專利名稱：一種檢測西尼羅病毒抗體的重組抗原蛋白、試劑盒及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及基因工程技術領域，尤其涉及一種診斷西尼羅病毒抗體的重組抗原蛋白及其制備方法，以及以該抗原蛋白作為包被抗原的西尼羅病毒檢測試劑盒。
背景技術：
西尼羅病毒(West Nile virus，WNV)屬黃病毒科黃病毒屬，為單股正鏈RNA病毒，與圣路易斯腦炎病毒(Saint-Louis encephalitis virus)和墨累河谷熱病毒(MurrayValley fever virus)同屬日本腦炎病毒(Japanese encephalitis virus, JEV)血清群， 可引起人和動物發生西尼羅河熱和西尼羅病毒腦膜腦炎，庫蚊屬的蚊子是其主要的傳播媒介，鳥類是該病毒的中間宿主，而人和馬則是終端宿主。WNV病廣泛分布于非洲、中東、歐洲的部分地區，以及前蘇聯、印度、印度尼西亞和亞洲的熱帶地區等。1999年夏季，WNV首次登陸美國，隨后幾年內在北美和中美洲迅速傳播，導致美國和加拿大等國家歷史上蟲媒病毒感染的最大流行。雖然我國至今沒有WNV疫情發生，但周邊國家和地區己經爆發該疫病，隨時有輸入性傳播的可能，而且作為一種潛在的生物戰劑，存在被用于生物恐怖襲擊的可能，加強相關領域的技術儲備，對于我國的公共衛生及生物安全保障具有重要意義。目前用于病毒免疫學檢測方法中，酶聯免疫吸附試驗(ELISA)方法速度快，對實驗要求不高，并能自動化、高通量的檢測大量樣品，同時也具有靈敏度高、可靠性強的優勢，并且已經在不同的病原體檢測中得到廣泛應用，其操作已被廣大基層衛生防疫人員熟練掌握，具有較高的應用價值。免疫膠體金快速診斷技術則是基于酶聯免疫吸附試驗、乳膠凝集試驗、免疫膠體金技術的新型技術，于1989年首次用于檢測抗人類免疫缺陷病毒的抗體，其操作更為簡便快速，只需幾分鐘，陽性反應肉眼可見，不需特殊儀器，不受環境溫度影響，試劑穩定易長期保存、特異性和敏感性均較高等優點，特別適用于野外以及實驗條件不具備的場所使用，并已在多種病毒的檢測中得到應用。在基層單位，以上兩種方法有其他方法無法代替的優勢，而其關鍵均在于特異性強、親和力高抗原的制備，以提高特異性及檢出率。現有技術中，關于西尼羅病毒免疫學診斷方法的研究方面，國內也已經見過多篇報道，但由于不同蟲媒病毒之間存在嚴重的血清學交叉反應，在那些存在多種蟲媒病毒流行的區域，由于混合感染，患者體內存在交叉抗體，使得免疫學診斷及鑒別診斷十分困難。同時，由于IgG抗體可以在宿主體內存在很長時間，有的超過10個月，甚至終生攜帶，使得鑒別過去、最近還是現在感染也十分困難，對抗原的質量也提出了更高的要求。
發明內容
有鑒于此，本發明的所解決的技術問題在于提供一種檢測西尼羅病毒抗體的重組抗原蛋白及其制備方法，該重組抗原蛋白具有特異性強、親和力高的優點，與其它相近的蟲媒傳播病毒無血清學交叉反應，而與西尼羅病毒抗體具有極高親和力。
本發明的所解決的技術問題在于提供一種西尼羅病毒的檢測試劑盒，利用所制備的重組抗原蛋白，建立西尼羅病毒抗體的ELISA快速檢測技術。為了解決上述技術問題，一方面，本發明提供一種檢測西尼羅病毒的重組抗原蛋白，所述重組抗原蛋白具有如SEQ ID NO. I所示氨基酸序列。優選地，所述重組抗原蛋白的編碼基因序列具有如SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列。該重組抗原蛋白是通過選擇西尼羅病毒蛋白中呈現病毒高特異性肽段的編碼基因作為目的基因片段，并將該目的基因片段通過原核表達載體導入宿主細胞中進行表答而制備得至IJ，該目的基因片段具有如SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列，該目的基因片段中包括編碼重組抗原蛋白柔性臂的延伸區段，所述柔性臂能夠消除表達載體的融合蛋白對多肽表位的掩蓋，使表達的重組抗原蛋白正確折疊。另一方面，本發明具體實施方式
中還提供了一種檢測西尼羅病毒抗體的重組抗原蛋白的制備方法，包括如下步驟
一、選擇西尼羅病毒蛋白中呈現病毒高特異性肽段的編碼基因作為目的基因片段，該目的基因片段具有如SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列，該目的基因片段中包括編碼重組抗原蛋白柔性臂的延伸區段，所述柔性臂能夠消除表達載體的融合蛋白對多肽表位的掩蓋，使表達的重組抗原蛋白正確折疊；二、設計PCR擴增引物，并通過PCR擴增所述目的基因片段；三、通過限制性酶切和連接，將目的基因片段體連接到原核表達載體中，構建含有所述目的基因片段的重組表達質粒；四、將所述重組表達質粒轉化至感受態的表達宿主細胞中，培養所述表達宿主細胞使其產生重組抗原蛋白，并通過純化獲取重組抗原蛋白，所述重組抗原蛋白具有如SEQID NO. I所示氨基酸序列。優選地，所述步驟二中采用的PCR擴增引物序列如下正向引物CGGGATCCCCACCAGGCACTTCAGATCCA〈SEQID NO. 3>反向引物ACGCAAGCTTTTAGGCAATCTCATTCCCCATCTT〈SEQID NO. 4>。優選地，在本發明的一個具體實施例中所述原核表達載體選用pMAL c2x原核表達載體，所述表達宿主細胞為大腸桿菌。對于本發明的重組抗原蛋白，其具有特異性強、親和力高的優點，與其它相近的蟲媒傳播病毒無血清學交叉反應，而與西尼羅病毒抗體具有極高親和力。在本發明的實施例中，通過將表達獲得的抗原蛋白經SDS-PAGE分離后，用病毒抗血清進行Western-blot，驗證了本發明的重組抗原蛋白具有極高的特異性，并獲取了能高效表達西尼羅病毒特異性重組抗原的基因工程菌株，同時結合采用了該重組抗原蛋白的西尼羅病毒檢測試劑盒在其靈敏度試驗、特異性試驗結果，更進一步地說明了本發明的重組抗原蛋白在用于檢測西尼羅病毒時表現出的高靈敏度、高特異性的優勢。對于本發明的重組抗原蛋白制備方法，由于其選擇了西尼羅病毒蛋白中呈現病毒高特異性肽段的編碼基因作為目的基因片段，該目的基因片段中包括編碼重組抗原蛋白柔性臂的延伸區段，所述柔性臂能夠消除表達載體的融合蛋白對多肽表位的掩蓋，使表達的重組抗原蛋白正確折疊，同時結合上述方案中涉及的專用引物，有效地獲取了該目的基因，同時結合該方法中采用的原核表達載體和表達宿主菌，使重組抗原蛋白具備高效的表達效果。另外，在本發明的實施例中，通過將表達獲得的抗原蛋白經SDS-PAGE分離后，用病毒抗血清進行Western-blot，同時結合采用了該重組抗原蛋白的西尼羅病毒檢測試劑盒在其靈敏度試驗、特異性試驗結果，更進一步地說明了本發明的重組抗原蛋白的制備方法在高效表達重組抗原蛋白、以及保證本發明重組抗原蛋白的高靈敏度、高特異性方面表現出的優勢。另外，本發明還提供了一種西尼羅病毒的檢測試劑盒，包括抗體檢測板和ELISA反應液，所述抗體檢測板上包被有檢測西尼羅病毒的重組抗原蛋白，所述重組抗原蛋白具有如SEQ ID NO. I所示氨基酸序列。其中，試劑盒中ELISA反應液包括酶結合物工作液，陽性對照，陰性對照，樣品稀釋液，濃縮洗滌液，顯色液A，顯色液B和終止液，酶結合物工作液，陽性對照為西尼羅病毒抗體標準品，陰性對照為西尼羅病毒抗體陰性血清。
優選地，在本發明具體實施例中所述酶結合物工作液為辣根過氧化物酶標記的抗人 IgG0優選地，在本發明的一個具體實施例中，所述抗體檢測板的制備過程包括如下步驟一、重組抗原蛋白的制備，包括如下步驟(I)、選擇西尼羅病毒蛋白中呈現病毒高特異性肽段的編碼基因作為目的基因片段，該目的基因片段具有如SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列，該目的基因片段中包括編碼重組抗原蛋白柔性臂的延伸區段，所述柔性臂能夠消除表達載體的融合蛋白對多肽表位的掩蓋，使表達的重組抗原蛋白正確折疊；(2)、設計PCR擴增引物，并通過PCR擴增所述目的基因片段；(3)、通過限制性酶切和連接，將目的基因片段體連接到原核表達載體中，構建含有所述目的基因片段的重組表達質粒；(4)、將所述重組表達質粒轉化至感受態的表達宿主細胞中，培養所述表達宿主細胞使其產生重組抗原蛋白，并通過純化獲取重組抗原蛋白，所述重組抗原蛋白具有如SEQID NO. I所示氨基酸序列；二、將純化后的重組抗原蛋白固定于酶聯板，該過程包括將步驟一中純化得到的重組抗原蛋白分別以梯級濃度包被酶聯板，每孔50-200ul，4°C包被過夜，而后用磷酸鹽吐溫緩沖液洗滌1-2分鐘；將其拍干后，用5%牛血清白蛋白溶液于37°C封閉1-3小時，晾干后即得到所述抗體檢測板。再則，結合本發明的重組抗原蛋白用于西尼羅病毒的檢測試劑盒的具體實施方式
，充分說明了本發明的重組抗原蛋白在制備診斷西尼羅病毒試劑盒中的運用，能夠保證西尼羅病毒診斷過程中的靈敏度和特異性。還需要說明的是，本發明的研發單位為全軍及廣東省蟲媒病毒專業實驗室，收集了國內較為全面的蟲媒病毒毒株，并制備了其標準血清，為重組抗原蛋白的特異性驗證奠定了良好基礎。結合實施例中揭示的實驗內容可以看出，實驗中在保證反應原性的基礎上，盡量縮短了抗原片段長度，確保所篩選的原核表達抗原具備良好的特異性，與所測試的辛德畢斯、西門利克、馬雅羅、羅斯河、鷺山、蓋塔、基孔肯雅、登革廣4型、流行性乙型腦炎及黃熱病毒均無交叉反應，S/N比值在25以上。同時，所建立的制備方法及西尼羅病毒的檢測試劑盒均具備較高靈敏度及檢出范圍，以西尼羅病毒小鼠免疫血清進行的實驗表明，在血清I :10(Tl :25600倍稀釋范圍內，均可獲得陽性結果，檢測OD值在O. 19以上，而且無非特異性結果。
圖I是本發明實施例I中西尼羅病毒、乙型腦炎病毒、登革I型病毒多克隆抗體與原核表達抗原的western blot雜交結果；其中，a: SDS PAGE電泳圖；b :西尼羅病毒病毒多克隆抗體Wester blot結果；c :乙型腦炎病毒多克隆抗體Wester blot結果；d:登革I型病毒多克隆抗體Wester blot結果。I.未誘導對照；M.蛋白分子量Marker; 2. WnV 16+pMALc2x;3. pMAL c2x0圖2本發明實施例2中抗原包被濃度實驗結果圖。
圖3是本發明實施例2中ELISA試劑盒及其應用；其中，b:ELISA特異性實驗，Al孔加登革I型病毒抗體，BI為登革2型病毒抗體，Cl為登革3型病毒抗體，Dl為登革4型病毒抗體，El為乙型腦炎病毒抗體，Fl為黃熱病毒抗體，Gl為西尼羅病毒抗體，Hl為馬雅羅病毒抗體，A2孔加羅斯河病毒抗體，B2為鷺山病毒抗體，C2為蓋塔病毒抗體，D2為基孔肯雅病毒抗體，E2為辛德畢斯病毒抗體，F2為西門利克病毒毒抗體，G2為陰性血清，H2為空白對照；c :ELISA敏感性實驗，正交法法將鼠抗西尼羅病毒多克隆抗體進行稀釋，測定ELISA方法敏感性，其中Al為鼠抗西尼羅病毒多抗1:200倍稀釋，并由Al-Hl做系列倍比稀釋，隨后由第一列向第四列做系列倍比稀釋。
具體實施例方式為使本發明更加容易理解，下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。
下面實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Sambrook等分子克隆實施手冊中所述的條件。本發明的下列實施例中，選用的西尼羅病毒國際標準株由中國藥品生物制品檢定所引進，申請人實驗室內有毒株樣本；而實驗中用的內切酶、連接酶、T載體購自大連TaKaRa公司。凝膠純化回收及質粒快速提取試劑盒購自OMEGA公司。Trizol及反轉錄試劑購自Invitrogen公司。pET32a表達載體購自Novagen公司，pMAL_C2x表達載體購自New England Biolabs公司，Amylose Resin親和層析試劑購自NEB公司，表達宿主菌Rosetta (DE3)由本實驗室傳代保存。實施例I、檢測西尼羅病毒的重組抗原蛋白的制備按照如下步驟制備檢測西尼羅病毒的重組抗原蛋白步驟一、選擇西尼羅病毒蛋白中呈現病毒高特異性肽段的編碼基因作為目的基因片段，該目的基因片段具有如SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列，該目的基因片段中包括編碼重組抗原蛋白柔性臂的延伸區段，所述柔性臂能夠消除表達載體的融合蛋白對多肽表位的掩蓋，使表達的重組抗原蛋白正確折疊；步驟二、設計PCR擴增引物，并通過PCR擴增所述目的基因片段；步驟三、通過限制性酶切和連接，將目的基因片段體連接到原核表達載體中，構建含有所述目的基因片段的重組表達質粒；步驟四、將所述重組表達質粒轉化至感受態的表達宿主細胞中，培養所述表達宿主細胞使其產生重組抗原蛋白，并通過純化獲取重組抗原蛋白，所述重組抗原蛋白具有如SEQ ID NO. I所示氨基酸序列。具體實現實現時，上述步驟一中，參考西尼羅病毒基因組序列，利用DNAstar及ANTHEPR0T軟件對其編碼蛋白疏水性、抗原性、可及性及可塑性進行詳細分析，并參考Genbank中的序列信息，對預測的抗原表位進行比對，初步篩選可能的抗原性片段30段。步驟二中，根據步驟一種所選的抗原性片段，并結合多肽結構中需要的延伸區段，并通過優化設計與各區段對應的引物，通過PCR擴增相應的目的基因片段，從而使由延伸區段編碼柔性臂能夠消除表達載體的融合蛋白對多肽表位的掩蓋，使表達的重組抗原蛋白正確折疊。為此，在本步驟的優選過程中，設計PCR擴增引物30對，如表一所示表一抗原片段克隆所用引物序列·
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權利要求
1.一種檢測西尼羅病毒抗體的重組抗原蛋白，其特征在于所述重組抗原蛋白具有如SEQ ID NO. I所示氨基酸序列。
2.根據權利要求I所述的檢測西尼羅病毒抗體的重組抗原蛋白，其特征在于所述重組抗原蛋白的編碼基因序列具有如SEQ ID NO. 2所不的核昔酸序列。
3.—種檢測西尼羅病毒抗體的重組抗原蛋白的制備方法，其特征在于，包括如下步驟 一、選擇西尼羅病毒蛋白中呈現病毒高特異性肽段的編碼基因作為目的基因片段，該目的基因片段具有如SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列，該目的基因片段中包括編碼重組抗原蛋白柔性臂的延伸區段，所述柔性臂能夠消除表達載體的融合蛋白對多肽表位的掩蓋，使表達的重組抗原蛋白正確折置； 二、設計PCR擴增引物，并通過PCR擴增所述目的基因片段； 三、通過限制性酶切和連接，將目的基因片段體連接到原核表達載體中，構建含有所述目的基因片段的重組表達質粒； 四、將所述重組表達質粒轉化至感受態的表達宿主細胞中，培養所述表達宿主細胞使其產生重組抗原蛋白，并通過純化獲取重組抗原蛋白，所述重組抗原蛋白具有如SEQ IDNO. I所示氨基酸序列。
4.根據權利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述步驟二中采用的PCR擴增引物序列如下 正向引物CGGGATCCCCACCAGGCACTTCAGATCCA〈SEQ ID NO. 3> 反向引物ACGCAAGCTTTTAGGCAATCTCATTCCCCATCTT〈SEQ ID NO. 4>0
5.根據權利要求3所述的制備方法，其特征在于所述原核表達載體為pMALc2x原核表達載體，所述表達宿主細胞為大腸桿菌。
6.一種西尼羅病毒的檢測試劑盒，包括抗體檢測板和ELISA反應液，其特征在于所述抗體檢測板上包被有檢測西尼羅病毒抗體的重組抗原蛋白，所述重組抗原蛋白具有如SEQID NO. I所示氨基酸序列。
7.根據權利要求6所述的檢測試劑盒，其特征在于，試劑盒中ELISA反應液包括酶結合物工作液，陽性對照，陰性對照，濃縮洗滌液，顯色液A，顯色液B和終止液，酶結合物工作液，陽性對照為西尼羅病毒抗體標準品，陰性對照為西尼羅病毒抗體陰性血清。
8.根據權利要求7所述的檢測試劑盒，其特征在于所述酶結合物工作液為辣根過氧化物酶標記的羊抗小鼠IgG。
9.根據權利要求6所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述抗體檢測板的制備過程包括如下步驟 一、重組抗原蛋白的制備，包括如下步驟 (1)、選擇西尼羅病毒蛋白中呈現病毒高特異性肽段的編碼基因作為目的基因片段，該目的基因片段具有如SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列，該目的基因片段中包括編碼重組抗原蛋白柔性臂的延伸區段，所述柔性臂能夠消除表達載體的融合蛋白對多肽表位的掩蓋，使表達的重組抗原蛋白正確折置； (2)、設計PCR擴增引物，并通過PCR擴增所述目的基因片段； (3)、通過限制性酶切和連接，將目的基因片段體連接到原核表達載體中，構建含有所述目的基因片段的重組表達質粒； (4)、將所述重組表達質粒轉化至感受態的表達宿主細胞中，培養所述表達宿主細胞使其產生重組抗原蛋白，并通過純化獲取重組抗原蛋白，所述重組抗原蛋白具有如SEQ IDNO. I所示氨基酸序列； 二、將純化后的重組抗原蛋白固定于酶聯板，該過程包括將步驟一中純化得到的重組抗原蛋白分別以梯級濃度包被酶聯板，每孔50-200ul，4°C包被過夜，而后用磷酸鹽吐溫緩沖液洗滌1-2分鐘；將其拍干后，用5%牛血清白蛋白溶液于37°C封閉1-3小時，晾干后即得到所述抗體檢測板。
10.如權利要求I或2所述的重組抗原蛋白在制備診斷西尼羅病毒試劑盒中的運用。
全文摘要
一種檢測西尼羅病毒抗體的重組抗原蛋白，所述重組抗原蛋白序列如SEQ ID NO.1所示，其編碼基因序列如SEQ ID NO.2所示，該編碼基因序列中包括編碼重組抗原蛋白柔性臂的延伸區段，柔性臂能夠消除表達載體的融合蛋白對多肽表位的掩蓋，使表達的重組抗原蛋白正確折疊。本發明還公開了該重組抗原蛋白的制備方法。另外，本發明公開的西尼羅病毒的檢測試劑盒中包含包被有上述重組抗原蛋白的抗體檢測板和ELISA反應液。本發明的重組抗原蛋白具有特異性強、親和力高的優點，與其它相近的蟲媒傳播病毒無血清學交叉反應，而與西尼羅病毒抗體具有極高親和力，能夠快速、準確地檢測西尼羅病毒抗體，從而診斷西尼羅病毒的感染情況。
文檔編號C12N15/70GK102827261SQ20121032256
公開日2012年12月19日 申請日期2012年8月31日 優先權日2012年8月31日
發明者任瑞文, 唐博恒, 駱康杰, 胡文龍, 梁克峰 申請人:任瑞文