確定樣品纖維素酶活性的方法

專利名稱：確定樣品纖維素酶活性的方法
技術領域：
本發明涉及生物化工領域，更具體地，本發明涉及樣品纖維素酶活性的方法。
背景技術：
纖維素降解與相關微生物纖維素酶活力密切相關。目前，國際上比較通用的測定纖維素酶活力的方法是1987年T.K. Ghose發表在Pure & Appli. Chem上的《纖維素酶活力的測定方法》，是國際純化與應用化學聯合會(IUPAC)頒布的權威方法，通過參照將其并入本文。其基本原理是纖維素酶水解纖維素產生的纖維二糖、葡萄糖等還原糖能將堿性條件下的3，5- 二硝基水楊酸(DNS)還原，生成棕紅色的氨基化合物,在540nm波長處有最大光吸收，在一定范圍內還原糖的量與反應液的顏色強度呈比例關系，利用比色法測定其還原糖生成的量就可測定纖維素酶的活性。其中葡聚糖內切酶的活性可通過羧甲基纖維素鈉 (carboxymethyl cellulose sodium,CMC)酶活測定方法檢測,全酶(包括葡聚糖內切酶、葡聚糖外切酶和3 -葡萄糖苷酶)的活性可通過濾紙(相當于纖維素)酶活測定法檢測。然而，目前確定纖維素酶活性的方法仍有待改進。

發明內容
本發明是基于發明人的下列發現而完成的目前CMC酶活測定方法的國際標準體系含有0. 5ml酶、0. 5ml2重量％CMC、3ml DNS和20ml蒸餾水。濾紙酶活測定方法的國際標準體系包括0. 5ml酶、Iml PH4. 8的0. 05M醋酸鈉-醋酸緩沖液(在本文中，有時簡稱為“醋酸緩沖液”)、IcmX 6cm濾紙、3ml DNS和20ml蒸餾水。為了操作方便，在具體研究或技術發明中，大都以上述國際標準方法為基礎進行一些調整。如關于CMC酶活測定方法，有研究采用96孔板120 u I體系，其包括30 ill酶、30 u 12%CMC和60 ill DNS。關于濾紙酶活測定方法，有研究采用96孔板200 U I體系，其包括20 ill酶、40 u 10. 05M醋酸緩沖液、直徑7mm濾紙圓片和120 u I DNS,在DNS顯色后吸出顯色溶液36 u 1+160 u I蒸餾水，測A540值。然而，當需要進行大規模、高通量的纖維素酶活測定時，傳統的反應體系則比較耗時費力。本發明旨在至少在一定程度上解決上述技術問題之一或至少提供一種有用的商業選擇。為此，本發明的一個目的在于提出一種具有能夠有效確定樣品纖維素酶活性的方法。根據本發明實施例的確定樣品纖維素酶活性的方法包括在反應容器中，將待測樣品與纖維素酶底物混合；將所述反應容器置于適于纖維素酶作用的條件下，持續第一預定時間；向所述反應容器中加入顯色底物，并將所述反應容器置于適于顯色的條件下，持續第二預定時間；確定所述反應容器中的葡萄糖含量；基于所述葡萄糖含量，確定所述樣品的纖維素酶活性。利用根據本發明實施例的方法，能夠有效地確定樣品的纖維素酶活性。根據本發明的實施例，利用根據本發明實施例的確定樣品纖維素酶活性的方法與利用國際標準方法(IU)針對同一種同一濃度的商品酶，所測定的酶活結果一致。與現有的其它方法相t匕，根據本發明實施例的確定樣品纖維素酶活性的方法能同時測定CMC酶活和濾紙酶活，測定的酶活值與國際標準方法(IU)測定結果一致，具有可靠性，并且穩定性好。根據本發明實施例的確定樣品纖維素酶活性的方法，反應與顯色測定在相同的容器，例如同一塊96孔板上進行，不需要更換反應容器，操作簡單，測定樣品和試劑用量少、測定速度快，能同時測定大量樣品，實現高通量。另外，根據本發明的實施例，上述確定樣品纖維素酶活性的方法還可以具有下列附加技術特征在本發明的一個實施例中，反應容器為96孔板。在本發明的一個實施例中，纖維素酶底物為選自濾紙和含有羧甲基纖維素鈉的溶液的至少一種。在本發明的一個實施例中，濾紙的尺寸為6X10平方毫米，含有羧甲基纖維素鈉 的溶液含有2重量％的羧甲基纖維素鈉和0. 05M的醋酸緩沖液，其pH值為4. 8。在本發明的一個實施例中，纖維素酶底物為含有羧甲基纖維素鈉的溶液，反應容器為96孔板，其中，在反應容器中，將待測樣品與纖維素酶底物混合進一步包括在96孔板的至少一個孔中，首先加入50微升待測樣品，然后加入50微升所述含有羧甲基纖維素鈉的溶液。在本發明的一個實施例中，反應容器為96孔板，纖維素酶底物為濾紙，其中，在反應容器中，將待測樣品與纖維素酶底物混合進一步包括在96孔板的至少一個孔中，依次加入50微升待測樣品和50微升pH4. 8,0. 05M的醋酸緩沖液；以及將所述濾紙浸入所得到的混合溶液中。在本發明的一個實施例中，反應容器為96孔板，將反應容器置于適于纖維素酶作用的條件下，持續第一預定時間進一步包括將96孔板置于50攝氏度下，保持20-100分鐘。在本發明的一個實施例中，所述顯色底物為含有3，5- 二硝基水楊酸的溶液。在本發明的一個實施例中，所述含有3，5- 二硝基水楊酸的溶液含有I. 4重量％的3，5- 二硝基水楊酸，0. 28重量％的苯酚，0. 07重量％的亞硫酸鈉，28重量％的酒石酸鉀鈉和I. 4重量％的氫氧化鈉。在本發明的一個實施例中，反應容器為96孔板，其中，將反應容器置于適于顯色的條件下，持續第二預定時間進一步包括將96孔板置于80-110攝氏度下，保持5分鐘。在本發明的一個實施例中，確定反應容器中的葡萄糖含量是通過在540nm波長下測定吸光值，并利用葡萄糖標準曲線而確定的。在本發明的一個實施例中，葡萄糖標準曲線是利用一系列已知濃度的葡萄糖溶液確定的。根據本發明實施例的確定樣品纖維素酶活性的方法，可以具有下列優點至少之I、根據本發明實施例的確定樣品纖維素酶活性的方法，可以同時適用于測定纖維素CMC酶活和濾紙酶活。2、根據本發明實施例的確定樣品纖維素酶活性的方法，可以采用96孔板作為反 應容器，由此，可以設置空白組，并且空白組與實驗組可以在同一塊96孔板上，整個操作都在同一塊96孔板中進行。不需要更換反應容器，操作簡單，測定樣品和試劑用量少、測定速度快，能同時測定大量樣品，實現高通量。3、根據本發明實施例的確定樣品纖維素酶活性的方法，酶及底物加入量適當，測定濾紙酶活在同一塊96孔板上，不需要稀釋，并且實驗操作過程中帶來的誤差更小，能符合大部分實驗室的實驗條件。4、根據本發明實施例的確定樣品纖維素酶活性的方法，操作方便。測定速度快(針對CMC酶活測定，可以為30分鐘，針對濾紙酶活，可以為60分鐘)，并且適用 于測定大量樣品，能實現聞通量。5、根據本發明實施例的確定樣品纖維素酶活性的方法的測定數值與國際標準一致，測定準確，并且誤差小，重現性好。本發明的附加方面和優點將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發明的實踐了解到。


本發明的上述和/或附加的方面和優點從結合下面附圖對實施例的描述中將變得明顯和容易理解，其中圖I顯示了國標纖維素酶濾紙酶活計算所采用的標準曲線；圖2顯示了國標纖維素酶CMC酶活計算所采用的標準曲線；以及圖3顯示了根據本發明實施例的纖維素酶酶活計算所采用的標準曲線。
具體實施例方式下面詳細描述本發明的實施例。下面通過參考附圖描述的實施例是示例性的，旨在用于解釋本發明，而不能理解為對本發明的限制。在本文中所使用的術語“第一”、“第二”僅用于描述目的，而不能理解為指示或暗示相對重要性或者隱含指明所指示的技術特征的數量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隱含地包括一個或者更多個該特征。在本發明的描述中，“多個”的含義是兩個或兩個以上，除非另有明確具體的限定。本發明是基于發明人的下列發現而完成的目前CMC酶活測定方法的國際標準體系含有0. 5ml酶、0. 5ml2重量％CMC、3ml DNS和20ml蒸餾水。濾紙酶活測定方法的國際標準體系包括0. 5ml酶、Iml pH4. 8的0. 05M醋酸鈉-醋酸緩沖液(在本文中，有時簡稱為“醋酸緩沖液”)、IcmX 6cm濾紙、3ml DNS和20ml蒸餾水。為了操作方便，在具體研究或技術發明中，大都以上述國際標準方法為基礎進行一些調整。如關于CMC酶活測定方法，有研究采用96孔板120 u I體系，其包括30 ill酶、30 u I 2°/(0 和60111 DNS。關于濾紙酶活測定方法，有研究采用96孔板200 體系，其包括20 ill酶、40 ill 0. 05M醋酸緩沖液、直徑7_濾紙圓片和120 u I DNS,在DNS顯色后吸出顯色溶液36ia+160ia蒸餾水，測A54tl值。然而，當需要進行大規模、高通量的纖維素酶活測定時，傳統的反應體系則比較耗時費力。根據本發明實施例，本發明提出了一種確定樣品纖維素酶活性的方法。根據本發明的實施例，該方法包括下列步驟
首先，在反應容器中，將待測樣品與纖維素酶底物混合。根據本發明的實施例，進行酶活確定的反應容器的類型并不受特別限制，可以根據需要來進行確定。根據本發明的實施例，可以采用的反應容器為96孔板。由此，可以適應高通量測定的需要，并且可以方便地采用PCR儀作為酶解反應和顯色反應的溫度控制設備，可以采用酶標儀作為檢測吸光度的設備，從而可以有效地提高確定纖維素酶活性的方法的效率。由此，可以設置空白組，并且空白組與實驗組可以在同一塊96孔板上，整個操作都在同一塊96孔板中進行。不需要更換反應容器，操作簡單，測定樣品和試劑用量少、測定速度快，能同時測定大量樣品，實現高通量。根據本發明的實施例，可以采用的纖維素酶底物的類型并不受特別限制，只要含有可以被纖維素酶降解的物質即可。在本發明的一個實施例中，所述纖維素酶底物可以為選自濾紙和含有羧甲基纖維素鈉的溶液的至少一種。由此，可以確定濾紙酶活以及CMC酶活。在本發明的一個實施例中，濾紙的尺寸為6 X 10平方毫米，含有羧甲基纖維素鈉的溶液含有2重量％的羧甲基纖維素鈉和0. 05M的醋酸緩沖液，其pH值為4. 8。由此，可以進一 步提高測定濾紙酶活和CMC酶活的效率。根據所采用的纖維素酶底物類型的不同，將待測樣品與纖維素酶底物混合的方法可以有所調整。在本發明的一個實施例中，所述纖維素酶底物為含有羧甲基纖維素鈉的溶液，其中，在反應容器中，將待測樣品與纖維素酶底物混合進一步包括在96孔板的至少一個孔中，首先加入50微升待測樣品，然后加入50微升所述含有羧甲基纖維素鈉的溶液。在本發明的一個實施例中，所述纖維素酶底物為濾紙，其中，在反應容器中，將待測樣品與纖維素酶底物混合進一步包括在96孔板的至少一個孔中，依次加入50微升待測樣品和50微升pH4. 8,0. 05M的醋酸緩沖液；以及將所述濾紙浸入所得到的混合溶液中。發明人驚奇地發現，通過采用根據本發明實施例的混合方法，能夠有效地提高確定纖維素酶活性的效率。現有96孔板120 u I體系測定CMC酶活，底物加入量為30 ill 2重量％的CMC，因其黏度較大，因而容易造成誤差。現有96孔板200 U I體系測定濾紙酶活為國標的等比例縮小，測定過程需在兩塊96孔板上進行，即需要將DNS顯色后的溶液轉移到另一塊96孔板中進行稀釋，并且酶和底物的反應體積為(20 ill酶+40 ill緩沖液)，該體系不僅能帶來操作誤差，而且加入濾紙后，因濾紙吸水，會造成酶與底物接觸不充分，最終得到的結果不精確。根據本發明實施例的確定樣品纖維素酶活性的方法，酶及底物加入量比較合適，測定濾紙酶活在同一塊96孔板上，不需要稀釋，并且實驗操作過程中帶來的誤差更小，能符合大部分實驗室的實驗條件。接下來，將所述反應容器置于適于纖維素酶作用的條件下，持續第一預定時間，以便使得在樣品中所包含的纖維素酶發揮作用，將纖維素酶底物進行分解，得到葡萄糖。根據本發明的實施例，進行酶解反應的條件并不受特別限制。根據本發明的實施例，可以在50攝氏度下進行酶解反應。在本發明的一個實施例中，將所述反應容器置于適于纖維素酶作用的條件下，持續第一預定時間進一步包括將96孔板置于50攝氏度下，保持20-100分鐘。根據本發明的實施例，針對不同類型的纖維素酶底物，可以采用不同的反應時間，例如針對CMC酶活測定，可以采用在50攝氏度下保持30分鐘，針對濾紙酶活測定，可以采用在50攝氏度下保持60分鐘。由此，根據本發明實施例的確定樣品纖維素酶活性的方法，操作方便。測定速度快(針對CMC酶活測定，可以為30分鐘，針對濾紙酶活，可以為60分鐘)，并且適用于測定大量樣品，能實現高通量。
接著，向所述反應容器中加入顯色底物，并將所述反應容器置于適于顯色的條件下，持續第二預定時間，以便使得纖維素酶分解產物可以作用于顯色底物，從而可以通過測定顯色程度，例如通過吸光度的測定，來確定反應容器中葡萄糖的濃度變化，進而確定樣品的纖維素酶活性。根據本發明的實施例，可以采用的顯色底物的類型并不受特別限制，根據本發明的實施例，在本發明的一個實施例中，所述顯色底物為含有3，5-二硝基水楊酸的溶液。在本發明的一個實施例中，所述含有3，5- 二硝基水楊酸的溶液含有I. 4重量％的3，5- 二硝基水楊酸，0. 28重量％的苯酚，0. 07重量％的亞硫酸鈉，28重量％的酒石酸鉀鈉和1.4重量％的氫氧化鈉。由此，可以進一步提高確定纖維素酶活性的效率。在本發明的一個實施例中，所述反應容器為96孔板，其中，將所述反應容器置于適于顯色的條件下，持續第二預定時間進一步包括將所述96孔板置于80-110攝氏度下，保持5分鐘。接下來，確定所述反應容器中的葡萄糖含量。根據本發明的實施例，確定反應容器中所產生葡萄糖含量的方法并不受特別限制。在本發明的一個實施例中，確定所述反應容器中的葡萄糖含量是通過在540nm波長下測定吸光值，并利用葡萄糖標準曲線而確定的。由此，可以進一步提聞確定匍萄糖含量的效率，從而進一步提聞確定纖維素酶活性的效率。
其中，根據本發明的實施例，葡萄糖標準曲線可以按照下列方法確定配制lmg/ml的無水葡萄糖溶液(葡萄糖事先于105°C干燥3 4h)，分別取該無水葡萄糖溶液0、20、40、60、80、100111加入到96孔板中，對應加入蒸餾水100、80、60、40、20、
0U I ;然后加入配制好的DNS試劑100 u 1，沸水浴5min后冰浴冷卻；最后轉移到酶標板中混勻，540nm下分別測其對應的OD值。然后以吸光值A為橫坐標，以葡萄糖含量為縱坐標繪制標準曲線。最后，基于所述葡萄糖含量，確定所述樣品的纖維素酶活性。利用根據本發明實施例的方法，能夠有效地確定樣品的纖維素酶活性。根據本發明的實施例，在得到反應容器中葡萄糖含量之后，可以根據下列公式對樣品纖維素酶活性進行量化
II--
CI) FPUZral= Ymg ( 5.55 fimoie/mg) ( 60min )( Xml )；
-(鑛齡⑷聊-賴忐其中，纖維素酶底物為濾紙時，適用公式(I)。在公式(I)中，FPU/ml為所測酶在制備時稀釋度下的酶活。Ymg為在標準曲線方程中樣品吸光值A54tl對應的葡萄糖mg數。5. 55 ii mole/mg為Img葡萄糖的iimoles數。60min為反應時間。X ml為測定纖維素酶時加入的酶液體積，即0. 5ml。其中，當纖維素酶底物為含有羧甲基纖維素鈉的溶液時，適用公式(2)。在公式(2)中，CMC/ml為所測酶在制備時稀釋度下的酶活。Ymg為在標準曲線方程中樣品吸光值Am。對應的葡萄糖mg數。5. 55 ii mole/mg為Img葡萄糖的y moles數。30min為反應時間。X ml為測定纖維素酶時加入的酶液體積，即0. 5ml。根據本發明的實施例，利用根據本發明實施例的確定樣品纖維素酶活性的方法與利用國際標準方法(IU)針對同一種同一濃度的商品酶，所測定的酶活結果一致。與現有的其它方法相比，根據本發明實施例的確定樣品纖維素酶活性的方法能同時測定CMC酶活和濾紙酶活，測定的酶活值與國際標準方法(IU)測定結果一致，具有可靠性，并且穩定性好。根據本發明實施例的確定樣品纖維素酶活性的方法，反應與顯色測定在相同的容器，例如同一塊96孔板上進行，不需要更換反應容器，操作簡單，測定樣品和試劑用量少、測定速度快，能同時測定大量樣品，實現高通量。下面通過具體實施例，對本發明進行解釋。需要說明的是，下列實施例僅僅是說明性的，并不以任何方式限制本發明。另外，下列實施例中所采用的所有儀器、材料等均為市售可得的，如在下列實施例中沒有明確指出的操作，可以通過本領域技術人員常規的操作方法進行。一般方法 實驗材料纖維素酶為實驗室商品酶；2重量％的CMC (利用pH4. 8,0. 05M醋酸緩沖液配制)作底物；DNS配方為I. 4重量％的3，5- 二硝基水楊酸，0. 28重量％的苯酚，0. 07重量％的亞硫酸鈉，28重量％的酒石酸鉀鈉(Rochelle salt)和I. 4重量％的氫氧化鈉，實驗前一周配制，避光保存。檢測波長為540nm。I、標準曲線的制作配制lmg/ml的無水葡萄糖溶液，葡萄糖事先于105°C烘3 4h，分別取無水葡萄糖溶液0、20、40、60、80、100111加入到96孔板中，對應加入蒸餾水100、80、60、40、20、0111 ；然后加入配制好的DNS試劑IOOiU,沸水浴5min后冰浴冷卻；最后轉移到酶標板中混勻，540nm下測其對應的OD值。然后以吸光值A為橫坐標，以葡萄糖含量為縱坐標繪制標準曲線。結果見圖3。圖3顯示了本發明的確定樣品纖維素酶活性的方法中纖維素酶酶活計算所采用的標準曲線。II、CMC 酶活實驗方法I、配制0. 05mg/ml的待測酶液，然后向96孔板的12個孔中分別添加50 U 1，其中6個孔作為實驗組，另外6個孔為對照組。2、向對照組的各孔中均加入100 U I DNS,然后將96孔板放入PCR儀50°C、10分鐘滅活空白對照組中的酶。3、在實驗組和對照組中，均分別加入50 U 12重量％CMC(利用pH4. 8,0. 05M醋酸緩沖液配制)，將96孔板放入PCR儀50°C、30分鐘進行酶解反應。4、在實驗組中加入100 ill DNS, PCR儀99. 9°C、5分鐘進行顯色反應。5、溫度降至室溫后,將IOOii 196孔板中的溶液用酶標僅測定A54。。6、根據葡萄糖標準曲線(見圖3)計算葡萄糖含量。III、濾紙酶活實驗方法I、配制0. 5mg/ml的待測酶液，然后向96孔板的12個孔中分別添加50 yl，其中6個孔作為實驗組，另外6個孔為對照組。2、向對照組的各孔中均加入100 u I DNS,然后將96孔板放入PCR儀50°C、IOmin滅活空白對照組中的酶。3、在實驗組和對照組中，均分別加入50iU pH4. 8,0. 05M醋酸緩沖液，并加入6 X IOmm2濾紙置于PCR儀50°C、60min進行反應。4、在實驗組中加入IOOiU DNS，PCR儀99. 9°C、5min進行顯色。
5、溫度降至室溫后，將100 U 196孔板中的溶液轉移至酶標板,用酶標儀測定A54(l。6、根據葡萄糖標準曲線(見圖3)計算葡萄糖含量。IV、酶活定量在得到反應容器中葡萄糖含量之后，可以根據下列公式對樣品纖維素酶活性進行量化
權利要求
1.一種確定樣品纖維素酶活性的方法，其特征在于，包括 在反應容器中，將待測樣品與纖維素酶底物混合； 將所述反應容器置于適于纖維素酶作用的條件下，持續第一預定時間； 向所述反應容器中加入顯色底物，并將所述反應容器置于適于顯色的條件下，持續第二預定時間； 確定所述反應容器中的葡萄糖含量；以及 基于所述葡萄糖含量，確定所述樣品的纖維素酶活性。
2.根據權利要求I所述的方法，其特征在于，所述反應容器為96孔板。
3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述纖維素酶底物為選自濾紙和含有羧甲基纖維素鈉的溶液的至少一種。
4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于， 所述濾紙的尺寸為6X 10平方毫米， 所述含有羧甲基纖維素鈉的溶液含有2重量％的羧甲基纖維素鈉和0. 05M的醋酸緩沖液，其PH值為4.8。
5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，所述纖維素酶底物為含有羧甲基纖維素鈉的溶液， 其中，所述在反應容器中，將待測樣品與纖維素酶底物混合進一步包括 在96孔板的至少一個孔中，首先加入50微升待測樣品，然后加入50微升所述含有羧甲基纖維素鈉的溶液。
6.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，所述纖維素酶底物為濾紙， 其中，所述在反應容器中，將待測樣品與纖維素酶底物混合進一步包括 在96孔板的至少一個孔中，依次加入50微升待測樣品和50微升pH4. 8,0. 05M的醋酸緩沖液；以及 將所述濾紙浸入所得到的混合溶液中。
7.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，將所述反應容器置于適于纖維素酶作用的條件下，持續第一預定時間進一步包括 將所述96孔板置于50攝氏度下，保持20-100分鐘。
8.根據權利要求I所述的方法，其特征在于，所述顯色底物為含有3，5-二硝基水楊酸的溶液。
9.根據權利要求8所述的方法，其特征在于，所述含有3，5-二硝基水楊酸的溶液含有I.4重量％的3，5- 二硝基水楊酸，0. 28重量％的苯酚，0. 07重量％的亞硫酸鈉，28重量％的酒石酸鉀鈉和I. 4重量％的氫氧化鈉。
10.根據權利要求9所述的方法，其特征在于，所述反應容器為96孔板，其中， 將所述反應容器置于適于顯色的條件下，持續第二預定時間進一步包括 將所述96孔板置于80-110攝氏度下，保持5分鐘， 任選地，確定所述反應容器中的葡萄糖含量是通過在540nm波長下測定吸光值，并利用葡萄糖標準曲線而確定的， 任選地，所述葡萄糖標準曲線是利用一系列已知濃度的葡萄糖溶液確定的。
全文摘要
本發明提出了一種確定樣品纖維素酶活性的方法。該方法包括在反應容器中，將待測樣品與纖維素酶底物混合；將所述反應容器置于適于纖維素酶作用的條件下，持續第一預定時間；向所述反應容器中加入顯色底物，并將所述反應容器置于適于顯色的條件下，持續第二預定時間；確定所述反應容器中的葡萄糖含量；以及基于所述葡萄糖含量，確定所述樣品的纖維素酶活性。利用該方法，能夠有效確定樣品的纖維素酶活性。
文檔編號C12Q1/34GK102796806SQ20121026426
公開日2012年11月28日 申請日期2012年7月27日 優先權日2012年7月27日
發明者楊金龍, 鄭儀, 程書, 張耕耘 申請人:深圳華大基因研究院, 深圳華大基因科技有限公司