專利名稱：一種木爾坦棉花曲葉病毒侵染性載體構建方法
技術領域：
本發明涉及基因工程領域，尤其涉及棉花DNA病毒侵染性載體構建方法。
背景技術：
棉花曲葉病(Cotton leaf curl disease)是一種在印度半島地區嚴重危害棉花生產的病害。棉花曲葉病主要由雙生病毒引起，經煙粉虱傳播，典型的癥狀是植株葉片向 上或向下卷曲、葉脈顏色加深、葉背面葉脈膨大和耳突增生，形成杯狀側葉，植株矮化，棉纖維低產，棉鈴少結或不結，可造成嚴重減產，甚至絕收。木爾坦棉花曲葉病毒(Cotton leafcurl Multan virus, CLCuMV)是引起棉花曲葉病的主要病原。木爾坦棉花曲葉病毒屬雙生病毒科(Geminiviridae)中的菜豆金黃花葉病毒屬(Begomovirus),具有典型的雙聯體顆粒形態，大小約18 20 nmX 30 nm,基因組含有DNA A和衛星DNA β分子，并形成CLCuMV/DNA β病害復合體。CLCuMV DNA A編碼AV2，AVl，AC3, AC2, ACl，AC4共6個蛋白，分別是外殼前體蛋白，外殼蛋白，復制增強蛋白，轉錄激活蛋白，復制蛋白和轉錄調控蛋白。衛星DNA β基因組大小是DNA A分子的一半，與DNA A沒有序列同源性，DNA β分子只編碼一個致病因子PCI。DNA A和 ΝΑβ在寄主體內是一種互補的關系，DNA A能夠系統侵染植株，但是單獨不能引發典型的癥狀，只有當DNAii存在時，植株才能引發典型的病毒病癥狀，并且DNAii能夠大大促進DNA A在植株中的積累量，而DNAii不能獨立復制，它必須依賴于DNA A進行復制、移動及介體傳播。雙生病毒正在全球范圍內日益猖撅危害，已有40多個國家的棉花、番茄、木薯和煙草等作物遭受此類病毒的毀滅性危害。尤其是雙生病毒DNA與衛星DNAii形成的病害復合體正在快速擴展它的地理分布和寄主范圍。我國也已在云南、廣西、廣東、福建、海南、北京、上海等17個省市的煙草、番茄、番木瓜和南瓜等作物以及假馬鞭、勝紅薊、稀鹼等雜草上發現了 40多種雙生病毒，且多數為雙生病毒DNA與衛星DNA β形成的病害復合體，并呈擴展蔓延的趨勢。這一病害復合體在全球范圍廣泛存在并逐年加重，其地理分布和寄主范圍迅速擴展，且近年來粉虱介體在全球范圍內的大爆發，加上生產上單一品種的大規模種植，這類病害復合體一旦傳入新的地區，將會給當地農業生態系統帶來巨大的威脅。CLCuMV是在廣東地區表現為曲葉癥狀的扶桑上分離得到的，其病毒全長基因組序列與木爾坦棉花曲葉病毒Nanning、G6和0kra06分離物的同源性達到99%以上。CLCuMV是不能機械傳播的雙生病毒，為了明確CLCuMV和衛星DNAii在致病中的作用，以及研究CLCuMV基因組功能，必須構建CLCuMV的侵染性克隆。目前，利用植物病毒接種植物的方法主要有三種。第一是利用機械摩擦的方法，該方法只適用于可以機械傳播侵染的植物病毒，如煙草花葉病毒和黃瓜花葉病毒，而絕大多數雙生病毒因不能機械傳播因而無法應用該方法侵染植物。第二種是基因槍轟擊的方法，該方法操作簡便，但效率低，且整套設備與金粉等耗材價格昂貴，不便于推廣。最后一種是基于農桿菌介導的方法。該方法首先在dsDNA病毒中的花椰菜花葉病毒中成功應用，并逐漸被應用于雙生病毒，它是一種簡易，有效的方法。本發明是以木爾坦棉花曲葉病毒為材料來建立侵染性載體構建的方法。
發明內容
本發明的目的是提供一種木爾坦棉花曲葉病毒侵染性載體的構建方法，包括如下步驟
1)從采集的感染木爾坦棉花曲葉病毒的棉花中提取植物基因組總DNA；
2)以該植物基因組總DNA為模板，設計病毒全長特異引物GXAsail F :5’ -GGTCGACGTCATCAATGACGTTGTA-3 和 GXA sail R :5’ -ACGTCGACCCGCATTTCCTCAAA-3’對木爾坦棉花曲葉病毒的DNA A進行PCR擴增，擴增產物克隆至T-Vector ;同時，設計衛星 DNA β 特異引物 betaOl :5’-GGTACCACTACGCTACGCAGCAGCC-3’ 和 beta02 5’ -GGTACCTACCCTCCCAGGGGTACAC-3’對木爾坦棉花曲葉病毒的衛星DNA β分子進行PCR擴增，擴增產物克隆至T-Vector ；
3)對克隆產物進行陽性克隆的篩選并進行DNA序列測定；
4)DNA序列測定結果通過DNAStar分析軟件進行組合、拼接，獲得木爾坦棉花曲葉病毒的DNA A組份和木爾坦棉花曲葉病毒的DNAii的全長基因組序列；
5)木爾坦棉花曲葉病毒侵染性載體構建在測序結果基礎上，利用分子生物學方法把木爾坦棉花曲葉病毒的DNA A組份的I. 9個正向重復的基因組構建到改良型植物表達載體pCambia2300上，獲得帶有DNA A組份的重組植物表達載體pCambia-1. 9A，并將其導入到大腸桿菌；利用限制性酶切的方法把I. 8個正向重復的木爾坦棉花曲葉病毒的DNA β構建到改良型植物表達載體pCambia2300上，獲得帶有DNA β的重組植物表達載體pCambia-1. 8 β ,并將其導入到大腸桿菌；
或在測序結果基礎上，利用分子生物學方法把木爾坦棉花曲葉病毒的DNA A組份的I. 9個正向重復和木爾坦棉花曲葉病毒的衛星DNAP的I. 8個正向重復構建到同一個改良型植物表達載體pCambia2300上，獲得帶有木爾坦棉花曲葉病毒的DNA A和衛星 ΝΑβ的重組植物表達載體pCambia-1. 9A-1. 8 β，并將其導入到大腸桿菌；
6)通過電擊的方法將上述重組植物表達載體pCambia-1.9A、pCambia-1. 8 β或pCambia-1. 9A-1. 8 β分別導入農桿菌菌株ΕΗΑ105 ；
7)接種前的菌液處理上述3種帶有木爾坦棉花曲葉病毒重組植物表達載體的農桿菌分別接種20 mL YEP雙抗液體培養基，28°C 220rpm搖菌培養至0D600為O. 8-1. 2 ;經12000rpm I分鐘離心，棄上清，用含10 mM MgCl2,10 mM MES, 200 mM乙酰丁香酮的浸潤緩沖液重新懸浮菌體，調整0D600為I. O左右，靜置2-3小時后浸潤植物備用；
8)浸潤接種選用4-6葉充分展開的苗齡期的植株，利用不帶針頭的Iml注射器在3-4周的植物葉片背面進行浸潤一株植物一般接種3-4片葉子；侵染性測定時； 9)接種植株置于25°C隔離溫室培養，10天后觀察接種植株的癥狀，對有癥狀和沒有癥狀的接種植株進行PCR和Southern blot檢測以鑒定其侵染性及病毒積累量。所述的農桿菌介導的木爾坦棉花曲葉病毒侵染性克隆用于木爾坦棉花曲葉病毒的致病性測定、病毒基因功能研究、棉花抗性品種的鑒定和培育或寄主植物、傳毒介體與病毒三者之間的互作研究。本發明的有益效果
O傳統的農桿菌介導法使用pBinplus，這個載體復制量小，加上本身質粒大，對其進行重組克隆時不易操作，本發明使用對其復制起始位點經過改良的植物表達載體pCambia2300，其復制量大大加強，并且感染植物的效率也大大增加。在這個改良型載體上也可以直接進行簡單方便的操作。2)本發明采用2種構建策略，將病毒的DNA A和DNA β分別或者同時構建在一個雙元表達載體上，大大增加病毒侵染性克隆的應用性。3)本發明使用浸潤的接種方式，相比前人的注射、針刺等方式，更為便捷高效。4)本發明采用農桿菌介導的方法，是一種比較高效且簡單實用的方法。5)本發明利用改良的細胞裂解液成功從棉花組織中提取到高質量的基因組，為構建棉花DNA病毒侵染性克隆提供保障。
圖I.pCambia L 9Α與pCambia-L 9A-L 8β浸潤本氏煙，普通煙與三生煙20天后的癥狀；
圖2.Southern-blot雜交檢測本氏煙中木爾坦棉花曲葉病毒積累量；
圖 3.CLCuMV DNA A.CLCuMV DNA β 單獨接種及 CLCuMV DNA A+DNA β 共同接種本氏煙的癥狀。
具體實施例方式木爾坦棉花曲葉病毒基因組含有DNA A和衛星DNAP。本發明對其DNA A和DNA3的全序列進行了克隆和測序，在序列測定的基礎上，通過2種構建策略，設計引物把I. 9個正向重復的全長基因組DNA A和I. 8個正向重復的全長基因組DNAii分別或者同時克隆到高復制量的植物表達載體pCambia2300上，通過農桿菌侵潤的方法使病毒基因組進入植物細胞并開始自行復制，從而實現病毒對植物的高效感染。木爾坦棉花曲葉病毒侵染性載體的構建方法，包括如下步驟
O從采集的感染木爾坦棉花曲葉病毒的棉花中提取植物基因組總DNA ；
2)以該植物基因組總DNA為模板，設計病毒全長特異引物GXAsail F 5’- GGTCGACGTCATCAATGACGTTGTA-3 (SEQ ID NO: I)和 GXA sail R 5’ -ACGTCGACCCGCATTTCCTCAAA-3’(SEQ ID NO:2)對木爾坦棉花曲葉病毒的DNA A進行PCR擴增，擴增產物克隆至T-Vector ;同時，設計衛星DNA β特異引物 betaOl :5，-GGTACCACTACGCTACGCAGCAGCC-3’ (SEQ ID NO:3)和 beta02 :5’-GGTACCTACCCTCCCAGGGGTACAC-3’ (SEQ ID N0:4)對木爾坦棉花曲葉病毒的衛星 DNA3分子進行PCR擴增，擴增產物克隆至T-Vector ；
3)對克隆產物進行陽性克隆的篩選并進行DNA序列測定；
4)DNA序列測定結果通過DNAStar分析軟件進行組合、拼接，獲得木爾坦棉花曲葉病毒的DNA A組份和木爾坦棉花曲葉病毒的DNAii的全長基因組序列；
5)木爾坦棉花曲葉病毒侵染性載體構建在測序結果基礎上，利用分子生物學方法把木爾坦棉花曲葉病毒的DNA A組份的I. 9個正向重復的基因組構建到改良型植物表達載體pCambia2300上，獲得帶有DNA A組份的重組植物表達載體pCambia-1. 9A，并將其導入到大腸桿菌；利用限制性酶切的方法把I. 8個正向重復的木爾坦棉花曲葉病毒的DNA β構建到改良型植物表達載體pCambia2300上，獲得帶有DNA β的重組植物表達載體pCambia-1. 8 β ,并將其導入到大腸桿菌；
或在測序結果基礎上，利用分子生物學方法把木爾坦棉花曲葉病毒的DNA A組份的I. 9個正向重復和木爾坦棉花曲葉病毒的衛星DNAP的I. 8個正向重復構建到同一個改良型植物表達載體pCambia2300上，獲得帶有木爾坦棉花曲葉病毒的DNA A和衛星DNA β的重組植物表達載體pCambia-1. 9A-1. 8 β，并將其導入到大腸桿菌；
6)通過電擊的方法將上述重組植物表達載體pCambia-1.9A、pCambia-1. 8 β或 pCambia-1. 9A-1. 8 β分別導入農桿菌菌株ΕΗΑ105 ；
7)接種前的菌液處理上述3種帶有木爾坦棉花曲葉病毒重組植物表達載體的農桿菌分別接種20 mL YEP雙抗液體培養基，28°C 220rpm搖菌培養至0D600為O. 8-1. 2 ;經12000rpm I分鐘離心，棄上清，用含10 mM MgCl2,10 mM MES, 200 mM乙酰丁香酮的浸潤緩沖液重新懸浮菌體，調整OD600為I. O左右，靜置2-3小時后浸潤植物備用；
8)浸潤接種選用4-6葉充分展開的苗齡期的植株，利用不帶針頭的Iml注射器在3-4周的植物葉片背面進行浸潤一株植物一般接種3-4片葉子；侵染性測定時；
9)接種植株置于25°C隔離溫室培養，10天后觀察接種植株的癥狀，對有癥狀和沒有癥狀的接種植株進行PCR和Southern blot檢測以鑒定其侵染性及病毒積累量。所述的農桿菌介導的木爾坦棉花曲葉病毒侵染性克隆用于木爾坦棉花曲葉病毒的致病性測定、病毒基因功能研究、棉花抗性品種的鑒定和培育或寄主植物、傳毒介體與病毒三者之間的互作研究。下面結合實施例和附圖對本發明作進一步說明。實施例I木爾坦棉花曲葉病毒DNA A和DNAP基因組全序列的克隆和測定 I.感病棉花總DNA的抽提
稱取O. Ig棉花病葉，加液氮研磨至粉末狀，加入I ml細胞裂解液(100 mM ph8. OTris-Hcl, 25mM EDTANa2, 2M NaCl, 2% CTAB, 2%)，使用前加入 β -巰基乙醇 2· 3 μ /ml)，繼續研磨，轉移至2 ml離心管，65°C孵育30分鐘后，加入O. 4 ml氯仿，溫和地顛倒混勻，4°C 12000 rpm離心5分鐘，吸取上清，重復3次后，將上清轉移至I. 5 ml離心管中，力口入等體積異丙醇，_20°C靜置I小時。再12000 rpm離心5分鐘，棄上清，沉淀用75%乙醇洗一次，棄去乙醇，經真空干燥機使殘留乙醇揮發，將沉淀溶于40 ul超純水中。2. PCR擴增、克隆以及全基因組序列測定和分析
以木爾坦棉花曲葉病毒廣西分離物總DNA為模板，利用簡并引物PA(5，-TAATATTACCKGWKGVCCSC-3，，SEQ ID NO:5)和 PB ( 5，-TGGACYTTRCAWGGBCCTTCACA-3，，SEQ ID N0:6)( A, G = R ； A, T = W ； C, G=S ； C, T = Y ； G, T = K ； G, T, C = B ； A, C，G=V)進行PCR擴增，反應參數為94°C 3 min;94°C變性45 sec，50°C退火30 sec，72°C延伸30sec，35個循環后72°C延伸10 min，約500 bp的PCR產物經Axygen膠純化Kit回收后克隆至pMD 18-T載體，陽性克隆經PCR或酶切鑒定進行序列測定和分析。在序列測定和分析的基礎上設計一對全長引物 GXA sail F(5，- GGTCGACGTCATCAATGACGTTGTA-3’，SEQ IDNO: I)和 GXA sail R (5，-ACGTCGACCCGCATTTCCTCAAA-3’, SEQ ID NO:2 )進行擴增，反應參數為94°C 3 min;94°C變性 45 sec，54°C退火 30sec，72°C延伸 3 min，35 個循環后 72°C延伸10 min，PCR產物為約2. 7 kb的條帶，經膠純化Kit回收后，用fe7I酶切后連接至pCambia2300載體上,得到pCambia-A,經過測序分析后得到總長2738個核苷酸的木爾坦棉花曲葉病毒 DNA A 序列(GenBank: JQ317603)。同樣，以木爾坦棉花曲葉病毒廣西分離物DNA為模板，以beta01(5’ -GGTACCACTACGCTACGCAGCAGCC-3’，SEQ ID NO:3)和 beta02(5’-GGTACCTACCCTCCCAGGGGTACAC-3’，SEQ IDNO:4)進行 PCR 擴增，反應參數為94°C 3 min ;94°C變性 45 sec，50°C退火 30 sec，72°C延伸I. 5 min, 35個循環后72°C延伸10 min，約1300 bp的PCR產物經Axygen膠純化Kit回收后克隆至pMD 18-T載體，陽性克隆經PCR或酶切鑒定進行序列測定和分析。在序列測定和分析的基礎上設計衛星 DNA β 全長弓 I物 GXbetasalI F (5’ -ACAGTCGACGTTCGCATCATGAC-3’，SEQ ID NO:7)與 GXbetasalI R(5，-AACGTCGACTGTGAACCTGACTC-3，，SEQ ID NO:8)，對DNA β全長基因組進行PCR擴增。反應參數為94°C 3 min;94°C變性45 sec，55°C退火30 sec，72°C延伸2 min，35個循環后72°C延伸10 min，PCR產物經過fe/I酶切后，連接至 pCambia2300，獲得一個全長拷貝的木爾坦棉花曲葉病毒衛星DNAP，即pCambia-β，對其進行全序列測定，獲得DNAii的全長基因組序列1336個核苷酸(GenBank: JQ317604)。實施例2木爾坦棉花曲葉病毒DNA A和DNA β侵染性載體的構建 I. DNA A組分侵染性克隆的構建
雙生病毒的農桿菌介導的侵染性克隆需要I. 1-2. O個重復以上的全長基因組，并且必須包括雙生病毒的2個共同區。以全長DNA A克隆為模板，以GXA Xbal F (5’-CCTGAAAGATCCTGTCTAGATTTGCAT-3’，SEQ ID Ν0:9)與 GXA sail R 為引物，反應參數為94°C 3 min ；94°C變性 45 sec，55°C退火 30 sec，72°C延伸 3 min, 35 個循環，最后 72°C延伸 10 min,PCR產物利用Sall和油al雙酶切后，利用AxgenPCR清潔試劑盒清潔后，與同樣經過和油al酶切的pCambia2300以7:1摩爾比混勻后T4連接16°C反應過夜。第二天將連接反應液熱擊轉化大腸桿菌DH5 α菌株。具體操作步驟為將連接反應液與DH5a感受態細胞冰上孵育30分鐘；孵育后的感受態42°C熱擊I分鐘后，放在冰上5分鐘；加入I ml LB恢復培養基，37°C，220 rpm培養I小時；將培養一小時后的細胞在1200 rpm離心I分鐘，取菌體均勻涂布于含有Km抗性的LB固體培養基上，37°C過夜培養，第二天通過PCR篩選陽性菌斑，獲得pCambia-0. 9A,并進行序列驗證。另外一個DNA A的全長copy來自于pCambia-A。將pCambia-A用Sal I單酶切下約2. 7Kb產物，與同樣經過Sal I酶切的pCambia_0. 9A連接，利用PCR篩選方向后得到pCambia-1. 9A。2.衛星DNA3侵染性克隆的構建
木爾坦棉花曲葉病毒廣西分離物總DNA為模板，以GXbeta sail F (5’ -ACAGTCGACGTTCGCATCATGAC-3，，SEQ ID NO: 10)與 GXbeta Hind III R (5，-CTTGAAAGCTTTATACATGGGTTTGTACC-3’，SEQ ID NO: 11)進行 PCR 擴增，PCR 反應參數為 94 °C 3 min ;94°C 變性45 sec，52°C退火 30 sec，72°C延伸 I. 5 min, 35 個循環，最后 72°C延伸 10 min, PCR 產物利用Sall和歷/2d III雙酶切后，與同樣經過1和歷/ d III酶切的pCambia2300連接，獲得pCambia-0. 8 β ,并進行序列驗證。另外一個DNAP的全長拷貝來自于pCambia-β。將其用Sall酶切下約I. 3Kb產物連接到pCambia-O. 8 β上，得到pCambia-l. 8 β。將pCambia-l. 9A和pCambia-l. 8 β通過電擊方法分別轉化到大腸桿菌DH5 α ,分別得到 pCambia-l. 9A (DH5 α )和 pCambia-l. 8 β (DH5 α )兩個大腸桿菌菌株。3.同時含有DNA A和衛星DNA β的侵染性克隆構建為了提高接種效率，使接種的每個植物細胞中均勻攜帶木爾坦棉花曲葉病毒DNA A和衛星DNA β分子，我們通過策略2將DNA A和衛星DNAP同時構建到pCambia2300。具體步驟為1·以 pCambia-1. 8 β 為模板，利用 GXbetaXmaF(5，-cccgggAGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3’， SEQ ID NO:12)和 GXbetaXmaR (5， -cccgggCGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC_3’， SEQID NO: 13)這對引物，進行PCR擴增，反應程序為為94°C 3 min ;94°C變性45 sec，58°C退火30sec，72°C延伸I. 5 min, 35個循環，最后72°C延伸10 min，得到兩端含有酶切位點的約為2. 3Kb大小的I. 8 β片段。將該片段與pCambia-1. 9A分別進行ZaaI酶切反應，經連接、轉化、篩選后，轉化到大腸桿菌DH5 α得到pCambia-1. 9A_1. 8 β (DH5 α )。實施例3.侵染性載體電擊轉化農桿菌
pCambia-1. 9A (DH5a )、pCambia-l. 8β (DH5α )和 pCambia-l. 9Α_1· 8β (DH5α )接種5 ml含Km (50 mg/L) LB液體培養基，37°C條件下200 rpm過夜培養后，離心收集菌體，利用Axgen質粒提取試劑盒提取質粒。農桿菌菌株EHA105接種5 ml含RifX 50 mg/L)YEP液體培養基，28°C下200 rpm培養48小時，離心后棄上清培養液，用無菌水重新懸浮菌體， 再離心，棄上清，重復3-4次，得到EHA105感受態細胞。取2 μ L pCambia-l. 9A>pCambia-1. 8 β 和 pCambia-l. 9Α_1· 8 β 質粒，與 200 μ L農桿菌ΕΗΑ105感受態細胞混勻,用Bio-rad gene pluser xcell電擊儀，電壓2400V,電擊轉化農桿菌EHA105。將轉化后的農桿菌加入I ml YEP恢復培養基，28°C 220rpm搖菌3小時后，取50 ul菌液，均勻涂布在含有Km和Rif雙抗性的YEP固體培養基上，28°C培養兩天。第三天，利用 PCR 篩選陽性菌落，得到 pCambia I. 9A (EHA105)、pCambia-1. 8 β (ΕΗΑ105)和 pCambia-1. 9Α-1. 8β (ΕΗΑ105)。實施例4.農桿菌浸潤接種植物
將 pCambia-Ι. 9ACEHA105),pCambia-1. 8 β (ΕΗΑ105)和 pCambia-l. 9A-1. 8 β (ΕΗΑ105)分別在20 ml含Km (50 mg/L)和Rif (50 mg/L)的YEP液體培養基培養，28°C下200 rpm振蕩48小時。接種時分為兩組接種DNA A單獨接種和DNA A + DNAβ共同接種。接種植株選用4-6葉充分展開苗齡期為宜。兩種組合分別接種本氏煙、三生煙、普通煙。具體接種方法如下，將 pCambia-1. 9A (EHA105)和 pCambia-l. 9A-1. 8 β (ΕΗΑ105)各 20 ml 菌液經過12000 rpm I分鐘離心，棄上清，用浸潤緩沖液(10 mM MgCl2,10 mM MES, 200 mM乙酰丁香酮)重新懸浮菌體，調整0D600為I. O左右，靜置2-3小時后浸潤植物。DNA A單獨接種時用處理的pCambia-1. 9A (EHA105)浸潤植株；DNA A + DNAβ共同接種時，將處理的 pCambia-1. 9A (EHA105)和 pCambia-1. 8 β (ΕΗΑ105) I: I 混合后浸潤植株，或用處理的pCambia-1. 9A-1. 8 β (ΕΗΑ105)直接浸潤植株。浸潤時，取一支不帶針頭的I ml —次性注射器在5-6葉期植物葉片進行葉背浸潤，一株植物一般需要Iml菌液浸潤3-4片葉子，接種植株置于25°C隔離溫室培養。實施例5.木爾坦棉花曲葉病毒侵染性克隆的侵染性測定
癥狀觀察表明，DNA A單獨接種的本氏煙植株在接種10天后開始出現葉邊緣微弱的下卷；而DNA A和DNAii共同接種的本氏煙，7天后植株系統葉開始出現葉片下卷，到生長后期，葉背面出現耳突。DNA A單獨接種普通煙和三生煙，植株不出現明顯的病毒病癥狀；而DNA A和DNAii共同接種普通煙和三生煙21天后，系統葉開始表現出明顯的葉片卷曲、葉背面葉脈膨大，到生長后期，新葉和頂端嚴重卷曲，植株明顯矮化，普通煙的葉柄還會呈現嚴重彎曲(圖I)。在發病植株中均能通過PCR擴增到CLCuMV DNA A和DNA β的特異性片段，在本氏煙中CLCuMV DNA單獨接種的效率為97. 7%，CLCuMV DNA A和DNAP共同接種的效率達到100% (表 I)。表I.木爾坦棉花曲葉病毒對不同植物的侵染性及侵染效率檢測
權利要求
1.一種木爾坦棉花曲葉病毒侵染性載體的構建方法，其特征在于包括如下步驟 1)從采集的感染木爾坦棉花曲葉病毒的棉花中提取植物基因組總DNA； 2)以該植物基因組總DNA為模板，設計病毒全長特異引物GXAsail F :5’ -GGTCGACGTCATCAATGACGTTGTA-3 和 GXA sail R :5，-ACGTCGACCCGCATTTCCTCAAA-3’對木爾坦棉花曲葉病毒的DNA A進行PCR擴增，擴增產物克隆至T-Vector ;同時，設計衛星 DNAP 特異引物 betaOl :5’-GGTACCACTACGCTACGCAGCAGCC-3’ 和 beta02 5’ -GGTACCTACCCTCCCAGGGGTACAC-3’對木爾坦棉花曲葉病毒的衛星DNA β分子進行PCR擴增，擴增產物克隆至T-Vector ； 3)對克隆產物進行陽性克隆的篩選并進行DNA序列測定； 4)DNA序列測定結果通過DNAStar分析軟件進行組合、拼接，獲得木爾坦棉花曲葉病毒的DNA A組份和木爾坦棉花曲葉病毒的DNAii的全長基因組序列； 5)木爾坦棉花曲葉病毒侵染性載體構建在測序結果基礎上，利用分子生物學方法把木爾坦棉花曲葉病毒的DNA A組份的I. 9個正向重復的基因組構建到改良型植物表達載體pCambia2300上，獲得帶有DNA A組份的重組植物表達載體pCambia-1. 9A，并將其導入到大腸桿菌；利用限制性酶切的方法把I. 8個正向重復的木爾坦棉花曲葉病毒的DNA β構建到改良型植物表達載體pCambia2300上，獲得帶有DNA β的重組植物表達載體pCambia-1. 8 β ,并將其導入到大腸桿菌； 或在測序結果基礎上，利用分子生物學方法把木爾坦棉花曲葉病毒的DNA A組份的I.9個正向重復和木爾坦棉花曲葉病毒的衛星DNAP的I. 8個正向重復構建到同一個改良型植物表達載體pCambia2300上，獲得帶有木爾坦棉花曲葉病毒的DNA A和衛星 ΝΑβ的重組植物表達載體pCambia-1. 9A-1. 8 β，并將其導入到大腸桿菌； 6)通過電擊的方法將上述重組植物表達載體pCambia-1.9A、pCambia-1. 8 β或pCambia-1. 9A-1. 8 β分別導入農桿菌菌株ΕΗΑ105 ； 7)接種前的菌液處理上述3種帶有木爾坦棉花曲葉病毒重組植物表達載體的農桿菌分別接種20 mL YEP雙抗液體培養基，28°C 220rpm搖菌培養至0D600為O. 8-1. 2 ;經12000rpm I分鐘離心，棄上清，用含10 mM MgCl2,10 mM MES, 200 mM乙酰丁香酮的浸潤緩沖液重新懸浮菌體，調整0D600為I. O左右，靜置2-3小時后浸潤植物備用； 8)浸潤接種選用4-6葉充分展開的苗齡期的植株，利用不帶針頭的Iml注射器在3-4周的植物葉片背面進行浸潤一株植物一般接種3-4片葉子；侵染性測定時； 9)接種植株置于25°C隔離溫室培養，10天后觀察接種植株的癥狀，對有癥狀和沒有癥狀的接種植株進行PCR和Southern blot檢測以鑒定其侵染性及病毒積累量。
2.一種如權利要求I所述的農桿菌介導的木爾坦棉花曲葉病毒侵染性克隆的應用，其特征在于用于木爾坦棉花曲葉病毒的致病性測定、病毒基因功能研究、棉花抗性品種的鑒定和培育或寄主植物、傳毒介體與病毒三者之間的互作研究。
全文摘要
本發明涉及一種木爾坦棉花曲葉病毒侵染性載體的構建方法。以木爾坦棉花曲葉病毒為材料對基因組DNAA和衛星DNAβ進行了侵染性克隆的構建，通過2種構建策略，將1.9個正向重復的基因組DNAA和1.8個正向重復的衛星DNAβ分別或者同時構建在具有高度復制能力的植物表達載體pCambia2300上，重組載體通過電擊的方法導入農桿菌菌株，獲得以農桿菌介導的對寄主植物具有高效侵染能力的病毒載體。本發明為研究病毒基因組結構與功能、寄主與病毒之間的互作、以及通過病毒誘導的基因沉默用以研究植物功能基因組提供了成熟的方法和體系。
文檔編號C12R1/94GK102816791SQ20121032677
公開日2012年12月12日 申請日期2012年9月6日 優先權日2012年9月6日
發明者周雪平, 顧周杭, 謝艷, 胡高潔 申請人:浙江大學