一種苯胺降解菌及其用圖
【專利摘要】本發明屬于生物降解技術領域，本發明提供了一種具有苯胺降解能力的Pigmentiphaga daeguensis。該菌為革蘭氏陰性菌，菌落白色，圓形，光滑不透明，稍突起，邊緣整齊。該菌于2016年3月10日在廣東省微生物菌種保藏中心保藏，保藏號為：GDMCC No:60017。該菌應用于低濃度苯胺廢水的深度處理，能在低濃度的苯胺廢水中生長良好，降解苯胺速度快，無二次污染，使用安全，不會影響原有處理系統的微生物系統。GDMCC No：6001720160310
【專利說明】
一種苯胺降解菌及其用途
技術領域
[0001] 本發明屬于生物降解技術領域，具體涉及一種苯胺降解菌及其用途，尤其是涉及 一種低濃度苯胺的降解菌及其用途。
【背景技術】
[0002] 芳香族有機化合物對地表水和地下水的污染已成為人類面臨的最嚴重的環境問 題之一。苯胺作為最簡單的一級芳香胺，是一種用量較大的化工原料，被廣泛應用于印染、 國防、農藥、橡膠等行業。同時，苯胺也是一些含苯胺類化合物生物降解后的中間產物，它的 毒性極強，是一種較為常見的水體污染物。隨著工業的發展，生產或使用苯胺的企業所釋放 的含苯胺工業廢氣會污染大氣。苯胺可以通過工業企業和居民點的廢水進入環境。對人而 言，苯胺是典型的高鐵血紅蛋白的形成體，使細胞失去攜氧功能，具溶血作用，它主要通過 吸入或食入等方式進入人體，然后與血紅蛋白結合，降低甚至剝奪了其與氧的結合機率，最 終導致中毒現象的發生;而且它能夠損傷肝功能，引起肝炎，甚至引發一些癌癥。故苯胺類 污染物已被美國、日本等國列入主要監測項目或優先監測的污染物黑名單。1989年苯胺類 化合物已被中國列為"環境優先控制污染物"物質之一。
[0003] 目前處理苯胺廢水的方法主要有物理法、化學法和生物法。
[0004] 物理法包括吸附法和萃取法，主要適用于高濃度苯胺廢水，可實現苯胺的回收利 用。吸附法是采用吸附材料處理苯胺廢水的方法，在工程運用中操作簡易，運營簡單，但吸 附劑購置成本高，再生困難，且吸附法常會造成二次污染。萃取法是采用能溶解污染物但不 溶于水的萃取劑，在其與廢水充分混合接觸后，利用污染物在水中和溶劑中不同的分配比 實現污染物分離和提取的一種廢水凈化方法。萃取法對處理設備要求簡單，工藝簡易，但同 樣需要再生處理，且有機溶劑可能造成二次污染。萃取只是一個污染物的物理轉移過程，而 非真正意義上的降解。
[0005] 化學法包括光催化氧化法、超臨界水氧化法和超聲波降解法等。光催化氧化技術 需要光、催化劑和空氣，具有能耗低、操作簡便、反應條件溫和、反應范圍廣、可減少二次污 染等突出優點。而光催化氧化法在處理高濃度工業廢水中存在納米材料容易聚集的問題， 且處理費用高。超臨界水氧化技術(SCWO)以超臨界水為反應介質，空氣、氧氣或過氧化氫等 為氧化劑，通過高溫高壓下的自由基反應，將苯胺等有機物氧化分解為二氧化碳、水、氮氣 以及無機鹽等無毒的小分子化合物，具有反應速率快和二次污染小的優點。但其不足之處 是反應需在高溫高壓下進行，設備要求高，造價高。超聲波降解法是利用聲空化能量加速和 控制化學反應提高反應速率的一種新技術，具有降解效率高、反應時間短、設施簡單、占地 面積小等優點，但耗能巨大，噪音大，經濟性不夠理想。
[0006] 利用微生物法降解廢水中苯胺類化合物是一種經濟有效且無二次污染的方法，尤 其適合于含有低濃度苯胺類化合物的廢水深度處理。目前，國內外的學者對苯胺類化合物 降解菌開展了大量的研究工作，已篩選到多株高效的降解菌，但都是針對菌株耐受性和對 高濃度苯胺降解性的研究開發，仍不能滿足對低濃度苯胺廢水深度處理和零排放的需求。 因此，通過篩選能夠快速完全降解低濃度苯胺的菌株，豐富微生物菌種資源，闡明微生物快 速完全降解苯胺的特性等研究顯得尤為重要。
【發明內容】
[0007] 有鑒于此，本發明的目的在于提供一種苯胺降解菌及其用途。
[0008] 一種苯胺降解菌，保藏在廣東省微生物菌種保藏中心，保藏編號為GDMCC No: 60017。
[0009] 本發明所述苯胺降解菌是篩選自中山某印染廢水處理廠的印染污泥，經苯胺馴 化、分離及純化得到的一株菌。具體方法為:將印染污泥進行洗泥除去雜質，取20g污泥放在 200mL以苯胺(50mg/L)為唯一碳氮源的無機鹽液體培養基中培養7天后，以10%的接種量轉 接到苯胺濃度為l〇〇mg/L的無機鹽液體培養基中進行馴化培養7天，之后再以10%的接種量 繼續轉接到苯胺濃度為150mg/L的無機鹽液體培養基中馴化培養7天。取適量培養液經十倍 系列稀釋，并在以苯胺為唯一碳氮源的固體培養基（l〇〇mg/L)表面進行涂布培養，培養7天 后，挑取單菌落進行劃線純化，直至培養基上為單一菌落即為純菌，分別測定各菌的降解效 果，選取其中的優勢菌株，得到苯胺的降解菌AN-4a。
[0010] 本發明所述苯胺的降解菌AN_4a為革蘭氏陰性好氧菌，桿狀，菌落白色，圓形，光滑 不透明，稍突起，邊緣整齊。氧化酶陽性，接觸酶陽性，賴氨酸脫羧酶陰性，鳥氨酸脫羧酶陰 性，精氨酸雙水解酶陰性。生長溫度15~45°C、生長pH為5~10。經過16S rDNA測序及同源性 比較，得到與本發明所述苯胺的降解菌AN_4a最相近的是Pigmentiphaga daeguensis sp.， 同源性為99 %。結合生理生化鑒定結果，確定本發明所述苯胺的降解菌AN-4a屬于 Pigmentiphaga daeguensis〇
[0011]本發明所述苯胺的降解菌AN-4a已于2016年3月10日在廣東省微生物菌種保藏中 心(GDMCC)進行了保藏，保藏中心地址為中國廣州市先烈中路100號大院59號樓5樓廣東省 微生物研究所，保藏號為GDMCC N〇:60017。
[0012] 本發明還提供了所述苯胺的降解菌AN_4a在處理苯胺類廢水中的用途。尤其是低 濃度苯胺類廢水的生物強化處理。
[0013] 本發明還提供了一種苯胺類廢水的處理方法，將本發明所述苯胺的降解菌4a懸浮 于含苯胺的污水中培養。
[0014] 其中，所述處理方法中所述廢水中苯胺的濃度為10mg/L。
[0015] 在一些實施方案中，本發明所述處理方法中所述苯胺的降解菌的接種量為20%以 上，優選為20 %。
[0016] 在一些實施方案中，本發明所述處理方法中所述培養pH值為7~9。優選為，pH值為 7〇
[0017] 本發明所述處理方法中所述培養溫度為30~40°C。優選為30°C
[0018] 本發明所述處理方法中所述培養時間為12小時以上。優選為12小時。
[0019]由上述技術方案可知，本發明提供了一種具有苯胺降解能力的菌Pigmentiphaga daeguensis。該菌為革蘭氏陰性菌，菌落白色，圓形，光滑不透明，稍突起，邊緣整齊。該菌于 2016年3月10日在廣東省微生物菌種保藏中心保藏，保藏號為:GDMCC No :60017。該菌應用 于低濃度苯胺廢水處理，能在低濃度的苯胺廢水中生長良好，降解苯胺速度快，無二次污 染，使用安全，不會影響原有處理系統的微生物系統。
【附圖說明】
[0020] 為了更清楚地說明本發明實施例或現有技術中的技術方案，下面將對實施例或現 有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹。
[0021] 圖1示苯胺降解菌AN-4a的PCR產物瓊脂糖電泳圖，圖中標注1和2為苯胺降解菌4a 的16S rDNA條帶；
[0022] 圖2示苯胺降解菌AN_4a在苯胺初始濃度不同條件下對苯胺的降解效果圖；
[0023]圖3示苯胺降解菌AN_4a在接種量不同條件下對苯胺的降解效果圖；
[0024] 圖4示苯胺降解菌AN_4a在培養液pH值不同條件下對苯胺的降解效果圖；
[0025] 圖5示苯胺降解菌AN_4a在培養溫度不同條件下對苯胺的降解效果圖；
[0026] 圖6示苯胺降解菌AN_4a在不同的反應時間下苯胺的降解效果圖。
[0027]生物保藏說明
[0028] 分類命名：Pigmentiphaga daeguensis于2016年3月10日保藏在廣東省微生物菌 種保藏中心，地址為中國廣州市先烈中路100號大院59號樓5樓廣東省微生物研究所，保藏 編號為GDMCC No :60017。
【具體實施方式】
[0029] 下面將結合本發明實施例，對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述， 顯然，所描述的實施例僅僅是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發明中的 實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都 屬于本發明保護的范圍。
[0030] 為了進一步理解本發明，下面結合具體實施例，對本發明做詳細闡述。如無特殊說 明，本發明所采用的方法均為本領域常規的方法。
[0031] 實施例1、菌種的分離、純化
[0032]將印染污泥進行洗泥，取20g污泥放在200mL以苯胺(50mg/L)為唯一碳氮源的無機 鹽液體培養基中培養7天后，以10%的接種量轉接到苯胺濃度為100mg/L的無機鹽液體培養 基中進行馴化，再培養7天后，以10%的接種量轉接到苯胺濃度為150m g//L的無機鹽液體培 養基中進行馴化。取培養液在以苯胺為唯一碳氮源的固體培養基中稀釋涂布，培養7天后， 挑取單菌落劃線純化，直到平板上為單一菌落即為純菌，分別測定各菌的降解效果，選取其 中的優勢菌株AN-4a。
[0033] 其中，無機鹽液體培養基的配方（IL)為:NaCl 0.2g，K2HP〇4〇.2g，KH2P〇4〇.2g，微量 元素溶液2mL。
[0034] 微量元素溶液的配方（IL) :FeS〇4 300mg，CuS〇4 · 5H20 38mg，ZnS〇4 · 7H20 115mg， MnS〇4 169mg，H3B03 116mg，CoCl · 6H2O 24mg，NaMo · 2H20 17mg。
[0035] 固體培養基配方（IL)為無機鹽液體培養基中加20g瓊脂。
[0036] 實施例2、菌株的生理生化試驗鑒定
[0037]對篩選的菌株AN_4a進行初步的生理生化鑒定，包括菌落形態檢測、革蘭氏測定、 厭氧生長試驗、氧化酶實驗、接觸酶反應、賴氨酸脫羧酶試驗、鳥氨酸脫羧酶試驗、精氨酸雙 水解酶實驗等，所述試驗方法采用本領域的測定這類生理生化指標的常規試驗方法。
[0038]結果顯示菌株AN_4a為革蘭氏陰性好氧菌，桿狀，菌落白色，圓形，光滑不透明，稍 突起，邊緣整齊。氧化酶陽性，接觸酶陽性，賴氨酸脫羧酶陰性，鳥氨酸脫羧酶陰性，精氨酸 雙水解酶陰性。生長溫度15~45 °C、生長pH為5~10。
[0039] 實施例3、菌株的16S rDNA鑒定
[0040] 通過16S rRNA序列分析和Biolog微生物鑒定系統鑒定，確定菌株AN_4a屬于 Pigmentiphaga daeguensis sp·。具體步驟如下：
[00411 采用常規酚法提取菌株AN-4a的DNA，用通用引物擴增16S rDNA序列。
[0042] PCR反應體系（50yL)為：10X PCR緩沖液5yL、dNTP 4yL、引物各lyL、DNA模板2.5yL、 TakaraTaq酶0.25yL、超純水36μΙ^Ρ0Κ擴增程序為94°C3min; 94°C Imin，52°C Imin，72°C 1.51^11，30個循環;72°(：1〇1^11。瓊脂糖電泳檢測擴增產物，結果見圖1。擴增產物送上海生工 生物科技有限公司進行測序。測序結果如SEQ ID NO: I所示。
[0043] 將測得的16S rDNA序列輸入GenBank，應用BLAST軟件進行同源性搜索。選取不同 菌株的16S rDNA序列并與GenBank中已知的16S rDNA進行同源性比較。將該PCR擴增產物在 GenBank中進行blast比對結果表明，與其最相近的是Pigmentiphaga daeguensis sp.，同 源性為99 %。
[0044]由此結合實施例2所示的菌株生理生化指標可推斷AN_4a屬于Pigmentiphaga daeguensis sp.〇
[0045]實施例4、苯胺降解菌AN_4a在苯胺初始濃度不同條件下對苯胺的降解效果實驗 [0046]取保存的苯胺降解菌AN-4a斜面菌種接種到LB液體培養基中，于30°C，160r/min條 件下搖床活化菌種，使菌液的0D600值達到0.5，以IOOyL活化菌液接種到苯胺濃度為IOmg/ L、50mg/L和100mg/L的無機鹽液體培養基中，分別在0小時、12小時、24小時、36小時和48小 時后用N-(l-萘基)乙二胺偶氮光度法測定苯胺的濃度，結果見圖2。
[0047]由圖2可以看出，在苯胺濃度為10mg/L的條件下，在12小時后降解菌AN_4a對苯胺 的降解率達到95%以上，而在50mg/L和100mg/L條件下，在12小時后降解菌AN-4a對苯胺的 降解率分別只達到17%和44%。表明降解菌AN-4a適宜低濃度苯胺的高效降解。
[0048]實施例5、苯胺降解菌AN_4a在接種量不同條件下對苯胺的降解效果實驗，
[0049]取保存的苯胺降解菌AN-4a斜面菌種接種到LB液體培養基中，于30°C，160r/min條 件下搖床活化菌種，使菌液的0D600值達到0.5，以0. lmL、0.5mL、lmL、2mL、4mL、8mL活化菌液 離心后，接種到20mL苯胺濃度為10mg/L的無機鹽溶液中，分別在0小時和24小時后用N-(l-萘基)乙二胺偶氮光度法測定苯胺的濃度，結果見圖3。
[0050]由圖3可以看出，隨著接種量的增加，降解菌AN_4a對苯胺的降解率逐步提高。當接 種量達到4mL以上時，苯胺的降解率達到100%。考慮實際應用，優選降解菌AN-4a的最佳接 種量為20 %。
[0051]實施例6、苯胺降解菌AN_4a在培養液pH值不同條件下對苯胺的降解效果實驗 [0052]取保存的苯胺降解菌AN-4a斜面菌種接種到LB液體培養基中，于30°C，160r/min條 件下搖床活化菌種，使菌液的0D600值達到0.5，以4mL活化菌液離心后，接種到20mL pH值分 別為5、6、7、8、9、10，苯胺濃度為1〇11^/1的無機鹽溶液中，分別在0小時和24小時后用1(1-萘基)乙二胺偶氮光度法測定苯胺的濃度，結果見圖4。
[0053]由圖4可以看出，pH值為5時，苯胺的去除率最低，只有22.5 %，隨著pH值增加到7 時，苯胺的去除率達到1 〇〇 %，當pH值為10時，去除率下降到74.8 %。表明，降解菌AN-4a最適 生長、降解pH值處于7~9之間，考慮實際情況，降解菌培養pH值選擇為7較為合理。
[0054]實施例7、苯胺降解菌AN_4a在溫度不同條件下對苯胺的降解效果實驗 [0055]取保存的苯胺降解菌AN-4a斜面菌種接種到LB液體培養基中，于30°C，160r/min條 件下搖床活化菌種，使菌液的0D600值達到0.5，以4mL活化菌液離心取上清液后，接種到 20mL苯胺濃度為IOmg/L的無機鹽溶液中，分別置于15 °C、20 °C、25 °C、30 °C、35 °C、40 °C搖床 中培養，在〇小時和24小時后用N-(l-萘基)乙二胺偶氮光度法測定苯胺的濃度，結果見圖5。 [0056]由圖5可以看出，15°C時24小時后苯胺去除率最低，只達到3.3%;20°(：和25°(：時去 除率稍高，分別達到6.7 %和24.3% ; 30~40°C時，去除率達到100 %。表明降解溫度處于30 ~40°C之間降解菌4a最適生長。考慮應用的實際情況，降解菌AN-4a的培養溫度選定為30 cC。
[0057]實施例8、苯胺降解菌AN_4a不同的反應時間后的苯胺降解效果 [0058]取保存的苯胺降解菌AN-4a斜面菌種接種到LB液體培養基中，于30°C，160r/min條 件下搖床活化菌種，使菌液的0D600值達到0.5，以4mL活化菌液離心后，接種到20mL pH值為 7、苯胺濃度為I Omg/L的無機鹽溶液中，置于30 °C搖床中培養，在0小時、6小時、12小時、15小 時、18小時、21小時、24小時后測定0D600值和用N-(l-萘基）乙二胺偶氮光度法測定苯胺的 濃度。結果見圖6。
[0059]由圖6可以看出，降解菌AN-4a在接種量為4mL、培養液pH值為7,培養溫度為30 °C的 條件下，12小時后對苯胺的降解率達到100%，實現完全降解。菌濃度隨時間增大，表明降解 菌AN-4a利用苯胺作為唯一碳氮源，提供生長所需的能量。在苯胺完全降解后，菌濃度仍然 繼續增大，表明降解菌AN-4a能利用苯胺的降解產物，作為營養物質，為菌的生長提供能量。
【主權項】
1. 一種苯胺降解菌，保藏在廣東省微生物菌種保藏中心，保藏編號為GDMCC N〇:60017。2. 權利要求1所述苯胺降解菌在處理低濃度苯胺廢水中的用途。3. -種低濃度苯胺廢水的處理方法，將權利要求1所述苯胺降解菌懸浮于含低濃度苯 胺的廢水中培養。4. 根據權利要求3所述的處理方法，所述廢水中苯胺的濃度為10mg/L。5. 根據權利要求3所述的處理方法，所述苯胺降解菌的接種量為20 %。6. 根據權利要求3所述的處理方法，所述培養pH值為7~9。7. 根據權利要求3所述的處理方法，所述培養溫度為30~40°C。8. 根據權利要求3所述的處理方法，所述培養時間為12小時以上。
【文檔編號】C12N1/20GK105861375SQ201610278249
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年4月29日
【發明人】許燕濱, 黃加興, 梁卓穎, 孔秋丹, 張小花
【申請人】廣東工業大學