專利名稱：一種纖維素戊糖中溫降解產氫菌的分離方法
技術領域：
本發明涉及一種產氫菌的分離方法。
背景技術：
作物秸桿是世界上農業生產的主要副產品之一，也是草食動物最豐富的飼料來源之一，同時也是一種潛在的非競爭性資源，具有數量大、分布廣、種類多的特點。全世界每年秸桿的總產量為29億多噸，僅有10°/Γ20%作為草食家畜的飼料或其他用途，剩余的80°/Γ90%直接還田、腐爛或被焚燒掉，這樣不僅造成了巨大的資源浪費，還造成了嚴重的環境污染。通過瘤胃微生物的發酵，反芻動物能消化植物細細菌產生的纖維素酶大多結合在細胞膜上，所以細菌細胞需要吸附在纖維素材料上才能起作用，生產上使用很不方便，而且 酶的分離提取也較困難，經濟效益不高。近二、三十年來，在纖維素酶的組成及作用機制、降解纖維素菌株的選育、纖維素酶合成的控制和調節以及纖維素酶的應用等諸多方面都取得了很大的發展。但是，由于目前已有的纖維素酶的酶解效率普遍較低，遠不及淀粉酶和蛋白酶，從而很大程度上影響了纖維素酶的大量生產和廣泛應用。因此，進一步尋找和開發高效纖維素降解菌，并不斷改善和優化其培養條件，是纖維素資源能否高效利用的關鍵。目前大多數產氫菌都是在高溫下分離，且分離出來的產氫菌不能直接利用纖維素進行產氫的問題。分離出的菌種不僅可以進行戊糖發酵且可在中溫情況下直接利用纖維素產氫節省能耗。
發明內容
本發明的目的是解決目前大多數產氫菌都是在高溫下分離，且分離出來的產氫菌不能直接利用纖維素進行產氫的問題。而提供一種纖維素戊糖中溫降解產氫菌的分離方法。本發明的一種纖維素戊糖中溫降解產氫菌的分離方法，是通過以下步驟實現一、取菌源進行培養，得懸濁液；二、取步驟一得到的懸濁液以體積百分比為1%的接種量接種于以葡萄糖為碳源的液體培養基中，在37°c培養箱中培養4飛d,得菌懸液A ;三、以結晶纖維素為底物，在以纖維素為碳源的液體培養基初始PH為5. 5^7. 5，溫度為37°C的條件下對菌懸液A進行厭氧富集培養7d ;四、然后取富集培養后的菌懸液B按體積百分比為10%的接種量接種于以纖維素為碳源的液體培養基中繼續在PH為5. 5^7. 5，溫度為37°C的條件下富集培養2 3d ;五、重復步驟四3飛次，得菌懸液B ;六、取步驟五得到的菌懸液B用無菌水按10' 10_2、10' IO-4和10_5的倍數進行稀釋，將10_5倍數稀釋后的菌懸液B按10%的接種量接種于PH為5. 5^7. 5的微晶纖維素固體培養基中，在37°C培養箱中培養至出現透明圈；七、在無菌環境下，用氮氣針挑取一個的步驟六中透明圈直徑為6 10mm的菌落至以戊糖為碳源的液體培養基中，在37°C培養箱中培養f 3d ;八、重復步驟六至步驟七5次，即完成纖維素戊糖中溫降解產氫菌的分離；其中，步驟一中所述的菌源為牛瘤胃內含物。本發明的有益效果
本發明分離纖維素戊糖中溫產氫菌的方法能在中溫下分離，且分離出的產氫菌不僅能利用纖維素發酵產氫還可用于戊糖發酵產氫。目前已知的纖維素降解菌多為高溫菌，耗能較高，不利于產業化，而中溫菌的成功分離為纖維素類廢棄物降解利用的產業化實現奠定了基礎。木糖作為木質纖維素原料水解產物中含量很豐富的一種單糖，主要是由半纖維素水解生成，含量可達植物纖維素水解糖類的35%以上，在有些原料中甚至超過了葡萄糖的含量。因此是否能夠利用木糖是利用木質纖維素的關鍵。
圖I為篩選所得降解木質纖維素戊糖中溫產氫菌的透射電鏡具體實施例方式具體實施方式
一本實施方式降解木質纖維素戍糖中溫產氫菌的篩選方法按以下步驟實現一、取菌源進行培養，得懸濁液；二、取步驟一得到的懸濁液以體積百分比為1% 的接種量接種于以葡萄糖為碳源的液體培養基中，在37°c培養箱中培養4飛山得菌懸液A ;三、以結晶纖維素為底物，在以纖維素為碳源的液體培養基初始pH為5. 5^7. 5，溫度為37°C的條件下對菌懸液A進行厭氧富集培養7d;四、然后取富集培養后的菌懸液B按體積百分比為10%的接種量接種于以纖維素為碳源的液體培養基中繼續在pH為5. 5^7. 5，溫度為37°C的條件下富集培養2 3d ;五、重復步驟四3飛次，得菌懸液B ;六、取步驟五得到的菌懸液B用無菌水按10'10_2、10_3、10_4和10_5的倍數進行稀釋，將10_5倍數稀釋后的菌懸液B按10%的接種量接種于pH為5. 5^7. 5的微晶纖維素固體培養基中，在37°C培養箱中培養至出現透明圈；七、在無菌環境下，用氮氣針挑取一個的步驟六中透明圈直徑為6 10_的菌落至以戊糖為碳源的液體培養基中，在37°C培養箱中培養f 3d;八、重復步驟六至步驟七5次，即完成纖維素戊糖中溫降解產氫菌的分離；其中，步驟一中所述的菌源為牛瘤胃內含物。本實施方式分離纖維素戊糖中溫產氫菌的方法能在中溫下分離，且分離出的產氫菌不僅能利用纖維素發酵產氫還可用于戊糖發酵產氫。目前已知的纖維素降解菌多為高溫菌，耗能較高，不利于產業化，而中溫菌的成功分離為纖維素類廢棄物降解利用的產業化實現奠定了基礎。木糖作為木質纖維素原料水解產物中含量很豐富的一種單糖，主要是由半纖維素水解生成，含量可達植物纖維素水解糖類的35%以上，在有些原料中甚至超過了葡萄糖的含量。因此是否能夠利用木糖是利用木質纖維素的關鍵。
具體實施方式
二 本實施方式與具體實施方式
一不同的是步驟一中所述的取菌源進行培養是指將菌源放入裝有玻璃珠的滅菌血清瓶內，在無菌狀態下加入厭氧無菌水，再向滅菌血清瓶中通氮氣5min后，將滅菌血清瓶進行密封，并放入恒溫搖床中，在溫度為37°C，轉速為140r/min的條件下培養6 8h ;其中菌源與厭氧無菌水的體積比為I :5。其它與具體實施方式
一相同。
具體實施方式
三本實施方式與具體實施方式
一或二不同的是步驟一和步驟三中所述的以葡萄糖為碳源的液體培養基按重量份數是由I份氯化銨、I份氯化鈉、3份磷酸氫二鉀、I. 5份磷酸二氫鉀、O. 7份半胱氨酸、O. 2份硫酸鎂、O. 2份氯化鉀、2份酵母提取物、O. 5份維生素，O. 5份微量元素，O. 05份質量百分含量為O. 01%的刃天青和10份的葡萄糖組成的。其它與具體實施方式
一或二相同。
具體實施方式
四本實施方式與具體實施方式
一至三之一不同的是步驟五中所述的微晶纖維素培養基是由微晶纖維素和瓊脂粉組成；其中，微晶纖維素濃度為5g/L，瓊脂粉濃度為20g/L。其它與具體實施方式
一至三之一相同。
具體實施方式
五本實施方式與具體實施方式
一至四之一不同的是步驟五中所述的微晶纖維素液體培養基按重量份數是由I份氯化銨、I份氯化鈉、3份磷酸氫二鉀、I. 5份磷酸二氫鉀、O. 7份半胱氨酸、O. 2份硫酸鎂、O. 2份氯化鉀、2份酵母提取物、O. 5份維生素，O. 5份微量元素，O. 05份質量百分含量為O. 01%的刃天青和5份的微晶纖維素組成的。其它與具體實施方式
一至四之一相同。
具體實施方式
六本實施方式與具體實施方式
一至五之一不同的是步驟一和步 驟六中所述的以戊糖為碳源的液體培養基按重量份數是由I份氯化銨、I份氯化鈉、3份磷酸氫二鉀、I. 5份磷酸二氫鉀、O. 7份半胱氨酸、O. 2份硫酸鎂、O. 2份氯化鉀、2份酵母提取物、O. 5份維生素，O. 5份微量元素，O. 05份質量百分含量為O. 01%的刃天青和5份的戊糖組成的。其它與具體實施方式
一至五之一相同。通過以下試驗驗證本發明的效果本試驗的一種纖維素戊糖中溫降解產氫菌的分離方法按以下步驟實現一、將10. Og新鮮牛瘤胃內含物放入裝有細小玻璃珠的250mL滅菌血清瓶中，在無菌狀態下，加入50mL厭氧無菌水，通純度為99. 99%的氮氣5min后密封滅菌血清瓶，并放入恒溫搖床中，在溫度為37°C，轉速為140r/min的條件下培養8h ;得懸濁液A ;二、取IOmL步驟一得到的得懸濁液A放入以葡萄糖為碳源的液體培養基中，在37°C培養箱中培養6d，得菌懸液B ;三、以結晶纖維素為底物，在培養基初始pH為5. 5、6、6. 5、7和7. 5的條件下對菌懸液B進行厭氧富集培養7d ;四、然后取5mL富集培養后的菌懸液B放入50mL以纖維素為碳源的液體培養基繼續富集培養疒3d ;五、重復步驟四4次，得菌懸液；六、取步驟五得到的菌懸液用無菌水按10'10_2、10_3、10_4和10_5倍數依次進行稀釋，取10_5倍數稀釋后的菌懸液ImL分別放入為pH為5. 5、6、6. 5、7和7. 5的5mL的微晶纖維素固體培養基中，在37°C培養箱中培養至出現透明圈；七、在無菌環境下，用氮氣針挑取一個的步驟六中直徑為IOmm的透明圈至戊糖液體培養基中，在70°C下水浴處理5min，然后將固體盡量碾碎后在37°C培養箱中培養3d，檢測液體培養基中的氣相，有氫氣產生的即為目的細菌；八、重復步驟六至步驟七5次，即完成纖維素戊糖中溫降解產氫菌的分離。本試驗的牛瘤胃內含物取自哈爾濱畜牧廠。本試驗的微晶纖維素固體培養基是由濃度為5g/L的微晶纖維素濃度和濃度為20g/L的瓊脂粉組成。本試驗的以葡萄糖為碳源的液體培養是由IOg的葡萄糖、I. Og的氯化銨、I. Og的氯化鈉、3g的磷酸氫二鉀、3g的磷酸二氫鉀、O. 7g的半胱氨酸、O. 2g的氯化鎂、O. 2g的氯化鉀、2g的酵母提取物、ImL的維生素、ImL的微量元素、3 4滴濃度為O. 01% (w/v)的刃天青組成的。本試驗的以戊糖為碳源的液體培養是由5g的戊糖、I. Og的氯化銨、I. Og的氯化鈉、3g的磷酸氫二鉀、3g的磷酸二氫鉀、O. 7g的半胱氨酸、O. 2g的氯化鎂、O. 2g的氯化鉀、2g的酵母提取物、ImL的維生素、ImL的微量元素、3 4滴濃度為O. 01% (w/v)的刃天青組成的。本試驗分離的纖維素戊糖中溫降解菌通過原子力顯微鏡照片和透射電鏡照片表述菌體形態。如圖I所示，纖維素戊糖中溫降解菌為革蘭氏陽性菌，細菌呈球星或卵圓形，在液體培養基中成短鏈，有時以鞭毛運動，無明顯莢膜。本試驗中篩選所得的纖維素戊糖中溫降解菌在厭氧條件下取2. 5mL至50mL微晶纖維素液體培養基中，在37°C，140r/min條件 下培養一周，發酵2(T30h，累積產氣量即達到最大值為130mL/L，且除該細菌除產生氫氣與二氧化碳外無任何雜質氣體，減免雜質氣體去除步驟，且發酵溫度為37°C減少工業能耗，進而為生物質制氫工業化奠定基礎。
權利要求
1.一種纖維素戊糖中溫降解產氫菌的分離方法，其特征在于纖維素戊糖中溫降解產氫菌的分離方法是通過以下步驟實現一、取菌源進行培養，得懸濁液；二、取步驟一得到的懸濁液以體積百分比為1%的接種量接種于以葡萄糖為碳源的液體培養基中，在37°c培養箱中培養4飛d，得菌懸液A ;三、以結晶纖維素為底物，在以纖維素為碳源的液體培養基初始pH為5. 5^7. 5，溫度為37°C的條件下對菌懸液A進行厭氧富集培養7d ;四、然后取富集培養后的菌懸液B按體積百分比為10%的接種量接種于以纖維素為碳源的液體培養基中繼續在PH為5. 5^7. 5，溫度為37°C的條件下富集培養2 3d ;五、重復步驟四3飛次，得菌懸液B ;六、取步驟五得到的菌懸液B用無菌水按10'10_2、10_3、10_4和10_5的倍數進行稀釋，將.10_5倍數稀釋后的菌懸液B按10%的接種量接種于pH為5. 5^7. 5的微晶纖維素固體培養基中，在37°C培養箱中培養至出現透明圈；七、在無菌環境下，用氮氣針挑取一個的步驟六中透明圈直徑為6 10mm的菌落至以戊糖為碳源的液體培養基中，在37°C培養箱中培養f3d ；八、重復步驟六至步驟七5次，即完成纖維素戊糖中溫降解產氫菌的分離；其中，步驟一中所述的菌源為牛瘤胃內含物。
2.根據權利要求I所述的一種纖維素戊糖中溫降解產氫菌的分離方法，其特征在于步驟一中所述的取菌源進行培養是指將菌源放入裝有玻璃珠的滅菌血清瓶內，在無菌狀態下加入厭氧無菌水，再向滅菌血清瓶中通氮氣5min后，將滅菌血清瓶進行密封，并放入恒溫搖床中，在溫度為37°C,轉速為140r/min的條件下培養6 8h ;其中菌源與厭氧無菌水的體積比為I :5。
3.根據權利要求I所述的一種纖維素戊糖中溫降解產氫菌的分離方法，其特征在于步驟一和步驟三中所述的以葡萄糖為碳源的液體培養基按重量份數是由I份氯化銨、I份氯化鈉、3份磷酸氫二鉀、I. 5份磷酸二氫鉀、O. 7份半胱氨酸、O. 2份硫酸鎂、O. 2份氯化鉀、2份酵母提取物、O. 5份維生素，O. 5份微量元素，O. 05份質量百分含量為O. 01%的刃天青和.10份的葡萄糖組成的。
4.根據權利要求I所述的一種纖維素戊糖中溫降解產氫菌的分離方法，其特征在于步驟五中所述的微晶纖維素固體培養基是由微晶纖維素和瓊脂粉組成；其中，微晶纖維素濃度為5g/L，瓊脂粉濃度為20g/L。
5.根據權利要求I所述的一種纖維素戊糖中溫降解產氫菌的分離方法，其特征在于步驟五中所述的微晶纖維素液體培養基按重量份數是由I份氯化銨、I份氯化鈉、3份磷酸氫二鉀、I. 5份磷酸二氫鉀、O. 7份半胱氨酸、O. 2份硫酸鎂、O. 2份氯化鉀、2份酵母提取物、O. 5份維生素，O. 5份微量元素，O. 05份質量百分含量為O. 01%的刃天青和5份的微晶纖維素組成的。
6.根據權利要求I所述的一種纖維素戊糖中溫降解產氫菌的分離方法，其特征在于步驟一和步驟六中所述的以戊糖為碳源的液體培養基按重量份數是由I份氯化銨、I份氯化鈉、3份磷酸氫二鉀、I. 5份磷酸二氫鉀、O. 7份半胱氨酸、O. 2份硫酸鎂、O. 2份氯化鉀、2份酵母提取物、O. 5份維生素，O. 5份微量元素，O. 05份質量百分含量為O. 01%的刃天青和5份的戊糖組成的。
全文摘要
一種纖維素戊糖中溫降解產氫菌的分離方法，它涉及一種中溫產氫菌的分離方法。它解決了目前大多數產氫菌都是在高溫下分離，且分離出來的產氫菌不能直接利用纖維素進行產氫的問題。其特征在于它是通過以下步驟實現1.菌懸液的制備；2菌懸液A的富集；3按不同pH值對菌懸液A進行選擇性富集；4對不用pH下的富集液倍比稀釋以微晶纖維素為底物進行滾管5挑取滾管中的透明圈至戊糖液體培養基培養6檢測液體培養基中的氣相，有氫氣產生的即為目的細菌7重復步驟4到步驟6五次，即可分離。本發明分離纖維素戊糖中溫產氫菌的方法能在中溫下分離，且分離出的產氫菌不僅能利用纖維素發酵產氫還可用于戊糖發酵產氫。
文檔編號C12N1/20GK102757927SQ20121027910
公開日2012年10月31日 申請日期2012年8月7日 優先權日2012年8月7日
發明者任南琪, 張璐, 邢德峰 申請人:哈爾濱工業大學