一種兩階段溶氧控制提高多殺菌素產量的方法
【專利摘要】本發明是一種兩階段溶氧控制提高多殺菌素產量的方法，在刺糖多孢菌發酵液制備階段，當刺糖多孢菌發酵一開始時，通過調節通氣量和攪拌轉速調控氧體積傳質系數kLa，使初始氧體積傳質系數kLa控制在100-130h-1，促進刺糖多孢菌生物量積累；當發酵進入到菌體生長對數生長末期時，再通過調節通氣量和攪拌轉速調控氧體積傳質系數kLa，使初始氧體積傳質系數kLa控制在60-92h-1，促進多殺菌素合成與積累。本發明通過兩階段溶氧控制，多殺菌素發酵產量顯著提高，且縮短了發酵周期。本發明的兩階段溶氧控制發酵方法易于實現，具有重要應用價值。
【專利說明】一種兩階段溶氧控制提高多殺菌素產量的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及發酵工程和生物制藥領域，尤其是溶氧控制技術在發酵過程優化中的應用，具體為一種兩階段溶氧控制提高多殺菌素產量的方法。
【背景技術】
[0002]多殺菌素(spinosad),又名多殺霉素或剌糖菌素，是由土壤放線菌刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)經有氧發酵后產生的胞內次級代謝產物,其主要活性成分是多殺菌素組分A(spinosyn A)組分D(spinosyn D)。多殺菌素是天然生成的抗生素,對鱗翅目及雙翅目等害蟲均有良好的防治效果，多殺菌素對昆蟲存在快速觸殺和攝食毒性，通過刺激昆蟲神經系統，導致非功能性的肌肉收縮、衰竭，并伴隨顫抖和麻痹。與一般殺蟲劑相比，多殺菌素兼具生物農藥的安全性和化學合成農藥的快速性效果，具有低毒、低殘留、對昆蟲天敵安全、自然分解快等諸多優點。在日益重視環保和安全的今天，多殺菌素作為高效無污染的綠色殺蟲劑受到越來越多的關注。
[0003]刺糖多孢菌是一種好氧型革蘭氏陽性放線菌。溶氧是影響多殺菌素發酵的重要因素之一，羅玉雙等將透明顫菌血紅蛋白基因轉入刺糖多孢菌中，以解決高密度深層培養過程中的供氧不足問題，提高了多殺菌素的產量(羅玉雙，中國科學，2012:2:148-157)，證明了溶氧對多殺菌素的生產有著重要的意義。刺糖多孢菌發酵動力學屬于生長部分相關型，即菌體生長一段時間后出現多殺菌素大量合成，多殺菌素產量與菌體量積累呈正相關，發酵過程中若溶氧太低將會使糖代謝緩慢，菌體生長不良，產物合成就會受到影響；而溶氧太高則會使菌體生長過于旺盛，底物完全氧化的比例過高，也不利于多殺菌素的合成。有報道，刺糖多孢菌在發酵過程中需將溶氧控制在50%或50%以上(拉維恩.德韋恩.博克招衡等，中國專利文獻CN1035391C)，雖然給出了溶氧控制的初步結果，但并沒有針對菌體生長和產物合成的需氧量分別進行深入研究。目前，尚未見針對刺糖多孢菌發酵過程中溶氧分階段控制的研究報道。`
【發明內容】
[0004]基于以上問題，本發明的目的是提供一種兩階段溶氧控制提高多殺菌素產量的方法，該方法可以提高多殺菌素產量，縮短發酵周期。
[0005]本發明提供的一種兩階段溶氧控制提高多殺菌素產量的方法，在刺糖多孢菌發酵液制備階段，當刺糖多孢菌發酵一開始時，調控初始氧體積傳質系數k#至100-130/小時OT1)，促進刺糖多孢菌生物量積累；當發酵進入到菌體生長對數生長末期時，再調控初始氧體積傳質系數kp至60-921^，促進多殺菌素合成與積累。
[0006]作為上述技術方案的一個改進，所述調控是指調節通氣量和攪拌轉速。
[0007]作為上述技術方案的另一個改進，在刺糖多孢菌發酵液制備階段之前，該方法還依次包括以下階段:刺糖多孢菌的孢子制備階段；刺糖多孢菌的一級種子液制備階段；以及刺糖多孢菌的二級種子液制備階段。[0008]作為上述技術方案的進一步改進，所述刺糖多孢菌的孢子制備階段具體包括下述過程:將刺糖多孢菌凍干管中的凍干粉轉接進入斜面培養基中，活化后經過NTG(N-甲基-N’ -硝基-N-亞硝基胍)化學誘變、紫外線物理誘變和原生質體融合，得到改良菌株；所述斜面培養基中含有葡萄糖:10.0-15.0 ;酪蛋白:2.0-3.0 ;酵母粉:1.0-2.0 ;瓊脂；
15.0-20.0，單位:克 / 升。
[0009]作為上述技術方案的再進一步改進，所述刺糖多孢菌的一級種子液制備階段具體包括下述過程:將所述刺糖多孢菌的孢子制備階段制得的活化后刺糖多孢菌孢子接入刺糖多孢菌的一級種子培養基中，培養制得刺糖多孢菌一級種子液；所述每升一級種子培養基含有葡萄糖:10.0-15.0 ;酵母粉:2.0-2.5 ;酪蛋白:2.0-2.5 ；K2HPO4:0.2-0.4 ；MgS04:
0.3-0.4，單位:克/升。
[0010]作為上述技術方案的又一更進一步改進，所述刺糖多孢菌的二級種子液制備階段具體包括下述過程:將所述刺糖多孢菌的一級種子液制備階段制得的一級種子液以10% (v/v)接種量接入二級種子培養基中，培養制得刺糖多孢菌的二級種子液；所述每升二級種子液培養基中含有葡萄糖:10.0-15.0 ;酵母粉:2.0-2.5 ;大豆蛋白胨:8.0-10.0 ；K2HPO4:0.2-0.4 ；MgS04:0.3-0.4，單位:克 / 升。
[0011]作為上述技術方案的另一更進一步改進，在所述刺糖多孢菌發酵液制備階段中，在發酵開始前，是將所述刺糖多孢菌的二級種子液制備階段制得的二級種子液以10% (v/v)接種量接入發酵培養基中，進行培養，所述每升發酵培養基中含有葡萄糖:60.0-70.0 ；麥芽糖:10.0-20.0 ;棉籽粉:20.0-25.0 ;大豆蛋白胨:8.0-10.0 ;酵母粉:20.0-25.0 ；CaCO3:1.0-1.5 ；K2HPO4:0.2-0.4 ;豆油:10.0-15.0，單位:克 / 升。
`[0012]本發明方法是根據刺糖多孢菌發酵生產多殺菌素的特性提出的。刺糖多孢菌發酵動力學屬于生長部分相關型，即在刺糖多孢菌菌體的快速生長階段有少量的多殺菌素合成，此階段若溶氧太低將會使糖代謝緩慢，菌體生長不良，從而影響后期的多殺菌素合成；若溶氧太高則會使菌體生長過于旺盛，底物完全氧化的比例過高，也不利于后期的多殺菌素的合成，因而刺糖多孢菌菌體生長階段溶氧條件的控制很重要。而刺糖多孢菌菌體生長進入穩定期后，是多殺菌素大量合成的階段，此階段溶氧的高低也會制約多殺菌素的產量。本發明的一種兩階段溶氧控制提高多殺菌素產量的方法，遵循了刺糖多孢菌菌體生長和多殺菌素合成兩個階段的不同溶氧需求而實施的兩階段溶氧控制的策略，提高了多殺菌素產量，縮短了發酵周期，具有重要的工業應用價值。
【具體實施方式】
[0013]下面結合實例對本發明的【具體實施方式】作進一步說明。在此需要說明的是，對于這些實施方式的說明用于幫助理解本發明，但并不構成對本發明的限定。此外，下面所描述的本發明各個實施方式中所涉及到的技術特征只要彼此之間未構成沖突就可以相互組合。
[0014]大規模生產多殺菌素的過程通常包括下述四個階段:(I)刺糖多孢菌的孢子制備；(2)刺糖多孢菌的一級種子液制備；(3)刺糖多孢菌的二級種子液制備；(4)刺糖多孢菌發酵液制備，本發明是在刺糖多孢菌發酵液制備過程中進行的分階段溶氧控制，具體過程為:
[0015]在刺糖多孢菌發酵一開始，將初始ha控制在lOO-UOtT1 ;在發酵進行到菌體生長對數生長末期(通常為發酵90-100小時內)時，將初始I^a控制在60-921^，以實現兩階段
溶氧控制，使多殺菌素產量達到最大。
[0016]本發明提供的一種兩階段溶氧控制提高多殺菌素產量的方法，其實施可優選如下步驟:
[0017](I)刺糖多孢菌的孢子制備
[0018]將刺糖多孢菌凍干管中的凍干粉轉接進入斜面培養基中，28°C活化10天。所述刺糖多孢菌菌株(Saccharopolyspora spinosa)購自美國典型培養物保藏中心(Americantype culture collection),其保藏號為ATCC 49460,經過NTG化學誘變、紫外線物理誘變和原生質體融合，得到的一株改良菌株，Saccharopolyspora spinosa_RBB207。
[0019]所述斜面培養基(單位:克/升)中含有葡萄糖:10.0-15.0 ;酪蛋白:2.0-3.0 ;酵母粉:1.0-2.0 ;瓊脂；15.0-20.0。
[0020](2)刺糖多孢菌的一級種子液制備
[0021]將(I)制得的活化后刺糖多孢菌孢子接入刺糖多孢菌的一級種子培養基中，在30°C下培養72小時，制得刺糖多孢菌一級種子液。
[0022]所述每升一 級種子培養基(單位:克/升)含有葡萄糖:10.0-15.0;酵母粉:2.0-2.5 ;酪蛋白:2.0-2.5 ；K2HPO4:0.2-0.4 ；MgS04:0.3-0.4。
[0023](3)刺糖多孢菌的二級種子液制備
[0024]將(2)制得的一級種子液以10% (v/v)接種量接入10L發酵罐的二級種子培養基中，在30°C下培養72小時，制得刺糖多孢菌的二級種子液。
[0025]所述每升二級種子液培養基(單位:克/升)中含有葡萄糖:10.0-15.0 ;酵母粉:
2.0-2.5 ;大豆蛋白胨:8.0-10.0 ；K2HPO4:0.2-0.4 ；MgS04:0.3-0.4。
[0026](4)刺糖多孢菌發酵液制備及發酵過程溶氧控制
[0027]將(3)制得的二級種子液以10% (v/v)接種量接入100L發酵罐的發酵培養基中，在30°C下進行培養，并且在發酵一開始，通過調節通氣量和攪拌轉速調控，將初始k#控制在lOO-UOtT1 ;在發酵進行到菌體生長對數生長末期(通常為發酵90-100小時內)時，通過調節通氣量和攪拌轉速，將初始kp控制在60-921^，以實現兩階段溶氧控制，使多殺菌素產量達到最大，制得刺糖多孢菌發酵液。
[0028]所述每升發酵培養基(單位:克/升)中含有葡萄糖:60.0-70.0 ;麥芽糖:
10.0-20.0 ;棉籽粉:20.0-25.0 ;大豆蛋白胨:8.0-10.0 ;酵母粉:20.0-25.0 ；CaCO3:
1.0-1.5 ；K2HPO4:0.2-0.4 ;豆油:10.0-15.0。本發明中k#值采用排氣法測定。
[0029]對于100L發酵罐，在發酵一開始時，通常是將通氣量調節為0.3-0.7vvm,攪拌轉速調節為100-200rpm，在發酵進行到菌體生長對數生長末期，通常是將通氣量調節為
0.3-0.5vvm，攪拌轉速調節為 100-150rpm。
[0030]實施例1
[0031]本發明提供的一種兩階段溶氧控制提高多殺菌素產量的方法，其具體步驟如下:
[0032]1.刺糖多孢菌的孢子制備
[0033]將刺糖多孢菌凍干管中的凍干粉轉接進入斜面培養基中，28°C活化10天，制得刺糖多孢菌孢子。
[0034]所述每升斜面培養基(單位:克/升)中含有葡萄糖:10.0 ;酪蛋白:2.0 ;酵母粉:1.0 ;瓊脂；15.0。
[0035]2.刺糖多孢菌的一級種子液制備
[0036]將步驟I中制得刺糖多孢菌孢子接入刺糖多孢菌一級種子培養基中，在30°C下培養72小時，制得刺糖多孢菌一級種子液。
[0037]所述每升一級種子培養基(單位:克/升)含有葡萄糖:10.0 ;酵母粉:2.0 ;酪蛋白:2.0 ；K2HPO4:0.2 ；MgSO4:0.3。
[0038]3.刺糖多孢菌的二級種子液制備
[0039]將步驟2中制得的一級種子液以10% (v/v)接種量接入IOL發酵罐的二級種子培養基中，在30°C下培養72小時，制得刺糖多孢菌二級種子液。
[0040]所述每升二級種子培養基(單位:克/升)中含有葡萄糖:10.0 ;酵母粉:2.0 ;大豆蛋白胨:8.0 ；K2HPO4:0.2 ；MgS04:0.3。
[0041]4.刺糖多孢菌發酵液的制備及發酵過程溶氧控制
[0042]將步驟3中制得的二級種子液以10% (v/v)接種量接入裝液量為70% (V/V)的100L發酵罐的發酵培養基中，在30°C下培養至達到最大多殺菌素產量，制得刺糖多孢菌發酵液。
[0043]所述每升發酵培養基(單位:克/升)中含有葡萄糖:60.0 ;麥芽糖:10.0 ;棉籽粉:20.0 ;大豆蛋白胨:8.0 ;酵母粉:20.0 ；CaCO3:1.0 ；K2HPO4:0.2 ;豆油:10.0。
[0044]發酵過程的溶氧控制條件:在發酵初始將通氣量控制在0.5vvm、轉速控制在150rpm,使得初始I^a達到100.3h-1 ;發酵100小時菌體生長進入對數生長末期，從100小時開始至發酵結束將通氣量控制在0.3vvm、轉速控制在150rpm，使得100小時的初始k#達到91.4h-1。此兩階段溶氧控制使得多殺菌素產量在218小時達到60.9mg/L,生物量干重(DCff)達到 18.7g/L。
[0045]實施例2
[0046]斜面培養基、一級種子培養基、二級種子培養基、發酵培養基的組成及接種量與實施例I相同。
[0047]發酵過程的控制條件:在發酵一開始將通氣量控制在0.5vvm、轉速控制在200rpm,使得初始k#達到115.5h-1 ;發酵96小時菌體生長進入對數生長末期，從96小時開始至發酵結束將通氣量控制在0.3vvm、轉速控制在150rpm,使得96小時的初始k^a達到91.4h-1，此兩階段溶氧控制使得多殺菌素產量在196小時達到160.9mg/L，DCW達到24.1g/L0
[0048]實施例3
[0049]斜面培養基、一級種子培養基、二級種子培養基、發酵培養基的組成及接種量與實施例I相同。
[0050]發酵過程的控制條件:在發酵一開始將通氣量控制在0.7vvm、轉速控制在150rpm,使得初始I^a達到110.1tT1 ;發酵98小時菌體生長進入對數生長末期，從98小時開始至發酵結束將通氣量控制在0.3vvm、轉速控制在150rpm,使得98小時的初始k#達到91.4h-1，此兩階段溶氧控制使得多殺菌素產量在215小時達到70.lmg/L, DCW達到21.9g/L0
[0051]實施例4[0052]斜面培養基、一級種子培養基、二級種子培養基、發酵培養基的組成及接種量與實施例I相同。
[0053]發酵過程的控制條件:在發酵一開始將通氣量控制在0.3vvm、轉速控制在180rpm,使得初始Ka達到ΙΟδΙ1 ;發酵99小時菌體生長進入對數生長末期，從99小時開始至發酵結束將通氣量控制在0.3vvm、轉速控制在150rpm,使得99小時的初始k^a達到91.411，此兩階段溶氧控制使得多殺菌素產量在217小時達到79.7mg/L, DCW達到21.5g/L0
[0054]實施例5
[0055]斜面培養基、一級種子培養基、二級種子培養基、發酵培養基的組成及接種量與實施例I相同。
[0056]發酵過程的控制條件:在發酵一開始將通氣量控制在0.7vvm>轉速控制在200rpm,使得初始I^a達到129.811 ;發酵90小時菌體生長進入對數生長末期，從90小時開始至發酵結束將通氣量控制在0.3vvm、轉速控制在150rpm,使得90小時的初始k#達到91.411，此兩階段溶氧控制使得多殺菌素產量在194小時達到90.3mg/L, DCW達到25.1g/L0
[0057]實施例6
[0058]斜面培養基、一級種子培養基、二級種子培養基、發酵培養基的組成及接種量與實施例2相同。
[0059]發酵過程的控制條件:在發酵一開始將通氣量控制在0.5vvm>轉速控制在200rpm,使得初始k#達到115.511 ;發酵96小時菌體生長進入對數生長末期，從96小時開始至發酵結束將通氣量控制在0.3vvm、轉速控制IOOrpm,使得96小時的初始k^a達到60.611，此兩階段溶氧控制使得多殺菌素產量在201小時達到110.6mg/L，DCW達到22.2g/L0
[0060]實施例7
[0061]斜面培養基、一級種子培養基、二級種子培養基、發酵培養基的組成及接種量與實施例3相同。
[0062]發酵過程的控制條件:在發酵一開始將通氣量控制在0.5vvm、轉速控制在200rpm,使得初始k#達到115.511 ;發酵96小時菌體生長進入對數生長末期，從96小時開始至發酵結束將通氣量控制在0.5vvm、轉速控制在130rpm,使得96小時的初始k^a達到7111，此兩階段溶氧控制使得多殺菌素產量在199小時達到150.lmg/L，DCW達到24.4g/L。
[0063]實施例8
[0064]斜面培養基、一級種子培養基、二級種子培養基、發酵培養基的組成及接種量與實施例3相同。
[0065]發酵過程的控制條件:在發酵一開始將通氣量控制在0.5vvm>轉速控制在200rpm,使得初始k#達到115.511 ;發酵96小時菌體生長進入對數生長末期，從96小時開始至發酵結束將通氣量控制在0.4vvm、轉速控制在130rpm,使得96小時的初始k^a達到661Λ此兩階段溶氧控制使得多殺菌素產量在200小時達到145.7mg/L，DCW達到23.9g/L。
[0066]實施例9-14
[0067]表一中列出了實施例9-14的分階段控制條件，產量及發酵時間和培養基成分，旨在指出與其它實施例中不同條件及所得的結果。
[0068]表一
[0069]
【權利要求】
1.一種兩階段溶氧控制提高多殺菌素產量的方法，在刺糖多孢菌發酵液制備階段，當刺糖多孢菌發酵一開始時，調控初始氧體積傳質系數ha至100 /小時-130 /小時，促進刺糖多孢菌生物量積累；當發酵進入到菌體生長對數生長末期時，再調控初始氧體積傳質系數kp至60 /小時-92 /小時，促進多殺菌素合成與積累。
2.根據權利要求1所述的兩階段溶氧控制提高多殺菌素產量的方法，其特征在于，所述調控是指調節通氣量和攪拌轉速。
3.根據權利要求1所述的兩階段溶氧控制提高多殺菌素產量的方法，其特征在于，在刺糖多孢菌發酵液制備階段之前，該方法還依次包括以下階段:刺糖多孢菌的孢子制備階段；刺糖多孢菌的一級種子液制備階段；以及刺糖多孢菌的二級種子液制備階段。
4.根據權利要求1、2或3所述的兩階段溶氧控制提高多殺菌素產量的方法，其特征在于，所述刺糖多孢菌的孢子制備階段具體包括下述過程: 將刺糖多孢菌凍干管中的凍干粉轉接進入斜面培養基中，活化后經過N-甲基-N’ -硝基-N-亞硝基胍化學誘變、紫外線物理誘變和原生質體融合，得到改良菌株； 所述斜面培養基中含有葡萄糖:10.0-15.0 ;酪蛋白:2.0-3.0 ;酵母粉:1.0-2.0 ;瓊脂；15.0-20.0，單位均為克/升。
5.根據權利要求1、2或3所述的兩階段溶氧控制提高多殺菌素產量的方法，其特征在于，所述刺糖多孢菌的一級種子液制備階段具體包括下述過程: 將所述刺糖多孢菌的孢子制備階段制得的活化后刺糖多孢菌孢子接入刺糖多孢菌的一級種子培養基中，培養制得刺糖多孢菌一級種子液； 所述每升一級種子培養基含有葡萄糖:10.0-15.0 ;酵母粉:2.0-2.5;酪蛋白:.2.0-2.5 ；K2HP04:0.2-0.4 ；MgS04:0.3-0.4，單位均為克 / 升。
6.根據權利要求1、2或3所述的兩階段溶氧控制提高多殺菌素產量的方法，其特征在于，所述刺糖多孢菌的二級種子液制備階段具體包括下述過程: 將所述刺糖多孢菌的一級種子液制備階段制得的一級種子液以10% (v/v)接種量接入二級種子培養基中，培養制得刺糖多孢菌的二級種子液； 所述每升二級種子液培養基中含有葡萄糖:10.0-15.0 ;酵母粉:2.0-2.5 ;大豆蛋白胨:8.0-10.0 ；K2HPO4:0.2-0.4 ；MgS04:0.3-0.4，單位均為克 / 升。
7.根據權利要求1、2或3中任一所述的兩階段溶氧控制提高多殺菌素產量的方法，其特征在于，在所述刺糖多孢菌發酵液制備階段中，在發酵開始前，是將所述刺糖多孢菌的二級種子液制備階段制得的二級種子液以10% (v/v)接種量接入發酵培養基中，進行培養，所述每升發酵培養基中含有葡萄糖:60.0-70.0 ;麥芽糖:10.0-20.0 ;棉籽粉:20.0-25.0 ；大豆蛋白胨:8.0-10.0 ;酵母粉:20.0-25.0 ；CaCO3:1.0-1.5 ；K2HPO4:0.2-0.4 ;豆油:.10.0-15.0，單位均為克/升。
8.根據權利要求5中所述的兩階段溶氧控制提高多殺菌素產量的方法，其特征在于，在所述刺糖多孢菌發酵液制備階段中，在發酵開始前，是將所述刺糖多孢菌的二級種子液制備階段制得的二級種子液以10% (v/v)接種量接入發酵罐的發酵培養基中，進行培養，所述每升發酵培養基中含有葡萄糖:60.0-70.0 ;麥芽糖:10.0-20.0 ;棉籽粉:20.0-25.0 ；大豆蛋白胨:8.0-10.0 ;酵母粉:20.0-25.0 ；CaCO3:1.0-1.5 ；K2HPO4:0.2-0.4 ;豆油:.10.0-15.0，單位均為克/升。
9.根據權利要求1、2或3所述的兩階段溶氧控制提高多殺菌素產量的方法，其特征在于，所述刺糖多孢菌菌株(Saccharopolyspora spinosa)購自美國典型培養物保藏中心(American type culture collection),其保藏號為 ATCC 49460,經過 NTG 化學誘變、紫外線物理誘變和原生質體融合，得到的一株改良菌株，Saccharopolyspora spinosa_RBB207。
10.根據權利要求1、2或3中任一所述的所述的兩階段溶氧控制提高多殺菌素產量的方法，其特征在于，所述初始 氧體積傳質系數kLa值采用排氣法測定。
【文檔編號】C12R1/01GK103667404SQ201210336241
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2012年9月12日 優先權日:2012年9月12日
【發明者】余龍江, 白云, 周蓬蓬 申請人:華中科技大學