專利名稱：改進的酮還原酶多肽、其編碼基因以及表達該多肽的細胞的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種改進的酮還原酶多肽、其編碼基因以及表達該多肽的細胞。
背景技術：
去氧腎上腺素(phenyl印hrine)又名苯腎上腺素，其化學學名為3_ (2- (N-甲基氨基)-1-羥基)苯酚。它在臨床上常用于陣發性室上性心動過速，可通過收縮血管，升高血壓使迷走神經反射的興奮而心率減慢。去氧腎上腺素的合成方法包括化學法和生物法，將其酮底物立體選擇性還原成具有手性結構的產物。采用生物法制備去氧腎上腺素需要使用具有立體選擇性的酮還原酶。 然而，現有的野生型酮還原酶KRED，其催化活性很低，例如，10g/l粗酶粉20小時只能完全轉化lg/1的酮底物，無法滿足工業化生產的需要。目前對于去氧腎上腺素的生物制備，還沒有一種既具有一定立體選擇性，又具有較好催化活性的酮還原酶。
發明內容
本發明一方面提供了一種該改進的酮還原酶多肽的酶活性高于野生型酮還原酶多肽的酶活性；所述酶活性是指催化酮類化合物發生還原反應生成手性醇的酶活性；所述野生型酮還原酶多肽具有SEQ ID No. 2所示氨基酸序列，且來源于高加索乳酸桿菌 Lactobacillus kef iri DSM 20587 ；所述改進的酮還原酶多肽包含與SEQ ID No. 2所示氨基酸序列有至少90%序列同源性的氨基酸序列，并且該改進的酮還原酶多肽的氨基酸序列中對應于SEQID No. 2所示氨基酸序列中的第94位殘基為酪氨酸殘基。在本發明的一個具體實施方案中，所述酶活性是指催化底物1-(3-羥基苯基)-2_[甲基(苯基甲基)氨基]乙酮發生還原反應生成3- ((R)-2- (N-芐基-N-甲基氨基)-I-羥基)的酶活性。3- ((R) -2- (N-芐基-N-甲基氨基)-I-羥基)的酶活性經過還原反應脫去芐基后生成去氧腎上腺素。在本發明的一個具體實施方案中，所述改進的酮還原酶多肽具有如SEQ IDNo. 4所示氨基酸序列。在本發明的一個具體實施方案中，該改進的酮還原酶多肽的酶活性是所述野生型酮還原酶多肽的酶活性的至少2倍。本發明另一方面還提供了編碼上述改進的酮還原酶多肽的基因，其包含與SEQ IDNo. I所示核苷酸序列有至少90%序列同源性的核苷酸序列。在本發明的一個具體實施方案中，該基因具有如SEQ ID No. 3所不核苷酸序列。本發明再一方面還提供了一種細胞，該細胞表達上述的改進的酮還原酶多肽。
優選的，所述細胞屬于乳酸桿菌或大腸桿菌。更優選的，所述乳酸桿菌屬于高加索乳酸桿菌。在本發明的一個具體實施方式
中，所述大腸桿菌為E. coli. BL21 (DE3)。
具體實施例方式下面將通過實施例對本發明的技術內容作進一步的闡述，其目的是為了更好的理解本發明的內容。因此，所舉的例子并不限制本發明的保護范圍。實施例I一、制備能夠表達如SEQ ID No. 4所示氨基酸序列的改進的酮還原酶多肽的宿主細胞步驟I :全基因合成如SEQ ID No. I所示核苷酸序列步驟2 :引入對第94位氨基酸的飽和突變為了將飽和突變引入SEQ ID No. I所示核苷酸序列，我們以含有SEQ ID No. I所示核苷酸序列的質粒pET21b-KREDlk作為PCR反應模板，并設計了以下兩對引物上游引物Fl: 5，-AGGGCTGCATATGACTGATCGTTTAAAACAC-3’ (SEQ ID No. 5)下游引物Rl: 5’ -CTCAAGCTTTTATTGAGCAGTGTATCCACC-3，(SEQ ID No. 6)上游引物Fl和下游引物Rl序列中標注下劃線處表示酶切位點突奪引物F2:5’ -CAATGCCGGAAGTNNSGTCCTCAAGAG-3，(SEQ ID No. 7)突奪引物R2:5’ -CTCTTGAGGACSNNACTTCCGGCATTG-3，(SEQ IDNo. 8)突變引物F2和突變引物R2序列中標注下劃線處表示突變位點的簡并堿基以質粒PET21b_KREDlk為模板，進行第一輪PCR反應，按以下次序，將各成分在滅菌 EP 管中混合，采用 25 u I 反應體系ddH20 16. 3 u I, PCR Buffer 2. 5u I, dNTP 2u I,引物 Fl(10iimol/L)2ii 1，$*R2(10iimol/L)2iil，pET21b-KREDlk I u I, Pfu DNA 聚合酶(5U/u 1)0. 2 u I。擴增條件為94°C 2min, 一個循環；94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 20s, 30 個循環；72°C，lOmin，一個循環。將所得的擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收在300bp處的特異性條帶，使用博大泰克DNA片段快速回收試劑盒進行回收。然后進行第二輪PCR反應，反應體系為ddH20 16. 3 u I, PCR Buffer 2. 5u I, dNTP 2u I,引物 F2 (10 y mol/L)2u I,引物 Rl(10iimol/L)2ii l，pET21b-KREDlk I u I, Pfu DNA 聚合酶 0. 2 y I。擴增條件為94°C 2min，一個循環；94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 30s，30 個循環；72°C，lOmin，一個循環。將所得的擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，回收在500bp左右的特異性條帶。然后，以 前二輪PCR的產物為模板，進行第三輪PCR，反應體系如下ddH20 14. 3 u I, PCR Buffer2. 5 iil, dNTP 2 iil, $*Fl(10iimol/L)2iil,引物 Rl (10 y mol/L) 2 y 1，第一輪 PCR 回收產物Iu 1，第二輪PCR回收產物I iil，Pfu DNA聚合酶0. 2iil。擴增條件為94°C 2min，一個循環；94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 50s，30個循環；72°C，lOmin，一個循環。將所得的擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，回收在SOObp左右的特異性條帶。該片段中則包含了具有飽和突變的所有突變序列。步驟3 :構建突變核苷酸序列的表達載體在含有氨芐青霉素(Amp，100 U g/ml)的LB培養基中接種含有質粒pET21b的大腸桿菌ToplO菌株，于37°C搖床中培養過夜。取3ml菌液轉入EP管中，12000rpm離心lmin，收集菌體，根據博大泰克小量質粒制備試劑盒說明書操作提取pET21b質粒。
酶切質粒pET21b 的反應體系為NEB Buffer 25 u I, pET21b 43 u I1NdeIIu I1Hind III I yl，于37°C水浴中保溫4h。然后酶切步驟2獲得的突變后的基因片段，依次加入如下試劑NEB Buffer25u I,基因片段 43 yl, NdeI Iu I1Hind III lyl，于 37°C水浴中保溫4h。隨后向兩個反應體系中分別加入IOii 16*loading buffer,進行凝膠電泳檢測，膠回收被切成線性的DNA分子。在EP 管中分別加入 H2O 3. 5 u I, T41igase Buffer Iu I, pET21b (Ndel, HindIIIdigested) 2u I,步驟3所得片段被Ndel, HindIII酶切過的回收產物3 yl，T4DNAIigaseO. 5 y 1，于 16°C連接 5h。將連接產物轉化大腸桿菌BL21 (DE3)菌種取一管BL21 (DE3)感受態細胞(天根生化科技有限公司)，將10 Ul連接產物和100 ill感受態細胞混合，冰水浴中放置30min，42°C熱激90s，置于冰上5min，然后加入LB800iil，于37°C搖床中培養40min。14, OOOrpm離心，棄800 ill上清，用剩余液體懸浮沉淀的細胞，涂布于含有100 u g/ml Amp的LB平板 上，37°C培養箱中培養12-16h即可得到轉化子。然后對轉化子進行菌落PCR鑒定(使用Fl，Rl為引物)，將含有約800bp插入片段的轉化子作為陽性克隆。于96孔深孔板中每孔加入LB+Amp培養基1ml，挑選94個陽性克隆接種入96孔板，在37°C搖床中震蕩培養16h，此即為突變體庫。步驟4 :將步驟3獲得的酮還原酶突變體庫進行誘導發酵將培養過夜的突變體庫每孔取80 U I菌液接種入一個新的96孔板，該板每孔內含新鮮LB+Amp培養基1ml，細胞在37°C，160rpm條件下生長至OD6tltl值達到0. 8^1. 0，隨后加A IPTG至終濃度為I. OmM,于30°C誘導培養16小時。離心，棄上清，收集菌體供檢測活性。步驟5 :篩選表達酮還原酶多肽的宿主細胞(大腸桿菌BL21 (DE3)/pET2Ib-KRED)利用酶促反應篩選表達改進的酮還原酶多肽的宿主細胞。0. 6毫升的酶促反應體系，其中包括10g/L2_ (N-芐基-N-甲基氨基)_1_ (3_羥基)苯乙酮，0. lg/L NADPH, ImM Mg2+，500mM 磷酸鈉緩沖溶液(pH=6. 5)，10g/L 步驟四離心獲得的宿主細胞。于30°C反應24h，加入等體積乙腈終止反應，10，OOOrpm離心5min，吸取上清液至一塊新的96孔板上。使用HPLC分析來檢測酶活(方法檢測柱=CNW 柱(0 4.6 X 150 mm，5um);波長214nm ；流動相A 相(H20+0. 1%TFA) -B 相(CH3CN+0. 1%TFA)，流速為 I. Oml/min,等度洗脫，23%B+77%A 10. Omin stop,柱溫 28°C )，將獲得的產物峰的面積與BL21 (DE3) /pET2 Ib-KREDIk發酵菌液的反應峰面積做比較，超過BL21 (DE3)/pET2Ib-KREDlk活性30%的即為篩選出的活性有所提高的突變體。步驟6:鑒定為了從所篩選出的(表達改進的酮還原酶多肽)的宿主細胞中獲得酮還原酶的序列，將其所對應的菌種送測序，測序結果顯示含有SEQ ID No. 3所示核苷酸序列，編碼SEQID No. 4所示氨基酸序列。該菌種命名為BL21 (DE3)/pET2 Ib-KREDmu。二、驗證表達本發明的一種改進的酮還原酶多肽的宿主細胞(上述步驟5獲得的大腸桿菌 BL21 (DE3)/pET2Ib-KREDmu)的效果以表達野生型酮還原酶多肽(SEQ ID No.2所示氨基酸序列)的大腸桿菌BL21 (DE3)/pET2Ib-KREDkl作為對照，驗證上述步驟5獲得的宿主細胞表達的改進的酮還原酶多肽的酶活性。
制備R型苯酚產物的50ml反應體系10g/L 2- (N-芐基-N-甲基氨基)-1- (3_羥基)苯乙酮，10g/L酮還原酶菌體(大腸桿菌 BL21 (DE3)/pET2Ib-KREDkl 或者大腸桿菌 BL21 (DE3)/pET2Ib-KREDmu)，10g/L 葡萄糖脫氫酶菌體，200g/L葡萄糖,0. lg/LNADP+, ImM Mg2+, 50mM磷酸鈉緩沖溶液(pH=6. O)。反應裝置利用250mL的三口瓶，30°C油浴，利用磁力攪拌。首先精確稱取0. 5克底物和10克葡萄糖，加入到反應瓶中。然后加入40mL去離子水，ImM硫酸鎂，50mM, pH6. 0磷酸鈉緩沖液，快速攪拌lOmin，使反應體系充分混勻。此時測定pH約為4. 7，用2. 5N的NaOH將pH調節至5. I。向體系中加入500mg酮還原酶菌體細胞，500mg葡萄糖脫氫酶菌體細胞和5mg的氧化型輔酶II (NADP+鈉鹽)。整個反應過程中pH控制在5. 05-5. 15之間，溫度控制在30°C。反應20h后HPLC分析(如步驟5所述)。HPLC分析結果顯示具有SEQ ID No. 4所示氨基酸序列的改進的酮還原酶多肽在篩選條件下能完全轉化苯乙酮底物；而具有SEQ ID No. 2所示氨基酸序列的野生型酮還原酶只能轉化10%不到的苯乙酮底物。 同時，為了確定突變體的立體選擇性，使用了低濃度底物作反應，以確保底物被完全轉化為產物，反應體系為lg/L 2- (N-芐基-N-甲基氨基)-1_ (3-羥基)苯乙酮，0. Ig/L NADPH, ImM Mg2+，500mM磷酸鈉緩沖溶液(pH=6. 5)，10g/L 的 BL21 (DE3) /pET2Ib-KREDkl 或BL21 (DE3)/pET2Ib-KREDmu，于30°C反應24h。反應產物進行手性HPLC分析，結果顯示突變體可以將2- (N-芐基-N-甲基氨基)-1- (3-羥基)苯乙酮還原為3- ((R)-2- (N-芐基-N-甲基氨基)-I-羥基)苯酚，其立體選擇性不低于野生型酮還原酶，e. e.值>99. 9%。
權利要求
1.一種改進的酮還原酶多肽，其特征在于， 該改進的酮還原酶多肽的酶活性高于野生型酮還原酶多肽的酶活性； 所述酶活性是指催化酮類化合物發生還原反應生成手性醇的酶活性； 所述野生型酮還原酶多肽具有SEQ ID No. 2所示氨基酸序列，且來源于高加索乳酸桿菌 Lactobacillus kefiri DSM 20587 ； 所述改進的酮還原酶多肽包含與SEQ ID No. 2所示氨基酸序列有至少90%序列同源性的氨基酸序列，并且該改進的酮還原酶多肽的氨基酸序列中對應于SEQ ID No. 2所示氨基酸序列中的第94位殘基為酪氨酸殘基。
2.如權利要求I所述的改進的酮還原酶多肽，其特征在于所述酶活性是指催化底物I-(3-羥基苯基)-2-[甲基(苯基甲基)氨基]乙酮發生還原反應生成3-((R)-2-(N-芐基-N-甲基氨基)-I-羥基)的酶活性。
3.如權利要求I所述的改進的酮還原酶多肽，其特征在于所述改進的酮還原酶多肽具有如SEQ ID No. 4所示氨基酸序列。
4.如權利要求I所述的改進的酮還原酶多肽，其特征在于該改進的酮還原酶多肽的酶活性是所述野生型酮還原酶多肽的酶活性的至少2倍。
5.一種編碼如權利要求1-4中任意一項所述改進的酮還原酶多肽的基因，其特征在于 編碼所述改進的酮還原酶多肽的基因包含與SEQ ID No. I所示核苷酸序列有至少90%序列同源性的核苷酸序列。
6.如權利要求5所述的基因，其特征在于該基因具有如SEQID No. 3所示核苷酸序列。
7.一種細胞，其特征在于該細胞表達權利要求1-4中任意一項所述的改進的酮還原酶多肽。
8.如權利要求7所述細胞，其特征在于所述細胞屬于乳酸桿菌或大腸桿菌。
9.如權利要求8所述細胞，其特征在于所述乳酸桿菌屬于高加索乳酸桿菌。
10.如權利要求8所述細胞，其特征在于所述大腸桿菌為E.coli. BL21 (DE3)。
全文摘要
本發明涉及一種改進的酮還原酶多肽，該改進的酮還原酶多肽的酶活性高于野生型酮還原酶多肽的酶活性；所述酶活性是指催化酮類化合物發生還原反應生成手性醇的酶活性；所述野生型酮還原酶多肽具有SEQ ID No.2所示氨基酸序列，且來源于高加索乳酸桿菌Lactobacillus kefiri DSM 20587；所述改進的酮還原酶多肽包含與SEQ ID No.2所示氨基酸序列有至少90%序列同源性的氨基酸序列，并且該改進的酮還原酶多肽的氨基酸序列中對應于SEQ ID No.2所示氨基酸序列中的第94位殘基為酪氨酸殘基。
文檔編號C12N15/53GK102776157SQ201210299300
公開日2012年11月14日 申請日期2012年8月21日 優先權日2012年8月21日
發明者孫勇, 文軍, 王娟, 王波, 郭浩 申請人:尚科生物醫藥(上海)有限公司