專利名稱：一種檢測大口黑鱸虹彩病毒的雙重pcr方法
技術領域：
本發明涉及PCR技術領域，特別涉及ー種檢測大ロ黑鱸虹彩病毒的雙重PCR技木。
背景技術：
大口黑S盧(Micropterus salmoides,或 Largemouth bass),俗稱加州S盧，原產于北美密西西比河流域，屬廣溫性魚類，具有生長快、病害少、耐低溫、肉質鮮美和容易捕撈等特點，已成為我國重要的淡水養殖品種。從20世紀90年代開始，我國池塘養殖大口黑鱸發生病害的問題越來越復雜，如爛鰓病、腸炎病、腐皮病、水霉病、車輪蟲病、杯體蟲病等，導致大ロ黑鱸發病的病原主要是嗜水氣單胞菌，柱狀黃桿菌，霉菌和寄生蟲，確診由病毒感染導致發病的報道較少。大口黑鱸虹彩病毒(LMBV，又稱SCRV)通常指的是虹彩病毒科(Iridoviridae)的娃病毒屬(ZfeflaFirw1S),最早分離自1991年美國佛羅里達州Lake Weir市的野生大口黑鱸。1995年美國南卡羅萊納州的Santee-Cooper水庫養殖的大口黑鱸暴 發魚災(fish kill)引起人們高度關注。該病毒的特點是不僅可以導致大面積魚爆發疾病死亡引起魚災，也可以是不表現任何癥狀的隱性帶毒，因此對大口黑鱸健康養殖帶來巨大威脅。2009年鄧國成等人報道了大口黑鱸潰瘍病是由虹彩病毒感染引起的，這是國內對大ロ黑鱸潰瘍病毒性病原的首次報道。而虹彩病毒科中另外ー個重要的病毒屬腫大細胞病毒屬(Megalocytivirus')，對魚的致病性更強，該類病毒引起的魚類疾病呈逐年上升趨勢，患病魚死亡率達30-100%。馬冬梅等人研究證實大口黑鱸的肝脾腫大癥由腫大細胞病毒屬虹彩病毒引起，實驗室大ロ黑鱸攻毒試驗顯示100%死亡率(馬冬梅等，大ロ黑鱸肝脾腫大病病原研究，中國水產科學，2011, 18 (3), 654-659)ο兩種不同種屬虹彩病毒對大ロ黑S盧養埴的影響，引起廣大科研人員和基層養殖戶對該類病原的高度關注。在虹彩病毒中，研究比較清楚的結構蛋白是主衣殼蛋白(MCP)。MCP占整個病毒粒子多肽的40-45%，是虹彩病毒粒子中豐度最高的蛋白，并且在虹彩病毒科中高度保守，因此可以利用MCP的同源性差異進行虹彩病毒分子進化方面的研究。1999年Mao J等人綜合大口黑鱸病毒蛋白合成分析，限制性片段長度多態分析(RFLP)，MCP和DNA甲基轉移酶(DMet)基因序列分析的結果，明確了大口黑鱸虹彩病毒的分類地位為虹彩病毒科蛙病毒屬成員。Mao J等人比較了 LMBV與蛙病毒3 (FV3)等的MCP和DMet基因的氨基酸序列，以及它們的限制性內切酶圖譜，結果顯示LMBV與蛙病毒代表株FV3有一定差距。在國際病毒分類委員會第八次報告中將LMBV歸類為娃病毒屬的Santee-Cooper ranavirus種。目前,針對大ロ黑鱸蛙病毒屬的常規PCR和熒光定量PCR檢測方法雖然已有報道，但尚缺乏ー種能快速、準確地同時對大口黑鱸蛙病毒屬和腫大細胞病毒屬兩種虹彩病毒進行檢測的方法。
發明內容
本發明的目的在于提供一種可同時檢測、鑒別蛙病毒屬和腫大細胞病毒屬兩種虹彩病毒的雙重PCR檢測方法。本發明所采取的技術方案是一種檢測大口黑鱸虹彩病毒的雙重PCR方法，包括以下步驟
O從待檢大口黑鱸的組織器官提取基因組DNA ；
2)以基因組DNA為模板，使用分別根據大口黑鱸虹彩病毒科蛙病毒屬和腫大細胞病毒屬的MCP基因序列設計合成的兩對引物，在同一反應體系中進行雙重PCR擴增，得到擴增產物；其中引物序列如下
娃病毒屬引物Ranancp
上游引物tatgtgctcaactcttggctggtc (SEQ ID NO. I),
下游引物ccacgatgggcttgacttctcc (SEQ ID NO. 2)；
腫大細胞病毒屬Megancp 上游引物atgctcattgaacagtgccaggtg (SEQ ID NO. 3),
下游引物ggtggagccgaggggtgttc (SEQ ID NO. 4)；
3)擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳，然后根據電泳結果進行判定，其中蛙病毒擴增產物長475bp，腫大細胞病毒擴增產物長262bp。所述雙重PCR反應體系為待檢DNA t旲板或陽性質控品或陰性質控品2 μ I，IOXbuffer 5 μ I, MgCl2 濃度 I. 5mmol/L,各引物濃度 O. 5 μ mol/L, dNTP 濃度 O. 4mmol/L,Taq 酶 2. 5U, ddH20 補齊至 50 μ I ；
所述雙重 PCR 反應條件為95°C 5min ；94°C 30s，55_58°C 30s, 72°C 30s，反應 30-35次循環；72°C IOmin ；
優選的，退火溫度為55°C ；
優選的，反應循環數為30次。ー種大口黑鱸虹彩病毒的雙重PCR檢測試劑盒，包括如下成分10XPCR buffer、dNTP、MgCl2、Taq酶、引物、陽性質控品、陰性質控品，其特征在于，所用引物序列分別為
娃病毒屬引物Ranancp
上游引物tatgtgctcaactcttggctggtc (SEQ ID NO. I),
下游引物ccacgatgggcttgacttctcc (SEQ ID NO. 2)；
腫大細胞病毒屬Megancp
上游引物atgctcattgaacagtgccaggtg (SEQ ID NO. 3),
下游引物ggtggagccgaggggtgttc (SEQ ID NO. 4)；
所述陽性質控品為SD-R和NH-M的DNA模板，陰性質控品為無菌ddH20。本發明的有益效果是
本發明可同時檢測蛙病毒屬和腫大細胞病毒屬兩種虹彩病毒，該發明方法敏感性強、特異性高，可以快速、準確地對大口黑鱸虹彩病毒進行診斷和種屬鑒定。
圖I為特異性試驗電泳圖譜；
圖2為敏感性試驗電泳圖譜；
圖3為病料檢測試驗電泳圖譜。
具體實施方式
下面結合具體實施案例進ー步描述本發明。引物的設計根據GenBank中LMBV的MCP基因序列(登錄號⑶256635)和馬冬梅等發表的大口黑鱸肝脾腫大癥病毒的MCP基因序列，設計和篩選出兩對特異性片段引物。各引物序列和預期擴增片段長度如下
權利要求
1.一種檢測大口黑鱸虹彩病毒的雙重PCR方法，包括以下步驟 1)從待檢大口黑鱸的組織器官提取基因組DNA; 2)以基因組DNA為模板，使用分別根據大ロ黑鱸虹彩病毒科蛙病毒屬和腫大細胞病毒屬的MCP基因序列設計合成的兩對引物，在同一反應體系中進行雙重PCR擴增，得到擴增產物；其中引物序列如下 娃病毒屬引物Ranancp 上游引物tatgtgctcaactcttggctggtc (SEQ ID NO. I), 下游引物ccacgatgggcttgacttctcc (SEQ ID NO. 2)； 腫大細胞病毒屬Megancp 上游引物atgctcattgaacagtgccaggtg (SEQ ID NO. 3), 下游引物ggtggagccgaggggtgttc (SEQ ID NO. 4)； 3)擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳，然后根據電泳結果進行判定，其中蛙病毒擴增產物長475bp，腫大細胞病毒擴增產物長262bp。
2.根據權利要求I所述的檢測大口黑鱸虹彩病毒的雙重PCR方法，其特征在于所述雙重PCR反應體系為待檢DNA模板或陽性質控品或陰性質控品2 yl，IOXbuffer 5u I,MgCl2 濃度 I. 5mmol/L，各引物濃度 0. 5 u mol/L, dNTP 濃度 0. 4mmol/L, Taq 酶 2. 5U, ddH20補齊至50 u I0
3.根據權利要求I所述的檢測大口黑鱸虹彩病毒的雙重PCR方法，其特征在于所述雙 重 PCR 反應條件為95°C 5min ；94°C 30s，55_58°C 30s, 72°C 30s，反應 30-35 次循環；72°C IOmin。
4.根據權利要求3所述的檢測大口黑鱸虹彩病毒的雙重PCR方法，其特征在于退火溫度為55で。
5.根據權利要求3所述的檢測大口黑鱸虹彩病毒的雙重PCR方法，其特征在于反應循環數為30次。
6.ー種大口黑鱸虹彩病毒的雙重PCR檢測試劑盒，包括如下成分10XPCR buffer、dNTP、MgCl2、Taq酶、引物、陽性質控品、陰性質控品，其特征在于，所用引物序列分別為 娃病毒屬引物Ranancp 上游引物tatgtgctcaactcttggctggtc (SEQ ID NO. I), 下游引物ccacgatgggcttgacttctcc (SEQ ID NO. 2)； 腫大細胞病毒屬Megancp 上游引物atgctcattgaacagtgccaggtg (SEQ ID NO. 3), 下游引物ggtggagccgaggggtgttc (SEQ ID NO. 4)。
7.根據權利要求6所述的ー種大口黑鱸虹彩病毒的雙重PCR檢測試劑盒，其特征在于所述陽性質控品為SD-R和NH-M的DNA模板，陰性質控品為無菌ddH20。
全文摘要
本發明公開了一種檢測大口黑鱸虹彩病毒的雙重PCR方法，通過設計的兩對特異性引物和優選的反應體系、反應條件，可同時檢測、鑒別蛙病毒屬和腫大細胞病毒屬兩種虹彩病毒，該發明方法敏感性強、特異性高，可以快速、準確地對大口黑鱸虹彩病毒進行診斷和種屬鑒定。
文檔編號C12Q1/68GK102816868SQ201210316708
公開日2012年12月12日 申請日期2012年8月30日 優先權日2012年8月30日
發明者王慶, 曾偉偉, 劉春 , 李凱彬, 王芳, 王英英, 石存斌, 吳淑勤 申請人:中國水產科學研究院珠江水產研究所