應激性胃腸道損傷性疾病是缺氧應激致胃腸道損傷性疾病，包括高海拔缺氧應激致胃腸道損傷性疾病以及其他急性應激性胃腸道損傷疾病；所述高海拔缺氧應激致胃腸道損傷性疾病包括直接的急進高海拔缺氧應激致胃腸道黏膜損傷。
9.權利要求8的用途，其中所述其他急性應激性胃腸道損傷性疾病包括急性應激性潰瘍性結腸炎、急性應激胃潰瘍，還包括物理的如射線、化學的如各種有機農藥及微生物毒素、微生物的如各種胃腸道致病菌等因素以及高原應激如高海拔各種特殊的自然環境因素或其他的突發事件作為應激源引起的急性胃腸道損傷性疾病。
10.一種重組真核表達質粒，其同時攜帶并可在真核生物中表達HIF-I a和KGF基因。
11.權利要求10的重組真核表達質粒，其中所述載體為pIRES-HIF-1a -KGF(PHK)，其序列如SEQ ID NO 8所示。
12.權利要求10或11的重組真核表達質粒，其中所述HIF-Ia和KGF基因是人源HIF-Ia和KGF或者鼠或其他哺乳動物的HIF-I a和KGF，優選人源HIF_1 a和KGF。
13.—種重組細菌，其含有權利要求10-12任一項所述的重組真核表達質粒并可直接將所述真核表達質粒帶入動物細胞內。
14.權利要求13所述的重組細菌，其中所述重組細菌為減毒沙門氏菌或者對人體無毒或者減毒的可直接將真核表達質粒帶入動物細胞內的其他細菌，所述其他細菌包括但不限于減毒的雙歧桿菌、減毒的大腸桿菌。
15.權利要求14的重組細菌，其中所述減毒沙門氏菌為所述減毒沙門氏菌為含有pIRES-HIF-1 a -KGF 質粒的 Ty21a 菌株，即 TPHK, pIRES-HIF-l a -KGF 的序列如 SEQ ID NO 8所示。
16.權利要求13至15任一項的重組細菌，其中所述HIF-Ia和KGF為人源HIF-Ia和KGF或者鼠或其他哺乳動物的HIF-I a和KGF，優選人源HIF_1 a和KGF。
17.ー種藥物組合物，其包含治療有效量的HIF-I a和KGF，或者包含治療有效量的權利要求10-12任一項所述的重組真核表達質粒，或者包含治療有效量的權利要求13-16任一項所述的重組細菌。
18.權利要求17的藥物組合物，用于治療急性應激性胃腸道損傷性疾病特別是缺氧應激致胃腸道損傷性疾病可以為高原應激反應、及其他急性的全身或胃腸道局部缺血缺氧性疾病引起的急性胃腸道損傷；所述的高海拔缺氧應激致胃腸道損傷性疾病還可以是直接的急進高海拔缺氧應激致胃腸道黏膜損傷。
19.權利要求18的藥物組合物，其中所述其他急性應激性胃腸道損傷性疾病特別是急性應激性潰瘍性結腸炎、急性應激胃潰瘍，可以為物理的如射線、化學的如各種有機農藥及微生物毒素、微生物的如各種胃腸道致病菌等因素以及高原應激如高還發各種特殊的自然環境因素或其他的突發事件作為應激源引起的急性胃腸道損傷性疾病。
20.權利要求17-19任一項的藥物組合物，其中還包含可藥用輔助劑，例如賦形劑、穩定劑、防腐劑、載體。
21.權利要求17-20任一項的藥物組合物，其中所述藥物組合物為ロ服膠囊制劑。
全文摘要
本發明涉及預防和/或治療急性應激性胃腸道損傷性疾病的細胞生長因子基因藥物，HIF-1α和KGF基因在制備用于預防和/或治療急性應激性胃腸道損傷性疾病的藥物中的用途。本發明還涉及包含所述HIF-1α和KGF的藥物組合物。本發明可以有益地預防和/或治療急性應激性胃腸道損傷性疾病。
文檔編號C12R1/19GK102813941SQ201210263919
公開日2012年12月12日 申請日期2012年7月27日 優先權日2012年7月27日
發明者哈小琴, 楊志華, 彭俊華, 鄧芝云, 董菊子, 趙勇, 張媛媛 申請人:厚樸生物科技(蘇州)有限公司