專利名稱：基于16S rDNA的細菌核酸指紋特征譜的制備方法及其用途的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，涉及一種細菌核酸指紋圖譜制備的方法，以及使用該方法，對細菌進行分類與鑒定的方法。
背景技術：
早期的細菌學分類主要是采用以形態培養特征和生理生化特征為依據的傳統細菌學分類方法。但是由于細菌的這種表面特征往往受很多人為因素的影響與限制，特別是人們主觀判斷的差異反而難以反映出細菌的自然親緣關系，這就體現了只建立在形態特征和生理生化特征基礎上的傳統分類學的局限性。因此，Colweel提出了一個新的細菌分類學術語“多相分類(Polyphasictaxonomy)”，它是指綜合利用微生物多種不同信息，包括表型和基因型的信息進行分類的方法。分子分類和系統發育信息豐富了多相分類的內容，共同推動細菌分類向著自然分類系統靠近。應用于分類的分子指標主要為DNA和RNA，而DNA同源性分析是確定正確的分類地位，建立自然分類系統的最直接的方法。此類方法簡便易行，分辨率高，在細菌系統分類學研究中起著越來越重要的作用。使用質譜技術進行細菌分類和鑒定的原理在于，組成遺傳物質DNA的基本單元——四種核苷酸之間存在質量差異，對細菌基因組DNA上某個或某幾個片段進行PCR和酶切后，將產生分子量和豐度各異的片段，使用質譜檢測可產生核酸指紋圖譜，不同細菌之間基因組DNA存在差異，將產生不同的核酸指紋圖譜，建立數據庫后，可以實驗結果與數據庫進行比對，即可完成對細菌的鑒定。已有一些公開文獻使 用質譜技術對微生物進行分類和鑒定，例如，中國專利申請CN102337223A、“產黃青霉抗真菌蛋白Pc-Arctin及其制備方法”，公開了一種檢測產黃青霉抗真菌蛋白Pc-Arctin的MALD1-T0F鑒定方法，其中從平板上挑取產黃青霉A096孢子接種于SGY液體培養基培養，預處理得到粗蛋白溶液在色譜柱上分離純化，并在羧甲基陽離子交換色譜柱上分離純化，收集各洗脫組分，各組分離心超濾濃縮至所需體積，以宛氏擬青霉為敏感受試指示菌，追蹤抗真菌活性組分，確定的活性成分判斷獲得蛋白的純度；割取SDS-PAGE電泳圖上的單一條帶，進行MALD1-T0F鑒定。該方法僅適用于特定微生物，且需要多重蛋白純化過程，最終用MALD1-T0F鑒定特征蛋白Pc-Arctin，其過程繁瑣、適用面窄，不能實現質譜分類細菌或微生物的目的。中國專利申請200910157210、“一種李斯特菌屬細胞中脂肪酸組分的分析方法”公開了一種利用氣相色譜質譜(GC-MS)分析法針對細菌脂肪酸進行分類的方法，包括李斯特菌復壯，用牛津瓊脂平板和胰酪胨大豆酵母浸膏瓊脂平板分別分離和純化李斯特菌，培養單個典型菌落的李斯特菌并制成菌懸液，用甲醛滅活處理，把經甲醛處理后的菌懸液平均分裝在離心管洗滌，用鹽酸和甲醇的混合液甲酯化，把制得的脂肪酸進行氣相色譜質譜(GC-MS)分析。雖然該方法打破傳統細菌分類學的局限，減少人為因素對傳統形態分類帶來的誤差，同時為新的菌種和毒種的分類鑒定提供強有力的工具，但該法仍然屬于利用質譜法進行細胞化學分析分類，并未針對核酸進行檢測。國際專利申請 W02010/021548、“Method for identifying biological materiale. g. bacteria in sample of patient, involves separating stream of liquidcontaining sample into successive portions to form flying drops and ionizingflying drops to measure mass spectra”,公開了一種使用MALD1-MS (基質輔助激光解吸和電離質譜)用于識別生物材料的方法和裝置，包括準備包含試樣和MALDI基質材料的液體，并將其用于形成液體的連續流束。將該流束分散成接連的部分，以形成發射到飛行中的液滴，或將流束發射到飛行中，然后分散成液滴。可使用從噴墨印刷機中已知的液滴形成技術。對飛行中的液滴電離出材料。測量來自各個液滴的電離材料的質譜。但該方法目的在于如何改善MALD1-MS檢測生物物質的靈敏度，并不涉及質譜鑒定和分類任意微生物，因此也不能解決上述技術問題。
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朱健等人(“高效液相色譜-電噴霧多級質譜法對格爾德霉素粗品中各組分的初步判別及分類”，《中國抗生素》，2011年03期)報道了應用高效液相色譜-電噴霧多級質譜法(LC-ES1-MSn)對格爾德霉素(GDM)粗品中各組分進行與質量數相關的結構信息方面的初步判別及分類。該方法針對格爾德霉素(GDM)中不同組分的多級質譜碎片進行的分析整理，并對各種化合物進行了準確分類，但并不涉及針對細菌特定物質進行檢測從而對細菌進行分類的方法。劉海洪(“MALDI TOF MS在細菌檢測和鑒定中的應用”，《微生物學免疫學進展》，2003年02期)報道了“細菌體內含有大量的生物標志分子能用于細菌的化學分類和鑒定，針對如根據細菌的組成成分獲得指紋圖譜檢測和鑒定細菌”，并對該方法預測其理論上的可行性。然而，該研究僅僅是理論上探討了利用MALDI TOF MS對細菌進行分類的方向，其既沒有指明所針對細菌的何種組分進行檢測，也沒有說明具體研究方法和過程。由于細菌中可用于分類的組分(如蛋白、DNA、RNA、多糖等)種類太多，且質譜技術針對不同待測物也存在各種實驗參數的組合和選擇，因此在此之后的近10年內并沒有利用MALDI TOF MS進行細菌分類的新的報道。作為最接近的現有技術，中國專利申請201110154723、“MALDI TOF MS輔助鑒定單增李斯特氏菌的方法”和201110154469、“MALDI TOF MS輔助鑒定霍亂弧菌的方法”公開了一種利用MALDI TOF MS技術輔助鑒定細菌的方法，包括預處理細菌培養物，采集所有菌株樣品的MALDI TOF MS圖譜，根據軟件制備細菌標準圖譜，使用相同的方法檢測并采集待測細菌的圖譜，以及比較二者圖譜，根據匹配分數進行判定。由于該方法使用常規的處理(通過無水乙醇、甲酸和乙腈處理，并輔以離心，最后吸取上清液進行檢測)，盡管其在一定程度上能表征該細菌的特征圖譜，但由于其待測物中含有蛋白質、脂類、脂多糖和脂寡糖、DNA、多肽及其它能被離子化的分子，其得到的圖譜實質上是上述各種分子的圖譜集合，因此既需要處理和比對的圖譜信息量過大，并且因待檢分子過于龐大而導致其圖譜特征性偏低，只適用于某具體細菌而無法推廣到其他大量的細菌檢測中。研究證明，細菌rRNA區域。rRNA是研究細菌進化和親緣關系的重要指標，它含量達80%，并存在于所有細菌中，rRNA基因由保守區和可變區組成，在細菌中高度保守，素有“細菌化石”之稱，是細菌系統分類學研究中最有用和最常用的分子鐘。其中，16S rDNA序列由于分子大小適中(約1. 5kb)，突變率極低，已經成為細菌分類和種屬鑒定的重要標記(Olsen GJ, Pace NR, Nuell M, et al. Nucleic Acids Res, 1991, 19 ( supp I):2017-2021.)。雖然目前16S rDNA序列分析已經成為細菌種屬鑒定和分類的標準方法，大約2500個種的16S rDNA全序列已經被報道，根據它們的序列同源性，已經構建了各種屬的系統發育樹。但由于16S rDNA序列在原核生物中的高度保守性,對于相近種或同一種內的不同菌株之間的鑒別分辨力較差。另外，目前以16S rDNA進行細菌分類和鑒定的方法主要是采用PCR產物直接測序，結果與數據庫進行比對的方法。測序法應用于臨床檢測，目前存在如下問題(1)成本高；(2)耗時；(3)對于混合樣本，測序易產生套峰，難以進行有效區分；(4) 16S rDNA全長1. 5kb以上，一般需要經過兩次測序并將結果進行拼接，在這個過程中易引入誤差。如前所述，16S rDNA對細菌分類鑒定具有重要的意義，但是傳統測序等方法檢測成本高、耗時長；對于混合感染的樣品，測序法將得到混合的序列峰圖，難以進行有效的區分，并且利用質譜進行待測物分析，需要選擇合適的待測物和優化質譜參數，因此目前需要新的細菌分類技術(如質譜法)來實現快速、準確、廉價、便捷的分類結果。因此，目前需要一種既能針對細菌中16S rDNA某特定區域進行質譜檢測，同時該方法又能普遍用于絕大多數細菌的質譜分類和鑒定中。
發明內容
本發明原理在于發明人經過大量摸索和比對，針對841種細菌的研究，發現選用通用引物對細菌DNA保守DNA區域進行PCR擴增后，使用特殊酶對擴增產物處理后，進行質譜檢測可以得到各種細菌核酸指紋特征圖譜。本發明所述的細菌DNA基因組上一個區域，優選是具有高度保守同時又具有一定多態性的區域。由于細菌屬于低等生物，各種細菌的基因組中普遍呈現為一定同源性的保守性，因此針對細菌基因組中任一相對保守的區域，使用通用引物即可擴增出各種細菌彼此對應的核酸區域。不同微生物的DNA片段酶切，具有不同的特征圖譜，因而將實際核酸質譜圖譜進行生物信息學分析，即可實現細菌的分類與鑒定。 因此，本發明第一目的是提供一種基于酶切的細菌核酸指紋圖譜制備方法。其特征在于，它至少包括如下步驟(I)PCR反應使用針對細菌16S rDNA的PCR通用引物，分別擴增多個細菌的核酸模板，得到含擴增目標區域的PCR產物；(2) SAP酶消化用堿性磷酸酶(SAP酶)處理步驟(I)得到的PCR產物；(3)轉錄和核酸酶切使用特定的轉錄和內切酶，分別在一個反應體系中，對步驟
(2)得到的各個細菌的消化產物進行轉錄和核酸酶切，獲得一系列長度不一、豐度不一的核酸片段；(4)純化使用樹脂處理步驟(3)得到的酶切產物；(5)質譜儀檢測將步驟(4)得到的純化產物上點在含有基質的靶片上，上質譜儀進行檢測，得到不同細菌的特征核酸指紋譜圖。在一個實施方案中，PCR反應所擴增的細菌核酸序列，包括但不限定于細菌16SrDNA上一個區域。在另一個具體實施方案中，所述細菌16S rDNA區域選自SEQ ID N0:3所示的區域，或者與SEQ ID N0:3所示序列具有至少60%同源性的序列。在其中的優選實施方案中，優選該序列具有 62%、65%、68%、70%、72%、75%、78%、80%、82%、85%、88%、89%、90%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 同源性的序列。在一個實施方案中，所述通用引物包括但不限于SEQ ID No :1至SEQ ID No :2所示序列。在另一 實施方案中，步驟3所述的特定酶，包括但不限于RNaseA酶。在一個具體實施方案中，步驟5的純化包括在轉錄和酶切產物中加入超純水，混勻后，再加入樹脂，上下顛倒混勻15分鐘。在另一個具體實施方案中，其中所述質譜儀是MALDI TOF MS質譜儀。上述任一方案中，其中所述細菌包括如表1所列的836種細菌。[LZOO]
權利要求
1.一種基于細菌16S DNA的核酸指紋圖譜制備方法，其特征在于，它至少包括如下步驟 (1)PCR反應使用針對細菌16S rDNA的PCR通用引物，分別擴增多個細菌的核酸模板，得到含擴增目標區域的PCR產物； (2)SAP酶消化用堿性磷酸酶(SAP酶)處理步驟(I)得到的PCR產物； (3)轉錄和核酸酶切使用特定的轉錄和內切酶，分別在一個反應體系中，對步驟(2)得到的各個細菌的消化產物進行轉錄和核酸酶切，獲得一系列長度不一、豐度不一的核酸片段； (4)純化使用樹脂處理步驟(3)得到的酶切產物； (5)質譜儀檢測將步驟(4)得到的純化產物上點在含有基質的靶片上，上質譜儀進行檢測，得到不同細菌的特征核酸指紋譜圖。
2.根據權利要求1的方法，其中細菌16SrDNA區域選自SEQ ID N0:3所示的區域，或者與SEQ ID N0:3所示序列具有至少60%同源性的序列，在其中的優選實施方案中，優選該序列具有 62%、65%、68%、70%、72%、75%、78%、80%、82%、85%、88%、89%、90%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同源性的序列；通用引物包括但不限于SEQ ID No :1和SEQ ID No :2所示序列；且用于核酸酶切的特定酶,包括但不限于RNaseA酶。
3.權利要求1或2的方法，其中步驟5的純化包括在轉錄和酶切產物中加入超純水，混勻后，再加入樹脂，上下顛倒混勻15分鐘；所述質譜儀是MALDI TOF MS質譜儀。
4.權利要求1-3中任一項的方法，其中所述細菌包括如表I所列的836種細菌。
5.在上述任一方案中，其中所述細菌還包括布魯氏菌(5rwce77a)、結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis、,以及幽門螺桿菌pylori, Ηρ)。
6.利用權利要求1的方法用于建立細菌核酸指紋特征圖譜庫的方法，至少包括上述步驟1-5，和； (6)將步驟5得到的各種細菌16SrDNA的核酸指紋特征圖譜，通過計算機軟件進行匯總和整理，得到所述的細菌核酸指紋特征圖譜庫。
7.權利要求7的方法，其中所述軟件是BioExplore軟件，其版權號為軟著登字第136879 號、登記號 2009SR10700。
8.利用權利要求5或6的方法所建立的細菌核酸指紋特征圖譜，用于細菌鑒定或分類的方法，包括 (I )PCR反應使用針對細菌的PCR通用引物，擴增待測細菌的核酸模板，得到含擴增目標區域的PCR產物； (2)SAP酶消化用堿性磷酸酶(SAP酶)處理步驟(I)得到的PCR產物； (3)轉錄和核酸酶切使用特定的轉錄和內切酶，在一個反應體系中，對步驟(2)得到的細菌的消化產物進行轉錄和核酸酶切，獲得一系列長度不一、豐度不一的核酸片段； (4)純化使用樹脂處理步驟(3)得到的酶切產物； (5)質譜儀檢測將步驟(4)得到的純化產物上點在含有基質的靶片上，上質譜儀進行檢測，得到該細菌的核酸指紋特征圖譜； (6)將所得核酸指紋特征圖譜與細菌核酸指紋特征圖譜庫進行比較，從而判斷待測細菌的類別或種屬。
9.權利要求7的方法,其中步驟6通過BioExplore軟件進行比較檢測。
10.提供能用于細菌分類和鑒定、耐藥篩選用途的試劑盒，包括 (1)用于擴增細菌16SrDNA的通用引物對及其緩沖液； (2)SAP酶及其緩沖液； (3)RNAase及其緩沖液； (4)用于純化酶切產物的樹脂； (5)用于比對核酸指紋特征圖譜的分析軟件。
11.權利要求9的試劑盒，其中所述引物是SEQID NO: 1-2，所述軟件是BioExplore軟件，所述細菌16S rDNA區域選自SEQ ID N0:3所示的區域。
全文摘要
本發明公開了一種用于細菌16S rDNA核酸指紋圖譜制備的方法，包括PCR擴增、SAP酶消化、轉錄和核酸酶切、純化、質譜儀檢測等步驟。基于該方法，建立常見細菌的核酸指紋圖譜數據庫。根據實驗產生的質譜峰圖，可對待檢細菌進行分類與鑒定，結果可廣泛運用于細菌分類和鑒定、遺傳進化分析、耐藥篩選用途以及進出口檢驗等領域。
文檔編號C12Q1/68GK103060431SQ20121027332
公開日2013年4月24日 申請日期2012年8月2日 優先權日2012年8月2日
發明者馬慶偉, 趙洪斌, 張海燕, 趙艷梅 申請人:向華