一種整形美容用脂肪干細胞新技術的制作方法
【專利摘要】利用健康自愿者瘦身吸脂時的脂肪組織，純化干細胞用于豐胸和除皺，包括如下操作步驟：(1)脂肪組織的采集；(2)脂肪組織的消化；(3)脂肪細胞純化；(4)脂肪干細胞純化；(5)脂肪干的擴增培養；(6)干細胞凍存。在GMP車間無菌條件下，提取純化得到的大量脂肪干細胞(ADSCs)，用于豐乳或面部除皺具有諸多優點：ADSCs能夠在體外穩定增殖且衰亡率低、移植對機體損傷小、材料來源廣泛、隆乳效果好、少量細胞即可達到理想的祛皺效果、無排異、安全可靠。ADSCs給豐胸、恢復青春期皮膚彈性提供了良好的方法。
【專利說明】一種整形美容用脂肪干細胞新技術
【技術領域】
[0001]本發明是利用脂肪組織制備出脂肪干細胞用于隆乳和除皺等整形美容的新技術，涉及醫藥生物技術和整形美容科學領域。
【背景技術】
[0002]當人類進入二十一世紀，人們尤其是女性同志的最求從物質正逐漸轉向對健康美麗的渴望。良好的形體無疑是女人的天生資本，胸部的豐滿和飽滿而富有彈性的臉龐無論是對于女人還是男人都具有強烈的吸引力。然而，有些女人天生或隨著年齡的增長乳房萎縮變小或松弛下垂、沒有彈性，作為女人昔日的風采沒有了，因此隆胸和除皺等整形美容就成為女性同志心中理想的選擇。
[0003]目前，隆乳的方法有假體隆胸、注射隆胸和自體脂肪移植隆胸三類。假體隆胸是將硅膠囊包裹的硅膠凍或水凝膠制成的乳房假體，通過切口置入胸大肌下間隙。該法損傷部位大，術后恢復期較長，若干年需另行更換，患者的心理經濟負擔較重，術后需長期按摩乳房、永久性保護乳房不受外傷等等。注射隆胸是將一種人工化學物質通過注射填充到乳房間隙而起到豐滿乳房的作用但由于操作簡單，管理不嚴，甚至在美容院也大量使用。所以也出現很多并發癥:如感染、出血、分布不均、硬結等。更有一些醫生對這些并發癥不正確處理，給患者帶來了更大的損害。自體脂肪移植隆胸是通過吸脂法得到的自體脂肪組織移植隆胸，該法每次可注射60毫升左右脂肪，通常間隔3月后需再次注射。但該法每次注射量不能過多，容易出現脂肪液化、壞死等并發癥，造成不良后果。
[0004]脂肪干細胞(adipose-derived stem cells, ADSCs)是近年來從脂肪組織中分離得到的一種具有多向分化潛能的干細胞。研究發現ADSCs細胞能夠在體外穩定增殖且衰亡率低，同時它具有取材容易、少量組織即可獲取大量干細胞，適宜大規模培養，對機體損傷小等優點，而且其來源廣泛，體內儲備量大，適宜自體移植，逐漸成為近年來新的研究熱點之一。采用自體干細胞豐胸，只需一次性移植即可達到隆乳之功效。該法創傷小，負擔輕，無明顯切口，安全有效；同時自體干`細胞移植法可以一舉兩得，即在抽取自體脂肪作為隆乳材料的同時，還可以減肥美體，其實際效用已遠遠超過了隆乳術本身的范疇。另外，自體脂肪干細胞還可用于面部除皺，使面部飽滿潤色，填平皺紋，恢復皮膚彈性，增加女性魅力。
【發明內容】
[0005]本發明利用健康自愿者瘦身吸脂時的脂肪組織，在GMP車間無菌條件下提取純化到大量脂肪干細胞(ADSCs)，移植或擴增后豐乳或注射面部除皺。ADSCs能夠在體外穩定增殖且衰亡率低，移植對機體損傷小，其材料來源廣泛，隆乳效果好，少量細胞即可達到理想的祛皺效果，而且無排異、安全可靠。ADSCs給豐胸、恢復青春期彈性皮膚提供了良好的方法。
【具體實施方式】[0006]通過本實施例來具體說明本發明一種整形美容用脂肪干細胞新技術。本發明操作步序如下:
[0007](I)脂肪組織的采集。選取健康瘦身自愿者，在無菌條件下用抽脂機(腹部、臀部、大腿等脂肪豐富部位)抽取脂肪組織，同時抽取靜脈血60毫升。用PBS清洗脂肪組織2-3次，放入含有雙抗(青霉素/鏈霉素，各為I %含量)的緩沖液中，無菌環境于4°條件下運至G M P車間。
[0008](2)脂肪組織的消化。在100級GMP廠房的條件下將脂肪顆粒剪碎，0.075% I型膠原酶(Sigma-Aldrich, St.Louis, M0)37°C恒溫振蕩(低速震蕩，50rpm)搖床消化40分鐘，等量體積的完全培養基(高糖DMEM+10%胎牛血清+1%雙抗)中止消化。
[0009](3)脂肪細胞純化。將消化液置于冰浴中，用吸管吹打10-15次后加入10mg/LDnase I孵育10-15分鐘，行100微米濾網過濾，去除塊狀脂肪組織和結締組織，4°環境1000rpm IOmin(成熟脂肪細胞在表層油滴下方、培養基上方，而處于離心管底部的是脂肪干、還有其他細胞)后去除上層油滴，將漂浮的脂肪細胞轉移至新的離心管中，加入PBS清洗，4°環境1000rpm IOmin,重復此過程數次。
[0010](4)脂肪干細胞純化。將離心的沉淀細胞用1%的鹽水洗滌2-3次以除去污染的紅細胞，用完全培養基重懸，接種于多聚鳥氨酸包被的培養板，培養4小時，移去上清，用
0.25%胰酶消化，難以消化的成纖維細胞、內皮細胞等將被留下。分離純化的干細胞進行表面標記⑶29、⑶44、⑶105和⑶34、⑶45檢測，以及CFU-F檢測，經相關質檢合格后用于面部除皺之用。
[0011](5)脂肪干的擴增培養。接著第三步，將脂肪細胞與離心管底部的脂肪干細胞一起置于300毫升的細胞培養袋， 細胞接種密度為100，OOOcells/ml，用DMEM培養基加5%人血清及相關細胞因子:10ng/ml ITS (胰島素、轉鐵蛋白、硒),100u/ml青霉素，100u/ml鏈霉素，20ng/mlof rEGF, 10ng/ml of LIF，20ng/ml of bFGF，放置于 37°C、5% C02 培養箱中飽和濕度培養7-10天后，進行質檢，合格者用于豐胸。
[0012](6)干細胞凍存。如果擴增的干細胞不用于移植，也可存入液氮罐凍存:將干細胞置于細胞凍存管，加入凍存液(含8%二甲基亞砜、10% BSA、20%胎牛血清、62% DMEM)，先后直4° > -20°預冷，再入液氣中儲存。
【權利要求】
1.一種整形美容用脂肪干細胞新技術，其特征在于: (1)脂肪組織的采集，無菌條件下抽取脂肪組織，于4°條件下運至GMP車間。 (2)脂肪組織的消化，用膠原酶消化脂肪組織并用含血清的培養基中止。 (3)脂肪細胞純化，將消化液行100微米濾網過濾，并離心得到脂肪細胞和脂肪干細胞。 (4)脂肪干細胞純化，重懸細胞沉淀，接種培養板分離純化干細胞。 (5)脂肪干的擴增培養，將第三步得到的脂肪細胞和脂肪干細胞擴增培養，質檢合格豐胸。 (6)干細胞凍存，干細胞加入二甲基亞砜后存入液氮罐。
2.根據權利要求1所述的一種整形美容用脂肪干細胞新技術，其特征是:(I)脂肪組織的采集，在無菌條件下，吸取健康自愿者皮下脂肪，同時抽取靜脈血60毫升(用于干細胞擴增培養之用)。用PBS洗去脂肪組織中的血細胞，加入I %雙抗，低溫運至GMP車間。
3.根據權利要求1所述的一種整形美容用脂肪干細胞新技術，其特征是:(2)脂肪組織的消化，在100級GMP廠房條件下，用0.075% I型膠原酶低速37°C恒溫振蕩(50rpm)消化40分鐘，等量體積的完全培養基(高糖DMEM+10%胎牛血清+1 %雙抗)中止消化。
4.根據權利要求1所 述的一種整形美容用脂肪干細胞新技術，其特征是:(3)脂肪細胞純化，將消化液吹打10-15次后，加入10mg/L Dnase I孵育10-15分鐘，行100微米濾網過濾，去除塊狀脂肪組織和結締組織，4°環境1000rpm IOmin后去除上層油滴，將漂浮的脂肪細胞轉移至新的離心管中，PBS洗滌2-3次。
5.根據權利要求1所述的一種整形美容用脂肪干細胞新技術，其特征是:(4)脂肪干細胞純化，用I %的鹽水再次洗滌細胞沉淀2-3次，接種于多聚鳥氨酸包被的培養板，培養4小時后用0.25%胰酶消化，難以消化的其它細胞將被留下。分離純化的干細胞進行表面標記⑶29、⑶44、⑶105和⑶34、⑶45檢測，以及CFU-F檢測，經相關質檢(細胞活力、數量、微生物)合格后用于面部除皺之用。
6.根據權利要求1所述的一種整形美容用脂肪干細胞新技術，其特征是:(5)脂肪干的擴增培養，將第三步得到的脂肪細胞與脂肪干細胞置于300毫升細胞培養袋(細胞密度:100，000cells/ml)，用DMEM培養基加5%人血清及相關細胞因子(10ng/ml ITS (胰島素、轉鐵蛋白、硒)，100u/ml 青霉素，100u/ml 鏈霉素,20ng/ml of rEGF, 10ng/ml of LIF, 20ng/mlof bFGF)培養增殖干細胞7-10天后，進行質檢(細胞活力、數量、內毒素、微生物)，合格者用于豐胸。
7.根據權利要求1所述的一種整形美容用脂肪干細胞新技術，其特征是:(6)干細胞凍存，將干細胞置于細胞凍存管，加入凍存液:8%二甲基亞砜、10% BSA、20%胎牛血清、62%DMEM，先后置4°、-20°預冷，再入液氮中儲存。
【文檔編號】C12N5/0775GK103667185SQ201210318746
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2012年8月31日 優先權日:2012年8月31日
【發明者】孫勇 申請人:孫勇