專利名稱：具有寬廣pH活性纖維素酶及其制備方法
技術領域：
本發明涉及到生物遺傳領域，具體涉及一種來源于深海真菌Phaeosphaeriasp. LH21的具有寬廣pH活性纖維素酶及其制備方法。
背景技術：
纖維素酶是一種由三種不同酶構成的復雜體系，具體分為內切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶及葡聚糖苷酶。微生物是纖維素酶的主要來源。真菌纖維素酶一般在酸性pH條件下具有生物活性，可應用于飼料行業、生物乙醇的生產等，但也有例外，一些真菌纖維素酶也可以在中堿性PH條件下具有纖維素酶活性，例如來源于特異腐質霉、熱白絲菌的纖維素酶，具有生物石洗功能，達到起花作用，立體感強。由于中堿性纖維素酶受到越來越多 的關注，一些研究者集中于細菌纖維素酶的研究，比如，芽孢桿菌、鏈霉菌的一些纖維素酶最適pH為中堿性，能耐受較高的pH，其中芽孢桿菌堿性纖維素酶已經應用于洗滌劑行業，可以除去織物表面的纖維絨毛，讓織物看起來艷麗，起到除舊返新的效果。有很多纖維素酶的基因被克隆了，由于細菌基因組中不含有內含子，能夠快捷分離其纖維素酶基因，而相對于真菌纖維素酶的基因來說，要快速分離到其纖維素酶基因，難度相對來說更大，相關的專利也就較少，報道最多的是里氏木霉纖維素酶，它能協同水解纖維素，其效率較高，其中一些纖維素酶的表達已經在里氏木霉得到加強，如內切纖維素酶。在這里，我們通過現代生物信息學技術，得到一種新穎的具有寬廣PH活性纖維素酶的基因編碼區DNA及其多肽。雖然現有背景技術中存在涉及到上述的一些或者所有性質的纖維素酶，但是還是要需要具有新的廣譜PH的纖維素酶，而此纖維素酶在生物石洗、織物拋光、紙槳處理以及生物質的轉變是很有用的。
發明內容
本發明的目的就是為了解決上述現有技術存在的問題，提供一種具有寬廣pH活性纖維素酶及其制備方法。為了達到上述目的，本發明采用了以下技術方案一種具有寬廣PH活性纖維素酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示。上述具有寬廣pH活性纖維素酶基因，其中，所述的纖維素酶基因編碼的多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。上述纖維素酶基因的編碼多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。上述編碼多肽，其中，所述的編碼多肽在pH6-10條件下具有75%以上的纖維素酶相對活性，并且能在PH3-10保存下具有90%以上的殘余相對活性。一種具有寬廣pH活性纖維素酶的制備方法，包括以下步驟I)由深海真菌Phaeosphaeria sp. LH21培養分離出具有寬廣pH活性纖維素酶基因，該基因具有SEQ ID NO. I所示的核苷酸序列；2)將基因克隆到表達載體PPIC9K中；
3)將構建的表達載體轉入到宿主細胞，生產具有寬廣pH活性纖維素酶的基因工程菌；4)培養基因工程菌，獲得具有寬廣pH活性纖維素酶。上述具有寬廣pH活性纖維素酶的制備方法，其中，所述宿主細胞為原核細胞或真核細胞，原核細胞包括大腸桿菌、枯草桿菌、鏈霉菌、或分支桿菌；真核細胞包括酵母細胞、里氏木霉、黑曲霉、米曲霉或各種動植物細胞。本發明以來源于深海真菌Phaeosphaeria sp. LH21的基因組為基礎,利用同源性搜索得到保守性氨基酸片段，設計簡并性引物得到中間序列，用基因組走讀擴增兩端未知序列，反轉錄PCR擴增該基因，然后克隆到表達載體PPIC9K中，并在畢赤酵母GSl 15中獲得表達。通過Genbank同源搜索和蛋白質功能鑒定研究表明，該基因的編碼區DNA是一個編碼纖維素酶的DNA序列。該基因能在任何宿主細胞中表達，表達的纖維素酶在PH6-10條件下具有75%以上的纖維素酶相對活性，此纖維素酶還能在pH3-10條件下能保持殘余相對 纖維酶活性90%以上。另外，本發明還提供了在寬廣pH條件下具有最佳纖維素酶活性的多肽的氨基酸序列及功能等同突變體。在本發明中，編碼的纖維素酶在pH6-10條件下可以表現出75%以上的相對活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO. I的核苷酸序列及其簡并密碼子所產生的序列。由已知密碼子的簡并性，與SEQ ID NO. I核苷酸序列同源性小于70%的簡并序列也能編碼出SEQID NO. 2所述的氨基酸序列，還包括核苷酸雜交的核苷酸序列。還可包括同源性至少70%的核苷酸序列。在本發明中，“寬廣pH活性纖維素酶”，指在pH6-10條件下可以表現出75%以上的纖維素酶活性的SEQ ID NO. 2序列的多肽，它在各種pH條件下的耐受性可以達到90%以上。該術語還包括SEQ ID NO. 2序列的突變體，這些突變體具有與天然中堿性纖維素酶相同的功能。這些突變體包括若干個氨基酸的缺失，插入和/或取代，以及在兩端添加一個、數個或一段氨基酸序列，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異。例如，用性能相近或相似的氨基酸取代，一般不會改變蛋白質的生物功能。又比如，在兩端添加一個、若干個或一段氨基酸序列也不影響酶的功能。該術語還包括寬廣PH活性纖維素酶的活性片段和活性衍生物。在本發明中，可選用本領域已知的各種載體，可以是市場上銷售的質粒。在生產本發明的具有寬廣PH活性纖維素酶時，可以將具有寬廣pH活性纖維素酶基因的編碼區DNA序列連接于表達調控序列，從而形成具有寬廣PH活性的纖維素酶表達載體。表達載體含有復制起始點、啟動子、增強子和必要的加工信息位點。表達載體還必須含有標記基因，比如提供卡那霉素，氨芐表霉素，氨甲蝶呤等抗生素或其他毒性物質的抗性蛋白質；互補營養缺陷型蛋白質；提供復合培養基中沒有的必需營養成分的蛋白質。在本發明中，宿主細胞包括原核細胞和真核細胞。常用的原核細胞如大腸桿菌、枯草桿菌、鏈霉菌、分支桿菌等。常用的真核細胞如酵母細胞、里氏木霉、黑曲霉、米曲霉等，或各種動植物細胞。本發明的具有寬廣pH活性纖維素酶基因或其片段通常可以用PCR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴增法，可根據本發明所公開的有關核苷酸序列來設計引物，用本領域技術人員已知的常規方法制備，以Phaeosphaeria sp.全基因組DNA為模板，擴增而得到相關基因。當獲得相關基因時，就可將其克隆至相關載體，再轉入宿主細胞，然后通過常規方法從擴繁后的宿主細胞中得到大批量的相關基因。
具體實施例方式下面通過實施例對本發明作詳細描述I)具有寬廣pH活性纖維素酶基因的克隆首先培養Phaeosphaeria sp. LH21,培養方法按PDA的培養基，按Sambrook等的方法提取基因組DNA。根據P.nodorum SN15基因組測序信息，以其基因登錄號NW_001884567的序列進行同源搜索，找出保守的同源片段，設計簡并性引物5’ -TACTGGGAYTGCTGYAARGG-3’ 和 5’ -GCCTTSARCTTCKCGGGGAA-3’，擴增中間序列，通過三輪 的基因走讀，擴增兩側未知序列，拼接全長序列，通過ORFfinder軟件預測開放閱讀框，經反轉錄PCR擴增到了預計的目的片段，驗證是正確的。2)具有寬廣pH活性纖維素酶的制備上述獲得的具有寬廣pH活性纖維素酶基因通過SignalP3. O軟件預測信號肽，去除信號肽，在上游引物引入Not I位點，下游引物引入EcoR I，插入到pPIC9K中，再電轉到畢赤酵母GS115中，篩選能夠表達具有寬廣pH活性纖維素酶的基因工程菌。具體操作如下a、挑取具有寬廣pH活性纖維素酶基因的陽性基因工程菌的單克隆，接種至25mlBMGY 中(250ml 搖瓶)，28°C，250rpm,大約 18h。b、室溫3000g離心5min，收集細胞，去除上清，用BMMY重懸細胞至100ml，進行誘
導表達。C、在IL搖瓶中加入上述培養物，加蓋兩層滅菌紗布或干酪包布，放入搖床繼續生長。d、每24小時，加甲醇至終濃度為O. 5%以繼續誘導。e、以CMC為底物，在50°C、各種pH條件下通過DNS法測定纖維素酶相對活性，以發現最適pH值。f、在50°C、各種pH條件孵育I小時后，以CMC為底物，在50°C、pH8條件下通過DNS法測定纖維素酶殘余相對活性，以發現PH值耐受性。序列表〈110〉華東理工大學<120>具有寬廣pH活性纖維素酶及其制備方法<160>2<170>Patent In version 3. 3〈210〉I<211>702<212>DNA〈213〉暗球腔菌 LH21 (Phaeosphaeria sp. LH21)〈400〉I
atggtaacct tctggcagat cgtgtttctcatagcggcca cagggattgcgacagttgac 60gcgcaaacca aaaccggaaa gaccaccagatactgggact gctgcaaaggctcctgcggc 120tggtcaggga aggcgccagt gaaccagcccatccagtcct gcgacaagtccgacaaccca 180ctctccaaca tggctgctaa gaatggctgcgagaacggtg ggcaggcgtacatgtgctca 240gaccagagcc catgggctgt cgatgacaacctggcatacg gtttctctgccgtgaagctg 300gctggtcaga ctgagaatgc ttggtgctgtgcctgctacg aattgacctttacctccggc 360ccagtcagtg gcaagaagat gatcgtgcaagccaccaaca ccggcggtgatctcggacag 420aaccacttcg acattgccat gccaggtggcggtgtcggcc tcttcaatgcctgcacaaac 480·caatggggcg caccaccgca aggctggggccagcaatacg gaggtattagctcgcgctca 540gagtgtgatg gcttccccgc gaagctcaaggctggttgtc agtggagattcgactggttc 600cgtggcgcgg acaacccaga tgttagcttcaaggaggtta cttgccccaaggccttgaca 660gccaggactc gctgtatccg gaatgggaagtctccaacat ag702<210>2<211>233〈212〉氨基酸〈213〉暗球腔菌 LH21 (Phaeosphaeriasp. LH21)<400>2MVTFWQIVFL I 從 TGIATVD AQTKTGKTTR YWDCCKGSCG WSGKAPVNQP IQSCDKSDNP 60LSNMAAKNGC ENGGQAYMCS DQSPWAVDDNLAYGFSAVKL AGQTENAWCCACYELTFTSG 120PVSGKKMIVQ ATNTGGDLGQ NHFDIAMPGGGVGLFNACTN QWGAPPQGWGQQYGGISSRS 180ECDGFPAKLK AGCQWRFDWF RGADNPDVSFKEVTCPKALT ARTRCIRNGKSPT23權利要求
1.一種具有寬廣pH活性纖維素酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示。
2.根據權利要求I所述具有寬廣PH活性纖維素酶基因，其特征在于所述的纖維素酶基因編碼的多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
3.一種根據權利要求I所述的纖維素酶基因的編碼多肽，其特征在于其氨基酸序列如 SEQ ID NO. 2 所示。
4.根據權利要求3所述的編碼多肽，其特征在于所述的編碼多肽在PH6-10條件下具有75%以上的纖維素酶相對活性，并且能在pH3-10保存下具有90%以上的殘余相對活性。
5.一種具有寬廣pH活性纖維素酶的制備方法，其特征在于，包括以下步驟 1)由深海真菌Phaeosphaeriasp. LH21培養分離出具有寬廣pH活性纖維素酶基因，該基因具有SEQ ID NO. I所示的核苷酸序列； 2)將基因克隆到表達載體PPIC9K中； 3)將構建的表達載體轉入到宿主細胞，生產具有寬廣pH活性纖維素酶的基因工程菌； 4)培養基因工程菌，獲得具有寬廣pH活性纖維素酶。
6.根據權利要求5所述具有寬廣pH活性纖維素酶的制備方法，其特征在于，所述宿主細胞為原核細胞或真核細胞，原核細胞包括大腸桿菌、枯草桿菌、鏈霉菌、或分支桿菌；真核細胞包括酵母細胞、里氏木霉、黑曲霉、米曲霉或各種動植物細胞。
全文摘要
一種具有寬廣pH活性纖維素酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。上述纖維素酶基因的編碼多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本發明以Phaeosphaeria sp.LH21基因組為基礎，通過基因組走讀和反轉錄PCR擴增到此纖維素酶基因。此基因及其突變體能與表達載體連接，轉入到任何宿主細胞中產生纖維素酶，以CMC為底物，在pH6-10、50℃條件下具有75％以上的相對活性，并且能在pH3-10保存下具有90％上以的殘余相對活性。本發明中的寬廣pH活性纖維素酶在洗衣滌劑行業、食品行業、紡織行業、石油化工、醫藥生產和飼料加工等領域具有廣闊的應用前景。
文檔編號C12N9/42GK102911952SQ20121039600
公開日2013年2月6日 申請日期2012年10月17日 優先權日2012年10月17日
發明者魏東芝, 王瑋, 趙喜華 申請人:華東理工大學