專利名稱：一種鱇浪白魚肌肉細胞系的構建方法
技術領域：
本發明涉及一種錬浪白魚肌肉細胞系的構建方法，屬于淡水水生生物細胞培養技術。
背景技術：
魚類的細胞培養起于20世紀60年代初，由Clem等研究海水魚類的組織培養開始，至今已有250余株細胞系。我國魚類細胞的培養起步于20世紀70年代，早期的研究大多集中在淡水養殖魚類，特別是鯉科養殖魚類，迄今已建立了超過40株細胞系，主要來自20多種魚類,而云南的土著魚類涉及極少。錬浪白魚Anabarilius grahami 隸屬于鯉形目 Cypriniforms、鯉科 Cyprinidae、 白魚屬Anabarilius,俗稱白魚,是僅產于云南撫仙湖的珍稀魚種,是云南四大名魚之一。此魚肉細嫩鮮美，軟刺薄鱗，清香可ロ。該魚曾是撫仙湖的主產魚種，多年來，由于外來魚種入侵，以及水質惡化，捕撈過度，已處于瀕危邊緣。雖然1999年以來，中科院昆明動物研究所人工繁殖成功，保護并挽救了這ー珍稀魚種，使其近年產量保持平穩，但由于養殖魚類本身的局限性，病害問題一直是制約養殖業健康發展的瓶頸。而從根本上解決錬浪白魚的病害問題，必須加強對錬浪白魚致病病原特性和免疫抗病基因功能的研究，細胞系是必不可少的研究工具。因此錬浪白魚肌肉細胞系的建立為實現這ー目的提供可能。經文獻檢索，未見與本發明的相同報道。
發明內容
本發明的目的是提供一種簡便易行的錬浪白魚肌肉細胞系的構建方法，以彌補現有技術的不足，滿足對錬浪白魚理論研究以及在功能基因中的應用。本發明的錬浪白魚肌肉細胞系的構建方法，具體步驟如下a.制備細胞培養液選擇DMEM/F12培養基，向培養基中加入胎牛血清和人堿性成纖維細胞生長因子，使胎牛血清的終濃度為20%，人堿性成纖維細胞生長因子的濃度為3 ng/ml。pH值為7. 0-7. 4，置于4°C冰箱中冷凍保存，備用；b.魚體消毒先用8 mg/L高錳酸鉀浸泡鮮活錬浪白魚10 min,對魚進行整體消毒，然后將錬浪白魚處死后，用無菌解剖器械取其肌肉，置于12孔板中，加入含有抗生素的PBS溶液浸泡肌肉組織10 min，其中青霉素的濃度為200 IU/ml，鏈霉素的濃度為200呢/ml，慶大霉素的濃度為 100 Mg/ml ；C.原代培養在無菌操作臺中將肌肉組織用PBS+ 200 IU/ml青霉素+200呢/ml鏈霉素+100呢/ml慶大霉素溶液清洗三次，然后用眼科剪將肌肉組織剪成碎末，并將其均勻接種于25 cm2細胞培養瓶中；28°C培養箱中正置干貼過夜，次日加入DMEM/F12+20%FBS+3 ng/mlbFGF+100 IU/ml青霉素+100 |ag/ml鏈霉素+50吒/ml慶大霉素的培養液3 ml，在28°C培養箱中進行原代培養，每隔3天半量更換培養液，第6天細胞開始遷出，第40天細胞長成單層；d.繼代培養待細胞長成單層后，吸出培養瓶中的培養液，用不含抗生素的PBS溶液清洗兩遍，加入0. 15%的胰蛋白酶I. 5 ml，消化2 min，細胞變圓后，加入DMEM/F12+20%FBS+3 ng/mlbFGF+100 IU/ml青霉素+lOOPg/ml鏈霉素+50吒/ml慶大霉素的溶液8. 5 ml，用吸管吹打培養瓶底，制成細胞懸液；然后接種于兩個培養瓶內，在28°C培養箱中培養；以后5天傳代一次，傳至第3代吋，將培養瓶中的細胞培養液全部替換成DMEM/F12+20%FBS+3 ng/ml bFGF培養液5 ml，傳至第10代吋，將培養液中血清含量降至10%，此時，細胞系建立成功。本發明的各步驟中所用的百分比為體積百分比。
本發明的有益效果在干I、操作簡便易行；2、所構建的錬浪白魚肌肉細胞系(AGM)細胞生長狀態良好，形態為成纖維樣細胞，能連續傳代50代以上，能直接用于錬浪白魚細胞生物學特性及免疫抗病基因功能的研究；3、該構建方法也適用于其他魚類肌肉細胞系。
具體實施例方式本發明的錬浪白魚肌肉細胞系的構建方法，具體步驟如下a.制備細胞培養液選擇DMEM/F12培養基，向培養基中加入胎牛血清和人堿性成纖維細胞生長因子，使胎牛血清的體積占總體積的20%,人堿性成纖維細胞生長因子的濃度為3 ng/ml。pH值為
7.0-7. 4，置于4°C冰箱中冷凍保存，備用；b.魚體消毒先用8 mg/L高錳酸鉀浸泡鮮活錬浪白魚10 min,對魚進行整體消毒，然后將錬浪白魚處死后，用無菌解剖器械取其肌肉，置于12孔板中，加入含有抗生素的PBS溶液浸泡肌肉組織10 min，其中青霉素的濃度為200 IU/ml，鏈霉素的濃度為200呢/ml，慶大霉素的濃度為 100 Mg/ml ；c.原代培養在無菌操作臺中將肌肉組織用PBS+ 200 IU/ml青霉素+200呢/ml鏈霉素+100呢/ml慶大霉素溶液清洗三次，然后用眼科剪將肌肉組織剪成碎末，并將其均勻接種于25 cm2細胞培養瓶中；28°C培養箱中正置干貼過夜，次日加入DMEM/F12+20%FBS+3 ng/mlbFGF+100 IU/ml青霉素+100 |ag/ml鏈霉素+50吒/ml慶大霉素的溶液3 ml，在28°C培養箱中進行原代培養，每隔3天半量更換培養液，第6天細胞開始遷出，第40天細胞長成單層；d.繼代培養待細胞長成單層后，吸出培養瓶中的培養液，用不含抗生素的PBS溶液清洗兩遍，加入0. 15%的胰蛋白酶I. 5 ml，消化2 min，細胞變圓后，加入DMEM/F12+20%FBS+3 ng/mlbFGF+100 IU/ml青霉素+lOOl^g/ml鏈霉素+50 l^g/ml慶大霉素培養液8. 5 ml，用吸管吹打培養瓶底，制成細胞懸液；然后接種于兩個培養瓶內，在28°C培養箱中培養；以后5天傳代一次，傳至第3代吋，將培養瓶中的培養液替換成DMEM/F12+20%FBS+3 ng/ml bFGF培養液5 ml，傳至第10代吋，將培養液中血清含量降至10%，此時，細胞系建立成功。e.細胞凍存對上述構建的肌肉細胞進行凍存，配置細胞凍存液，分別取胎牛血清和DMS0，按9:1的體積比混合，現用現配。細胞凍存取處于對數生長期的細胞，經上述胰酶消化后獲得細胞懸液，1000 rpm離心10 min，棄掉上清液。向細胞沉淀中加入適量配置好的細胞凍存液，重懸，使細胞濃度至2X IO6個/ml，將I ml細胞懸液轉移至I. 8 ml無菌凍存管中。將凍存管放入程序降溫盒中，_80 C冰箱過夜，最后放入液氣中長期保存。f.細胞復蘇對上述凍存的細胞進行復蘇，將凍存管從液氮罐中取出，放入37°C水浴鍋中快速搖晃至融化。然后在無菌條件下將解凍細胞轉移至15ml離心管中，并加入I ml DMEM/F12+20%FBS+3 ng/ml bFGF培養液，1000 rpm離心6 min，去除上清，收集細胞。用10 ml培養液重懸細胞，并轉移至兩個細胞培養瓶中，28°C培養箱中培養。待細胞長成單層后，按步 驟d傳代。
權利要求
1.一種錬浪白魚肌肉細胞系的構建方法，其特征在于該構建方法的步驟如下 a.制備細胞培養液 選擇DMEM/F12培養基，向培養基中加入胎牛血清和人堿性成纖維細胞生長因子，使胎牛血清的終濃度為20%，人堿性成纖維細胞生長因子的濃度為3 ng/ml。pH值為7. 0-7. 4，置于4°C冰箱中冷凍保存，備用； b.魚體消毒 先用8 mg/L高猛酸鉀浸泡鮮活錬浪白魚10 min,對魚進行整體消毒,然后將錬浪白魚處死后，用無菌解剖器械取其肌肉，置于12孔板中，加入PBS+ 200 IU/ml青霉素+200 ^g/ml鏈霉素+100 l^g/ml慶大霉素的溶液浸泡肌肉組織，浸泡10 min ； c.原代培養 在無菌操作臺中將肌肉組織用PBS+ 200 IU/ml青霉素+200吒/ml鏈霉素+100吒/ml慶大霉素的溶液清洗三次，然后用眼科剪將肌肉組織剪成碎末，并將其均勻接種于25 cm2細胞培養瓶中；28°C培養箱中正置干貼過夜，次日加入DMEM/F12+20%FBS+3 ng/mlbFGF+100 IU/ml青霉素+100 |ag/ml鏈霉素+50吒/ml慶大霉素的培養液3 ml，在28°C培養箱中進行原代培養，每隔3天半量更換培養液，第6天細胞開始遷出，第40天細胞長成單層； d.繼代培養 待細胞長成單層后，吸出培養瓶中的培養液，用不含抗生素的PBS溶液清洗兩遍，カロ入0. 15%的胰蛋白酶I. 5 ml,消化2 min，細胞變圓后，加入DMEM/F12+20%FBS+3 ng/mlbFGF+100 IU/ml青霉素+lOOPg/ml鏈霉素+50吒/ml慶大霉素的細胞培養液8. 5 ml，用吸管吹打培養瓶底，制成細胞懸液；然后接種于兩個培養瓶內，在28°C培養箱中培養；以后5天傳代一次，傳至第3代吋，將培養瓶中的細胞培養液全部替換成DMEM/F12+20%FBS+3 ng/ml bFGF培養液5 ml，傳至第10代吋，將培養液中血清含量降至10%，此時，細胞系建立成功。
全文摘要
本發明涉及一種鱇浪白魚肌肉細胞系的構建方法，屬于淡水生物細胞培養技術領域。該方法首先配制細胞培養液，以鱇浪白魚肌肉組織為材料，清洗剪碎后，接種于25cm2培養瓶中，置于28℃培養箱培養。每隔3天半量更換培養液，待細胞長成單層后，采用胰蛋白酶消化法進行傳代。5天傳代一次，傳至第10代時，培養液中血清濃度降至10%，此時細胞系建立成功。本發明的有益效果在于1、操作簡便易行；2、所構建的鱇浪白魚肌肉細胞系(AGM)細胞生長狀態良好，形態為成纖維樣細胞，能連續傳代50代以上，能直接用于鱇浪白魚細胞生物學特性及免疫抗病基因功能的研究；3、該構建方法也適用于其他魚類肌肉細胞系。
文檔編號C12N5/071GK102757933SQ20121027786
公開日2012年10月31日 申請日期2012年8月7日 優先權日2012年8月7日
發明者楊君興, 潘曉賦, 王曉愛, 陳小勇 申請人:中國科學院昆明動物研究所