一種結核肽Ag85B_199-207特異性TCR、其重組逆轉錄病毒載體與應用的制作方法

專利名稱：：一種結核肽Ag85B_199-207特異性TCR、其重組逆轉錄病毒載體與應用的制作方法
技術領域：
：本發明屬于生物工程領域，具體涉及一種結核抗原肽特異性T細胞受體(TCR)，以及利用該TCR制備得到的一種用于結核基因治療的逆轉錄病毒載體，逆轉錄病毒載體轉染得到的CD8+T細胞及其在制備抗結核病藥物中的應用。
背景技術：
：結核是全球范圍內感染率最高的傳染病，病死率僅次于艾滋病。近年來，隨著人口流動的增加、HIV與結核菌伴發感染、以及耐藥和多重耐藥菌株的流行，使全球結核病死灰復燃，呈現卷土重來之勢。據WHO統計報告，全世界有1/3人口受到結核菌感染，結核病患者達2000萬，每年新發病人數800-1000萬、因結核病死亡人數300萬。我國是世界上22個結核病高負擔國家之一，結核病人數高居全球第二，目前結核菌感染人數已超過6億，結核病患者達600萬之多，每年新發病人數150萬、因結核病死亡人數25萬，全國肺結核報告發病人數和死亡人數一直高居各種傳染病之首。目前結核病治療仍以化療為主，但存在療程長、毒副作用大等缺點，降低了病人服藥順從性，病人不規則服藥、自行停藥、選擇性服藥等都可能提高結核桿菌耐藥的機率，耐藥菌的產生是導致結核難治的根本原因，單一調整化療方案效果有限；而且化療無法解決因機體免疫力低下或缺陷引起的內源性復燃和外源性再感染。因此，開創新的有效的治療方法已成為當務之急！T細胞抗原受體(Tcellreceptor,TCR)是所有T細胞表面的特征性標志，在T細胞抗原識別中起關鍵作用。TCR是由α、β兩條肽鏈構成的異二聚體，每條肽鏈又可分為可變區(V區)，恒定區(C區)，跨膜區和胞質區等幾部分；其胞質區很短，信號傳遞主要通過與其以非共價鍵結合的CD3分子進行。TCR分子屬于免疫球蛋白超家族，其抗原特異性存在于V區；V區(Va、νβ)又各有三個高變區⑶R1XDR2、⑶R3，其中以⑶R3變異最大，直接決定了TCR的抗原結合特異性。在TCR識別MHC-抗原肽復合體時，⑶R1、⑶R2識別和結合MHC分子抗原結合槽的側壁，而CDR3直接與抗原肽相結合。根據TCRνα、νβ基因的同源性，可將80多個TCRVa基因分為32個家族、60多個TCRνβ基因分為24個家族。利用每個T細胞克隆均有其獨特CDR3序列的特點，采用CDR3譜型分析技術，可測定各TCR家族各CDR3出現的頻率，由此反映T細胞的克隆性。未接受抗原刺激的T細胞中，針對各種抗原的T細胞克隆分布均勻，表現為多家族和多克隆性，具體地，表現為各家族均出現呈高斯分布的約8個CDR3峰；抗原刺激則引起識別該抗原的某一個或幾個特異TCR家族T細胞反應性增生，表現為該家族CDR3成員出現少于4個峰的寡克隆或單克隆分布，其中具有單克隆CDR3分布(表現為單峰)的TCR家族即是抗原特異單克隆增生的TCR家族。對該家族PCR產物進行測序，可獲得抗原特異TCRCDR3序列。⑶8+T細胞是T淋巴細胞的一種，通過抗原識別受體(TCRαβ)識別多肽抗原與自體MHCI類分子形成的復合物，能特異性殺傷表達其TCR所識別的抗原表位的靶細胞，在抗細菌與病毒感染、急性同異型移植物排斥和對腫瘤細胞的殺傷作用中是重要的效應細胞，被稱為細胞毒性T淋巴細胞(CTL)。近年來，在感染結核桿菌的小鼠模型中發現，功能性CD8+T細胞的缺乏顯著增加小鼠對結核桿菌的易感性，表明CD8+T細胞與CD4+T細胞一樣，在抗結核感染中具有重要的保護作用。臨床研究也發現，⑶8+T細胞能識別結核桿菌感染的細胞，通過釋放IFN-Y、溶解感染的靶細胞和直接殺傷細胞內細菌，在抗結核桿菌感染免疫反應中發揮重要作用。鑒定結核抗原的MHCI限制性CTL表位，對于闡明CD8+T細胞在抗結核中的保護效應、深入了解抗結核免疫反應以及研發新型抗結核疫苗等具有至關重要的作用。Ag85復合體是結核桿菌表達的一種具有免疫顯性的抗原蛋白，由85A、85B和85C3種高度同源的蛋白組成，與分枝桿菌的轉移酶活性相關，參與合成分枝桿菌的細胞壁，能夠在多數接觸結核桿菌的健康人體內誘導T細胞增殖和IFN-Y釋放，是結核疫苗較理想的候選抗原。Ag85B199_2OT肽是一個高度保守的結核抗原肽，具有HLA-A*0201限制性，而此等位基因在人群中的頻率超過40%。Ag85B199_207肽可誘導抗結核桿菌的Thl型保護性免疫反應，使效應性T細胞表達IFN-Y和TNF-α等細胞因子發揮抗菌作用。體內實驗表明，以Ag85B199_207免疫HLA-A2/Kb轉基因小鼠可提高T細胞增殖水平和細胞毒性水平。
發明內容本發明的目的在于篩選出結核肽Ag85B199_2Q7(KLVANNTRL)特異的TCR，利用逆轉錄病毒載體將其轉染到⑶8+T細胞中，獲得表達結核肽Ag85B199_2OT特異TCR的⑶8+T細胞，以及該經過TCR基因修飾的CD8+T細胞在制備抗結核病藥物中的應用。本發明所采用的技術方案是結核肽Ag85B199_2Q7特異性T細胞受體(TCR)，包括a鏈和β鏈，其中，α鏈的CDR3區含有SEQIDNO:3所述的序列；β鏈的⑶R3區含有SEQIDNO:4所示的序列。優選的，所述結核肽Ag85B199_2OT特異性TCR的a鏈是由SEQIDNO:10所示的氨基酸序列經取代、缺失和/或增加一個或多個氨基酸和/或末端修飾后所得到的能特異與外源性β鏈裝配成TCR蛋白分子的氨基酸序列；β鏈是由SEQIDNO:6所示的氨基酸序列經取代、缺失和/或增加一個或多個氨基酸和/或末端修飾后所得到的能特異與外源性α鏈裝配成TCR蛋白分子的氨基酸序列。優選的，所述結核肽Ag85B199_2OT特異性TCR的a鏈的氨基酸序列如SEQIDNO:12所示，β鏈的氨基酸序列如SEQIDNO:8所示。編碼結核肽Ag85B199_2Q7特異性TCR的基因。一種結核肽Ag85B199_2OT特異性TCR的融合基因，其序列如SEQIDNO:13所示。一種重組逆轉錄病毒載體，含有編碼結核肽Ag85B199_2(l7特異性TCR的基因。一種重組逆轉錄病毒載體，含有SEQIDNO:13所示的基因。優選的，上述重組逆轉錄病毒載體的出發載體為pMX-IRES-GFP、pMCs-IRES-GFP或pMYx-IRES-GFP。上重組逆轉錄病毒載體經包裝后得到的逆轉錄病毒。上述逆轉錄病毒轉染的⑶8+T細胞。結核肽Ag85B特異性TCR，編碼該TCR的基因，含有該基因的重組逆轉錄病毒載體、逆轉錄病毒，該逆轉錄病毒轉染的CD8+T細胞在制備抗結核病藥物中的應用。實現上述技術方案具體步驟流程如下I、篩選結核肽Ag85B199_2Q7(KLVANNTRL)特異的TCR①采用淋巴細胞分離液分離HLA-A*0201型健康志愿者外周血單個核細胞(peripheralbloodmononuclearcell,PBMC)；②計數PBMC，調整PBMC數目為IXIO6/孔，每孔細胞分別加入含結核肽Ag85B199_2(l7(KLVANNTRL)的10%FBS-1640培養基2ml；③貼壁培養2h后，加入25U/mlIL-2,第3天補加IL-2至50U/ml，第5天加入IL-2100U/ml，之后以此濃度繼續培養11天；④磁珠分選出⑶8+T細胞，提取其mRNA，并逆轉錄為cDNA；⑤互補決定區3(complementaritydeterminingregion3,CDR3)譜型分析檢測刺激前后⑶R3譜型，找出刺激后呈單克隆增生的結核肽Ag85B199_2(l7特異的TCRα、β基因家族。2、構建重組逆轉錄病毒載體①根據GeneBank報道的人TCRα、β基因家族上游可變區(variableregion,V)和下游恒定區(constantregion,C)基因序列，設計TCRα、β鏈全長基因上、下游引物,擴增出結核肽特異的TCRα、β全長基因。②設計C區突變位點上、下游引物，采用重組PCR方法將TCRα、β鏈C區的9個關鍵氨基酸進行突變(參照文獻Luoff.etal.DevelopmentofgeneticallyengineeredCD4+andCD8+T-cellsexpressingTCRsspecificfora38kDaM.tuberculosisantigen.JMolMed.2011，89(9):903_13)。該步驟的目的在于減少內外源性TCRα、β基因的錯配，因為⑶8+T細胞存在內源性TCRα、β基因的表達，通過突變可以促使外源性α與β基因表達的蛋白正確裝配成TCR蛋白分子并穩定表達在CD8+T細胞表面，同時利于其競爭結合CD8+T細胞表面的CD3分子，增強信號傳導功能，提高修飾后CD8+T細胞的抗結核活性。當然，此處還可以釆取其他策略來減少內外源性TCRα.β鏈的錯配，如以0)3ζ鏈替換α、β全長基因部分C區(Sebestyen，Z.etal.(2008)HumanTCRthatincorporateCD3{zeta}inducehighlypreferredpairingbetweenTCR{alpha}and{beta}chainsfollowinggenetransfer.J.Immunol.180，7736-7746);在外源性α、β基因C區引入二硫鍵(Boulter，J.M.etal.(2003)Stable,solubleT—cellreceptormoleculesforcrystallizationandtherapeutics.ProteinEng.16，707-711);突變外源性α、β基因C區關鍵氨基酸以改變α、β鏈之間的靜電荷(Voss，R.H.etal.(2008)MoleculardesignoftheCabinterfacefavorsspecificpairingofintroducedTCRabinhumanTcells.J.Immunol.180，391-401);將外源性α、β基因V區合并為一條單鏈TCR并與CD3ζ鏈融合(Willemsen，R.A.etal.(2000)GraftingprimaryhumanTlymphocyteswithcancer-specificchimericsinglechainandtwochainTCR.GeneTher.7，1369-1377);利用2A連接外源性α、β基因實現平衡表達(LeisegangMjEngelsB，MeyerhuberP，KiebackE，SommermeyerD，XueSAjReussS，StaussH，UckertW.EnhancedfunctionalityofTcellreceptor-redirectedTcellsisdefinedbythetransgenecassette.JMolMed.2008,86:573-583.)等。③利用重組PCR技術，將結核肽Ag85B199_2OT特異的TCRα、β基因片段通過自剪切多肽Ρ2Α進行連接獲得最小突變TCR基因；④將測序正確的hVβ16mCβ-P2A-hVα13mCα融合基因插入逆轉錄病毒載體pMX-IRES-GFP，酶切鑒定；⑤采用脂質體轉染法，將重組逆轉錄病毒表達質粒pMX-hVβmCβ-P2A-hVamCa-IRES-GFP與包膜蛋白質粒VSV-G共轉染GP2-293；⑥收集48h-72h病毒上清，低溫超速離心濃縮純化病毒；⑦重組病毒感染NIH3T3細胞，流式細胞術檢測病毒滴度，計算公式病毒滴度(IU/ml)=NIH3T3細胞數XGFP陽性率/病毒濃縮液量(ml)。3、鑒定重組逆轉錄病毒轉染的⑶8+T細胞的抗結核活性①采用Ficoll密度梯度離心法，分離HLA-A*0201型供者外周血PBMC；②磁珠分選CD8+T細胞；③IL-2和抗CD3單抗活化分選出的T細胞；④按感染復數(multiplicityofinfection,MOI)=13將上述重組逆轉錄病毒感染CD8.T細胞；⑤使用IL-2和抗⑶3單抗刺激感染后的⑶8+T細胞；⑥流式細胞術檢測病毒感染后陽性細胞的百分比；⑦測定病毒轉染的CD8+T細胞的抗TB活性實驗設置陰性對照組(結核肽Ag85B199_2(l7特異TCR基因修飾的⑶8+T細胞+樹突狀細胞(dendriticcells,DC))、未轉染組(未轉染CD8+T細胞+負載結核肽Ag85B199_2(l7的DC)、空載體轉染組(空載體轉染⑶8+T細胞+負載結核肽Ag85B199_2OT的DC)、無關肽組(結核肽Ag85B199_2(l7特異TCR基因修飾的CD8+T細胞+負載CMVpp65的DC)、TBTd+TB-DC組(結核肽Ag85B199_2Q7特異TCR基因修飾的CD8+T細胞+負載結核肽Ag85B199_2(l7的DC)。用酶聯免疫吸附分析法(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)檢測上述各組細胞培養上清中IFN-Y、TNF-α的分泌水平；用時間分辨熒光免疫分析技術(time-resolvedfluoroimmuno-assay,TRFIA)檢測CD8+T細胞對DC的殺傷活性。其中，CD8+T細胞是人體內的一種細胞亞群，可由人外周血中分離獲得，并進行體外擴增培養，分離和培養的實驗設備要求低，技術成熟。逆轉錄病毒載體是由一種逆轉錄病毒序列構建的基因運載工具，能夠攜帶外源基因或DNA進入宿主細胞，并整合到染色體基因組上，目前已成為商業化產品，容易購買和獲得。重組逆轉錄病毒載體的構建方法為本領域常用的分子克隆技術，重組逆轉錄病毒轉染方法是目前常用的生物技術手段，除本發明中使用的人工脂質體法外，還可以使用其它化學轉染法，包括=DEAE-葡聚糖法、磷酸鈣法；以及物理方法，包括顯微注射、電穿孔、基因槍等。本發明的有益效果在于本發明成功篩選出結核肽Ag85B199_2(l7特異的TCR，攜帶該肽特異TCR基因的逆轉錄病毒轉染的⑶8+T細胞可成功表達外源性TCR基因，特異性識別結核肽Ag85B199_2(l7并介導IFN-y,TNF-α細胞因子分泌和細胞毒活性，具有結核病基因治療的應用價值，可為結核病的過繼細胞免疫治療開辟新徑。圖I結核肽Ag85B199_207刺激前后CD8.T細胞TCRα和β鏈CDR3譜型分析；圖2重組逆轉錄病毒載體pMX-hVβ16mCβ_P2A_hVα13mCα-IRES-GFP構建示意圖；圖3pMX-hVβ16mCP-P2A-hVa13mCa-IRES-GFP的酶切鑒定(M.DL15000marker；I.pMX-IRES-GFP空載體；2.pMX-IRES-GFP空載體的XhoI酶切產物；3.pMX-hVβ16mC3-P2A-hVa13mCa-IRES-GFP；4.pMX-hVβ16mCβ_P2A_hVa13mCa-IRES-GFP的XhoI酶切產物；5.pMX-hVβ16mCβ_P2A_hVa13mCa-IRES-GFP的Xhol+Notl雙酶切產物)；圖4熒光顯微鏡觀察重組病毒轉染后NIH3T3細胞GFP的表達(XlO)(a.明場；b.熒光；c.置加圖);圖5流式細胞術檢測重組病毒轉染后NIH3T3細胞的GFP表達陽性率(a.未轉染；b.pMX-hVβ16mCβ_P2A_hVa13mCa-IRES-GFP)；圖6熒光顯微鏡觀察重組病毒轉染后⑶8+T細胞GFP的表達(X10；EmTd:空載體轉染組；TBTd:重組病毒轉染組)；圖7流式細胞術檢測重組病毒轉染后⑶8+T細胞GFP的表達(UnTd:未轉染組；EmTd空載體轉染組JBTd:重組病毒轉染組)；圖8ELISA檢測⑶8+T細胞IFN-Y的分泌水平；圖9ELISA檢測⑶8+T細胞TNF-α的分泌水平；圖10TRFIA檢測⑶8+T細胞的殺傷活性。具體實施例方式下面結合實施例對本發明作進一步的說明，但并不局限于此。以下實施例中未注明具體條件的實驗方法，按照常規條件操作，例如Sambrook等編著的《分子克隆實驗指南》(第三版)(SambrookJ,RussellDW,JanssenK,ArgentineJ.黃培堂等譯，2002，北京科學出版社)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。以下實施例中，所有計量資料結果用±s表示，采用單因素方差分析(One-Way八勵￥4)比較各組間細胞因子正^￥、了即-0分泌水平的差異，方差不齊時用Welch校正，采用LSD法進行各組間兩兩比較，方差不齊時采用Dunnett’sT3法校正。檢驗水準α=0.05，雙側檢驗。采用SPSS17.Oforwindows統計軟件包進行數據分析。實施例I.篩選結核肽Ag85B199_2Q7(KLVANNTRL)特異的TCRI.I密度梯度離心法分離純化PBMC(1)在15ml刻度無菌離心管加入適量Ficoll淋巴細胞分離液；(2)取肝素抗凝的外周靜脈血與等量RPMI1640液充分混勻稀釋，用巴斯德滴管吸取2倍體積的抗凝血沿管壁緩慢疊加于淋巴細胞分離液上，注意保持界面完整。If20°C，1800"2000rpm/min水平離心2030min；(3)離心后管內液體分為四層，上層為血漿和稀釋液，管底主要為紅細胞和粒細胞層。中層為淋巴細胞分離液，在上、中層界面處有一以單個核細胞為主的灰白色云霧層；(4)用吸管插到灰白色層，吸取單個核細胞，置于另一離心管內，加入5倍以上體積的RPMI1640液，1820°C，1500rpm/min離心lOmin，洗滌細胞兩次去除大部分混雜的血小板后為PBMC；(5)細胞計數及細胞活力檢測PBMC細胞懸液與1/10體積的O.4%臺酚藍染液混合，于血球計數板上計數板上角上四個大方格總細胞數，總細胞數的四分之一數乘以IO4即為每毫升濃度；死細胞可著色臺盼藍，活的不著色，計數200個淋巴細胞，計算活細胞百分率[活細胞率％=(活細胞數/總細胞數)X100%]。I.2制備結核肽、HIV肽特異T細胞克隆(1)計數PBMC，調整PBMC數目為IXIO6/孔，分別加入含50ng/ml結核肽Ag85B199_2(l7(KLVANNTRL)的10%FBS-1640培養基2ml；·(2)37。C、5%CO2條件下培養2h后，加入IL-225U/ml；(3)第3天補加IL-2至50U/ml，第5天加入IL-2100U/ml，之后以此濃度繼續培養11天。I.3免疫磁珠(德國美天旎生物公司)分選⑶8+T細胞。I.4總RNA提取試劑盒(OMEGA)提取上述收集到的細胞沉淀的總RNA。I.5逆轉錄(RT)試劑盒(Fermentas)合成cDNA。I.6PCR擴增34個TCRVα基因家族CDR3片段(參照文獻XIN_SHENG等，2006，Clinical&LaboratoryHaematology,28:405-415.doi:10.1111/j.1365-2257.2006.00827.x)利用34條TCRVa家族特異性上游引物和共用下游Ca外、內側引物做半巢式PCR:第一輪PCR:每樣本做34個PCR反應管，第I34管分別加入TCRVaI至Va34家族上游引物，每管加共用下游Ca外側引物Ιμ，各引物濃度均為10μΜ。每PCR反應管體積為25μ1，含cDNA模板I.0μ1，10mmol/LdNTPO.5μ1，IOXBuffer2.5μl,25mmol/LMgCl2L5μ1，TaqDNA聚合酶O.625U。PCR反應條件95°C預變性3min;95°C30s,60。C30s，72。Clmin，35個循環；72。C延伸lOmin。第二輪PCR:反應總體積為25μ1，含第一輪PCR產物2μl，10mmol/LdNTP0.5μI,10XBuffer2·5μI，25mmol/LMgCl2I.5μI,TaqDNA聚合酶O.625U,TCRVα34條家族上游引物1μ1，下游FAM標記內側Ca引物Iμ1，各引物濃度均為10μΜ。PCR反應條件95。C2min；60°C2min，72。C10min，4個循環。I.7PCR擴增24個TCRνβ基因家族CDR3片段(參照文獻XIN_SHENG等，2006，Clinical&LaboratoryHaematology,28:405-415.doi:10.1111/j.1365-2257.2006.00827.x)每樣本做24個PCR反應管，每管加入TCRCβ-FAM下游引物IμI，第I至第24管分別加入TCRνβ至TCRVβ24上游引物Iμ1，各引物濃度均為10μM15PCR反應體積為25μ1，含cDNA模板1μl，10mmol/LdNTP0.5μI,IOXBuffer2.5μl,25mmol/LMgCl2I.5μI,TaqDNA聚合酶O.625U。PCR反應條件94。C變性3min;94。Clmin,55°Clmin，72。Clmin,35個循環；72°C延伸lOmin。1.8瓊脂糖凝膠電泳取34個TCRVa和24個TCRνβ基因家族PCR產物各5μ1，2%瓊脂糖凝膠電泳，110V，20min,采用凝膠成像系統照相。剩余PCR產物-20°C保存備用。I.9CDR3譜型分析取34個Va、24個νβ基因家族FAM熒光標記PCR產物2μ1，在373DNA序列分析儀(ABI,PerkinElmer)上進行6%聚丙烯酰胺凝膠電泳，收集電泳過程中不同時間出現的不同強度的熒光信號，GeneScan672軟件自動分析收集的數據，轉換為不同位置、高度和形態的峰，代表各TCR家族CDR3成員出現的頻率，由此反映各TCR家族的克隆性。其中，具有單峰分布的TCR家族即是抗原特異性單克隆增生的TCR家族。⑶R3譜型分析結果顯示，抗原肽刺激⑶8+T細胞后，部分TCR基因家族譜型發生改變，由原來的8個或多于8個峰型的高斯分布變為少于8個峰的單寡峰分布，表明這些家·族是由于抗原肽持續刺激引起的寡克隆或單克隆增生。比較刺激前后CDR3譜型的變化，找出刺激前為多克隆，結核肽刺激后分別呈單克隆擴增的Va13、Vβ16基因家族(圖I)。測序顯示，結核肽Ag85B199_2Q7(KLVANNTRL)特異的TCRVa13、Vβ16的CDR3區的核苷酸序列如SEQIDNO:I和SEQIDNO:2所示，兩條⑶R3序列編碼的氨基酸序列分別如SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示。2.構建重組逆轉錄病毒載體(構建流程見圖2)2.I合成引物依據GeneBank報道的Va13、Vβ16基因家族V區序列特點，設計全長基因上、下游引物，依據人C區9個關鍵氨基酸突變后的序列(即mCα與mCβ)分別設計上、下游引物，依據Ρ2Α肽連接序列設計引物,全部引物由Invitrogen上海英駿生物技術有限公司合成，引物名稱和序列如下權利要求1.結核肽Ag85B199_2Q7特異性T細胞受體(TCR)，包括α鏈和β鏈，其中，α鏈的CDR3區含有SEQIDNO:3所述的序列；β鏈的⑶R3區含有SEQIDNO:4所示的序列。2.根據權利要求I所述的結核肽Ag85B199_2OT特異性TCR，其特征在于，所述TCR的α鏈是由SEQIDNO:10所示的氨基酸序列經取代、缺失和/或增加一個或多個氨基酸和/或末端修飾后所得到的能特異與外源性β鏈裝配成TCR蛋白分子的氨基酸序列；β鏈是由SEQIDNO:6所示的氨基酸序列經取代、缺失和/或增加一個或多個氨基酸和/或末端修飾后所得到的能特異與外源性α鏈裝配成TCR蛋白分子的氨基酸序列。3.根據權利要求2所述的結核肽Ag85B199_2(l7特異性TCR，其特征在于，所述α鏈的氨基酸序列如SEQIDNO:12所示，β鏈的氨基酸序列如SEQIDNO:8所示。4.編碼權利要求I3任一項所述TCR的基因。5.一種結核肽Ag85B199_207特異性TCR的融合基因，其序列如SEQIDNO:13所示。6.一種重組逆轉錄病毒載體，含有權利要求4或5所述的基因。7.根據權利要求6所述的重組逆轉錄病毒載體，其特征在于，出發載體包括pMX-IRES-GFP、pMCs-IRES-GFP或pMYx-IRES-GFP。8.權利要求6或7所述的重組逆轉錄病毒載體經包裝后得到的逆轉錄病毒。9.權利要求8所述的逆轉錄病毒轉染的CD8+T細胞。10.權利要求I3任一項所述的結核肽Ag85B特異性TCR、權利要求4或5所述的基因、權利要求6或7所述的重組逆轉錄病毒載體、權利要求8所述的逆轉錄病毒、權利要求9所述的逆轉錄病毒轉染的CD8+T細胞在制備抗結核病藥物中的應用。全文摘要本發明公開了一種結核肽Ag85B199–207特異性TCR、其重組逆轉錄病毒載體與應用。本發明成功篩選出結核肽Ag85B199–207(KLVANNTRL)特異的TCR，利用逆轉錄病毒載體將其轉染到CD8+T細胞中，獲得表達結核肽Ag85B199–207特異TCR的CD8+T細胞。該經過TCR基因修飾的CD8+T細胞可成功表達外源性TCR基因，特異性識別結核肽Ag85B199–207并介導IFN-γ、TNF-α細胞因子分泌和細胞毒活性，具有結核病基因治療的應用價值，可為結核病的過繼細胞免疫治療開辟新徑。文檔編號C12N15/62GK102887951SQ201210326569公開日2013年1月23日申請日期2012年9月5日優先權日2012年9月5日發明者馬驪,郝佩佩,溫茜,羅微申請人:南方醫科大學