專利名稱：一種反硝化聚磷菌及其在污水處理中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及ー種反硝化聚磷菌及其在污水處理中的應用，屬于生物環保技術領域。
背景技術：
我國是農業大國，農村面積占全國土地總面積的57. 59%。“十二五”規劃(2011)中明確提出要大力推進農村環境綜合整治，強調要加強農村飲用水水源地保護、農村河道綜合整治和水污染綜合治理。與城市相比，農村經濟實カ薄弱、基礎設施建設差，農村污水處
理工藝落后。采用成本低，運行簡單，易于管理的處理工藝，可以實現農村生活污水的循環利用，節約水資源，同時還能有效改善村鎮居民的生活環境衛生狀況，對于推進新農村建設和環境資源的可持續發展具有重大的戰略意義。人工濕地是ー種由人工建造和監瞀控制的，與沼澤地類似的地面，它利用自然生態系統中的物理、化學和生物的三重協同作用來實現對污水的浄化。據國外資料報道，一般人工濕地的工程造價和運行費用僅為傳統ニ級活性污泥法的1/10-1/2，単位污水耗電和污水處理費用明顯低于傳統污水處理廠。人工濕地系統中，微生物的活動是廢水有機物降解的主要因素，是吸收和降解污染物的主要生物群體和承擔者。在氮的去除方面起主要作用的是氨化細菌、亞硝化細菌和反硝化細菌，微生物的反硝化是人工濕地脫氮的主要作用。磷的去除主要通過植物和部分微生物的吸收利用以及濕地基質的吸附。人工濕地系統是ー個完整的生態系統，它形成了內部的良好循環并具有較好的經濟效益和生態效益。然而人工濕地本身也存在不足之處，比如占地面積大，水力停留時間長，處理效果受溫度變化和植物生長成熟程度影響大，缺乏最優化設計規范和參數，有潛在的疾病傳播媒介等，因此需要進ー步的改進和完善。國內外長期實踐工程表明，人工濕地對有機物的去除率較高，但對氮磷的去除率偏低且不穩定，在現有人工濕地技術基礎上進ー步改進，強化其脫氮除磷效率才能更好的發揮作用。研究表明，増大濕地面積、增設預處理エ藝、外加曝氣和更換基質填料等方法能夠提高人工濕地的氮磷去除效率，但同時也帶來了運行成本増加、エ藝管理不便的弊端，對于經濟基礎薄弱的農村來說難以實施。夏季人工濕地中植物生長茂盛，水體中微生物活動旺盛，能夠更好的利用污水中的有機物，氮磷元素，對污水具有良好的浄化作用。然而秋季吋，濕地植物成熟，為防止植物體內吸收的氮磷等營養元素再次進入水體，需進行作物收割處理。隨著氣溫降低，濕地系統中微生物的代謝作用減弱，因此在秋季通過增加植物根際優勢微生物的數量，強化植物和微生物對目標污染物的協同去除作用，是一條經濟、高效的污染治理新技木。對于經濟基礎薄弱的農村來說，采用生物技術強化人工濕地來增強污染治理力度，是提高氮磷去除率、節省治污成本的最佳途徑。直接増加根際微生物的數量已經成為提高濕地處理效果的發展趨勢。目前國外有利用微生物制劑處理有機廢水，國內有利用共生復合微生物處理城市污水的應用，鑒于優勢菌強化人工濕地エ藝在村鎮生活污水中的廣闊的應用前景，并結合我國農村的經濟生活現狀，本發明人經反復研究和實踐，發現利用微生物強化技術將反硝化聚磷菌Pseudomonas oleovorans CL-3投加到人工濕地系統中，來增加根際脫氮菌群的數量，強化植物和微生物的協同作用，有效凈化生活污水。同時配以適當エ藝處理，使得人エ濕地處理后的廢水中的COD、氨氮和總磷的含量指標達到《城鎮污水處理廠污染物排放標準》(GB18918-2002)—級標準。
發明內容
本發明的目的是提供一株反硝化聚磷菌，該細菌是從雙泥序批式反應器(DSSBR)缺氧結束時的污泥中分離篩選得到的，以及該菌在污水處理中的應用。一種反硝化聚磷菌,該菌株命名為Pseudomonas oleovorans CL-3,屬于假單胞菌屬的食油假單胞菌，已于2012年6月13日保藏于中國典型培養物保藏中心，其保藏編號為CCTCC N0:M 2012226。 其菌學特征為細胞呈長桿狀，直徑約為(0. 25-0. 375) X (2. 0-3. 0) U m ;菌落乳白色，邊緣有ー塊凸出、中間凸，有同心圓、有光澤；革蘭氏染色為陽性；異染顆粒染色時有黒色聚磷顆粒物質；最適溫度為30°C;pH在7.0 9.0之間時，有良好的脫氮能力，最適pH為 7. O。使用前用反硝化培養基活化菌株將保藏培養基斜面上保存的食油假單胞菌CL-3，用接種環刮取I環菌苔，接種入裝有200mL反硝化培養基的250mL錐形瓶中，30°C恒溫培養箱靜置培養12h，即可獲得菌株。其次，本發明還提供了ー種人工濕地，所述的人工濕地選用頁巖和陶粒來構建濕
地基質層。頁巖是人工濕地技術中應用比較成熟的濕地填料，在有機物、氮、磷等營養元素的去除方面效果較好。陶粒以頁巖、粘土等惰性物質為主要原料并附加少量金屬氧化物高溫焙燒而成。其成份主要以無機非金屬物質為主。粒徑為3-5mm的陶粒對微生物具有良好的固定作用，同時對磷元素具有很好的吸附作用。較好的是，本發明中，所述人工濕地的構成單元結構自下而上依次為碎石層(厚度為150-180mm)、防滲層(防滲膜)、組合填料層(厚度為600-700mm)、陶粒層(厚度為150_180mm)、表面熟土層(厚度為 100_150_)。較好的是，在本發明中，所述人工濕地長4m，寬lm，深I. 3m。較好的是,在本發明中，所述的碎石粒徑范圍為30mm-100mm,組合填料層由粒徑不等的頁巖組成，粒徑范圍為5-30mm,陶粒粒徑范圍為3_5mm。較好的是，在本發明中，人工濕地植物采用蘆葦濕地植物進行種植，蘆葦根系發達，分蘗生長，耐鹽堿、水質凈化能力強。根據本發明，上述人工濕地用于農村生活污水回用處理，具體步驟如下(I)先將生活污水經中水站處理，處理后的ニ級出水進入潛流人工濕地。(2)將培養活化的反硝化聚磷菌菌液投加到種植蘆葦的人工濕地系統中，繼續對ニ級出水進行進一步處理，污水在潛流人工濕地內的水力停留時間為7-9d，去除C0D、N、P等污染物。放出上述在潛流人工濕地內停留7-9d的潛流污水，所述污水水體中的有機物、氮、磷等污染物含量指標達到《城鎮污水處理廠污染物排放標準》(GB18918-2002) —級標準。 根據本發明的上述步驟，利用微生物對濕地的強化作用，通過填料、植物和微生物之間的相互作用，經吸附、離子交換、植物吸收和微生物降解等過程，降低水體中的有機物、氮、磷等污染物的含量，使COD、NH3-N, P含量指標達到《城鎮污水處理廠污染物排放標準》(GB18918-2002) ー級 B 標準。本發明具有的有益效果
(I)本發明菌株有較好的脫氮、脫磷效果，與已報道的反硝化聚磷菌相比，由于其生長周期較長，可維持較長時間的脫氮除磷作用。(2)本發明中通過投加反硝化聚磷菌加強了微生物對濕地的強化作用，有效提高了污水中氮磷素的去除效率。(3)本發明中的污水處理效果較好，能使農村生活污水經人工濕地處理的出水的C0D、氨氮和總磷的含量指標達到《城鎮污水處理廠污染物排放標準》(GB18918-2002) —級B標準。
圖I為食油假單胞菌CL-3菌體透射電鏡顯微照片。圖2為溫度對食油假單胞菌CL-3總氮去除率的影響。圖3為pH對食油假單胞菌CL-3總氮去除率的影響。圖4為食油假單胞菌CL-3在最佳脫氮條件下的生長曲線圖5為食油假單胞菌CL-3在最佳脫氮條件下的脫氮除磷率。圖6為本發明人工濕地現場布置平面圖。圖7為本發明一種以頁巖和頁巖陶粒為基質填料的人工濕地內部結構示意圖。圖8為本發明加菌強化蘆葦人工濕地對COD的處理效果圖。圖9為本發明加菌強化蘆葦人工濕地對氨氮的處理效果圖。圖10為本發明加菌強化蘆葦人工濕地對硝態氮和亞硝態氮的處理效果圖。圖11為本發明加菌強化蘆葦人工濕地對總氮的處理效果圖。圖12為本發明加菌強化蘆葦人工濕地對總磷的處理效果圖。其中，I.碎石層，2.防滲層，3.組合填料層，4.陶粒層，5.表面熟土層。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明作進ー步的說明。實施例用于說明本發明內容，而不是限定本發明內容。實施例I本發明菌株的分離鑒定(I)培養基菌株篩選、脫氮培養基(DM:Denitrifying Medium) (/L) :CH3C00Na，2g ; KH2PO4,0. 4g ；MgS04 7H20，0. 6g ；CaCl2 2H20，0. 07g ；KN03, Ig ；Tris 緩沖液 12mL ;微量元素 2mL ；pH控制在7. 0 7. 2。上述培養基如制成固體培養基,則添加瓊脂I. 5% (w/v)0
(2)食油假單胞菌CL-3的分離純化用無菌移液管取雙泥序批式反應器(DSSBR)缺氧結束時的污泥混合液10mL，置于裝有數粒玻璃珠的無菌三角瓶中，加入無菌水90mL，制成稀釋度為KT1的菌懸液，在磁力攪拌器上攪拌20min打散菌膠團。用移液槍分別吸取0. 5mL樣品于裝有4. 5mL無菌水的試管中，混勻，依此類推，最后吸取稀釋度為10_4的稀釋液，以每塊平板0. 2mL的量，涂布四塊DM培養基，用無菌三角玻璃刮刀在培養基表面均勻涂布，將稀釋涂布后的培養基平板倒置于30°C恒溫培養箱中培養48h后,培養至長出明顯菌落。選取單一菌落多的ー個平板，進行平板劃線。在DM培養基平板上多次劃線純化，直至顯微鏡下觀察顯示無雜菌為止，此時可認為本發明的菌株食油假單胞菌CL-3已純化完畢。(3)食油假單胞菌CL-3的菌落形態特征在培養基A平板上培養3d后，顯微鏡下觀察到菌落乳白色，邊緣有ー塊凸出、中間凸，有同心圓、有光澤。
(4)食油假單胞菌CL-3的菌體形態特征透射電鏡觀察結果表明菌體呈長桿狀，直徑約為(0. 25-0. 375) X (2. 0-3. 0) u m (如圖 I 所示)。(5)食油假單胞菌CL-3的生理生化特征革蘭氏染色為陽性；異染顆粒染色時有黑色聚磷顆粒物質；最適溫度為30°C (如圖2所示)；pH在7.0 9.0之間時，有良好的脫氮能力，最適pH為7.0 (如圖3所示)。(6) 16S rDNA 的 PCR 擴增與測序實驗儀器小型離心機(Eppendorf,轉速>12000r/min);電泳儀(北京六ー儀器廠)；PCR熱循環擴增儀(Eppendorf);凝膠成像儀(美國Bio-Rad公司)。實驗方法從菌株CL-3的新鮮斜面上直接挑取菌體，加入至含100 u L雙蒸水的離心管中，旋渦混勻后，沸水浴7min，12000r/min離心5min，上清液用于PCR擴增模板。擴增引物為ー對通用引物。正向引物為27F :5’ -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’ ；反向引物為1492R :5’ -GGTTACCTTGTTA CGACTT-3’。PCR反應在25 ii L體系中進行。反應體系的組成為模板DNA IuL ；dNTP混合物I U L ；rTaq DNA聚合酶0. 2 ii L ;正向引物I U L ;反向引物I U L ;雙蒸水8. 8 yしPCR 擴增條件94°C 變性 5min ;94°C lmin, 55 °C lmin, 72 °C lmin。循環 29 次；72°C延伸10min，4°C放置。用1% (w/v)的瓊脂糖凝膠對菌株的16S rDNA擴增產物做電泳檢測，驗證后切下膠條，用DNA凝膠回收試劑盒(上海生エ生物工程有限公司)純化PCR產物。回收后的PCR擴增產物委托上海生エ生物工程有限公司進行測序。(7) 16S rDNA序列分析與系統發育分析測序后得到CL-3菌株的16S rDNA長度為1268bp的序列，提交到Genbank與其他菌株進行比對(登錄號為FJ594993)，發現和CL-3菌株親緣關系最近的是Pseudomonas屬中的Pseudomonas oleovorans,序列同源性可達100%。將菌株CL-3歸屬假單胞菌(Pseudomonas oleovoransノ 類群中，命名為 Pseudomonas oleovorans CL—3。實施例2本發明菌株的培養( I)所使用的培養基菌株反硝化培養基(DM:Denitrifying Medium) (/L) CH3C00Na, 2g ；KH2P04,0. 4g ；MgSO4 7H20，0. 6g ；CaCl2 2H20，0. 07g ；KN03, Ig ；Tris 緩沖液 12mL ;微量元素 2mL ;pH 控制在 7. O 7. 2。上述培養基如制成固體培養基，則添加瓊脂I. 5% (w/v)。使用前，121°C，滅菌20分鐘。(2)培養條件將保藏培養基斜面上保存的食油假單胞菌CL-3用接種環刮取I環菌苔，接種入裝有200mL反硝化培養基的250mL錐形瓶中，30°C恒溫培養箱靜置培養12h，即可獲得菌株。實施例3本發明菌株在最佳脫氮條件下的脫氮性能實驗在250mL三角瓶中進行，每瓶含50mL反硝化培養液，加入50mL已培養好的菌液，調整PH使CL-3處于反硝化所需的最佳脫氮條件，于最適溫度下密封間歇振蕩培養，振蕩4h、靜止培養4h。定時檢測培養基中細菌的OD6tltl，實驗結果見圖4。井分別按對應時間取培養液在0. 22 y m的濾膜下抽濾，測定濾液中硝酸鹽氮和磷酸鹽含量，計算脫氮率和除 憐率。頭驗結果見圖5。從圖4中可以看出，菌株CL-3的生長較緩慢，生長周期較長。48小時之后進入指數增長期，0D_由0. 5增加到3. O。120 168小時之后進入穩定期，168小時之后CL-3菌株趨向衰亡。0D_逐漸降低。從圖5中可以看出，總氮去除率隨著菌株CL-3的增長不斷升高。前16小時內氮磷曲線下降較快，說明氮磷去除主要在前16小時，而16 24小時為過渡期。前24小時氮磷去除率分別為64. 5%,52. 5%，去除速率分別為3. 7mg/h、l. 76mg/h ;整個實驗過程氮磷去除率分別為84. 6%, 76. 8%。實施例4如圖6所示，濕地系統總占地約100m2，由8個面積大小相同的單池組成。單池長4m，寬lm，深I. 5m。單池的蓄水量約為1000L。池中每隔ー米設有垂直高度間隔15cm的5個出水孔，便于取樣檢測。濕地通過末端底部設置出水孔，池外連接上部開ロ、高I. 3m的出水管來控制濕地最高水位。如圖7所示，濕地底部為粒徑大于3cm的頁巖，距底部0. 15m到0. 6m為粒徑3cm左右的頁巖，0. 6m到0. 75m處粒徑為3_5mm的陶粒；表層IOcm為細土層。濕地植物采用根際微生物豐富的蘆葦進行分池種植。中水站ニ級出水首先進入配水箱，然后由配水箱分別向八個人工濕地進行均勻布水。處理后的出水經收集后直接外排。八個單池既可獨立運行，互不干擾，又可同時運行，共同發揮作用。且各池中都安裝有曝氣閥，可以實現単獨曝氣，運行簡易，方便。實施例5秋季對蘆葦濕地進行生物強化實驗。在啟動運行期，將培養的反硝化細菌的菌液(OD600=L 0)按5%的比例投加于人工濕地中，取水力停留時間7d。在運行過程中，污水在潛流人工濕地內停留10d，濕地內的填料、植物和微生物之間相互作用，通過填料、植物和微生物之間的相互作用，經吸附、離子交換、植物吸收和微生物降解等過程，降低水體中的有機物、氮、磷等污染物的含量，使COD、NH3-N, P含量達到《城鎮污水處理廠污染物排放標準》(GB18918-2002) ー級 B 標準。具體處理效果見圖8、圖9、圖10、圖11、圖12。強化蘆葦濕地對COD的去除效果明顯(見圖8)，第7天時則降至60mg/L以下，COD去除率為83. 4%，比對照組提高了 12. 6%。圖10顯示，實驗過程中蘆葦加菌強化濕地中NH3-N濃度呈現逐漸降低的趨勢，與對照組相比具有更優的去除效果。NH3-N濃度7天時降至7. 7mg/L,達到水質排放標準(NH3_N〈8mg/L)，NH3-N的去除主要在前7天內，去除率達到81%。而對照組NH3-N為28. 6mg/L未達標。圖11中，由于反硝化細菌的作用，蘆葦濕地加菌強化實驗時在初始階段均出現N03_-N濃度先升高后降低，與同期的對照組相比均具有較好的N03_-N去除效果。濕地中的反硝化細菌在N的轉化中起了關鍵的調節作用，使得N02_-N濃度保持在較低范圍內(見圖11)，保證了濕地系統正常運行，免于N02_-N的毒害作用。通過生物強化作用，人工濕地對TN的去除效果要明顯好于對照實驗組(見圖9)。圖12顯示，加菌強化實驗組和對照組TP濃度降低趨勢相似，由于初始進水濃度較低，約為0. 7mg/L，加菌強化對P的去除作用不明顯。水力停留時間7天時，P濃度達標(P〈0. 5mg/L)。本發明基建費用省，運行過程中無需曝氣，即能達到排放標準，可以有效節省エ藝運行成本，維護簡単，噸水處理費為0. 23-0. 29元。通過投加反硝化細菌對秋季人工濕地進行生物強化，水力停留時間7d吋，C0D、氨氮和總磷的去除效果顯著，處理后的廢水達到《城 鎮污水處理廠污染物排放標準》(GB18918-2002) —級B標準，有效改善人工濕地系統占地面積大，水力停留時間長等缺點，具有良好的社會環境經濟效益。
權利要求
1.一株反硝化聚磷菌，其特征在于該菌株命名為Aeyt/offlmas oleovorans CL-3,屬于假單胞菌屬的食油假單胞菌，保藏編號為=CCTCC N0:M 2012226。
2.權利要求I所述的反硝化聚磷菌在污水處理中的應用。
3.權利要求I所述的反硝化聚磷菌在農村生活污水處理中的應用。
4.權利要求I所述的反硝化聚磷菌在污水脫氮脫磷中的應用。
全文摘要
本發明涉及一種反硝化聚磷菌及其在污水處理中的應用，該菌株命名為PseudomonasoleovoransCL-3，屬于假單胞菌屬的食油假單胞菌，保藏編號為CCTCCNO:M2012226。本發明菌株有較好的脫氮、脫磷效果，通過投加反硝化聚磷菌加強了微生物對濕地的強化作用，有效提高了污水中氮磷素的去除效率，能使農村生活污水經人工濕地處理的出水的COD、氨氮和總磷的含量指標達到《城鎮污水處理廠污染物排放標準》(GB18918-2002)一級B標準。
文檔編號C12N1/20GK102776145SQ20121026989
公開日2012年11月14日 申請日期2012年7月31日 優先權日2012年7月31日
發明者孟盼盼, 李政, 胡文容, 裴海燕, 邵媛媛 申請人:山東大學