專利名稱：一種獲取循環腫瘤單細胞的方法
技術領域：
本發明涉及循環腫瘤細胞檢測領域。
背景技術：
美國腫瘤協會于2006年發表的年度報告指出，目前全世界范圍內每3人中就有I 人在其一生中會患有某種腫瘤，而且在發展中國家，隨著污染程度的增加，患病幾率還會高于1/3的比例。
目前全世界用于腫瘤診斷的方法可歸為三大類病理學(活檢切片)；影像學(超聲、X光、CT或PET等)和血清學(血清腫瘤相關蛋白，如CA-125、CA-199或CEA等)，但所有這些方法都有不可避免的缺點，例如靈敏性及特異性差和過于依賴醫生的主觀判斷等。因此目前臨床急需一種能夠為醫生及病人提供準確，快速的腫瘤檢測手段。經過長時間的大量研究，美國FDA認證的人外周血循環腫瘤細胞(Circulating Tumor Cell,簡稱CTC)檢測目前已被公認為最好及最客觀的檢測手段之一。目前已有越來越多的國內外醫生開始應用此技術作為腫瘤檢查的重要輔助手段。不僅于此，CTC檢測也被公認為是目前國外新近流行的腫瘤治療方法一即阻斷腫瘤細胞入血轉移的唯一有效檢測指標。除了上述CTC可作為腫瘤檢測手段外，CTC還被證明可成功應用于以下一系列其它方面的用途(I)體內化療藥物藥效的快速評估相對于每12周一查的CT診斷，CTC在第2周即可顯示藥效結果，這一點對臨床醫生及挽救病人生命尤為重要；(2)根據CTC數目，判斷病人愈后狀況及存活時間 美國Immunicon/Veridex (Johnson & Johnson)公司經過在數百腫瘤病人標本上的嚴格驗證，已可根據治療前后的CTC數目變化準確地預測乳腺癌、結直腸癌及前列腺癌病人的存活時間，這一點已被美國FDA認證接受，開始在美國眾多醫院中被廣泛應用；(3)腫瘤病人復發的監測與及時診斷絕大多數的腫瘤復發從根本上講實際就是腫瘤轉移過程，因而通過對治療后的病人CTC的持續檢測，可以達到監測病人腫瘤復發的目的；(4)個體化治療的體外腫瘤治療藥物篩選；及(5)正常人群體檢普查以利于盡可能的腫瘤早期診斷等。除了應用于臨床外，CTC亦可應用于眾多藥廠和科研機構的基礎研究，包括尋找新的腫瘤標記物以及開發新的抗腫瘤藥物等。
目前美國FDA已于2004年認證了美國上市公司Immunicon/Veridex的CTC檢測技術及其臨床應用，該技術目前已應用于美國多家醫院的循環腫瘤細胞檢測。
但是，Immunicon/Veridex的檢測技術存在顯而易見的缺陷。該技術分離檢測腫瘤細胞主要是基于腫瘤細胞表面的一種特定標志物。但眾所周知，此腫瘤細胞表面標志物隨著腫瘤細胞病理性生長及腫瘤細胞的入血而異常表達。而且，此特定標志物在細胞表面的表達量也因腫瘤不同而差異極大，包括高表達與不表達。所有這些使得該技術在很多情況下捕獲不到腫瘤細胞，從而限制了該技術的廣泛普及與應用。發明內容
本發明提供一種便于進行循環腫瘤細胞檢測和研究的獲取循環腫瘤單細胞的方法。
本發明提供一種獲取循環腫瘤單細胞的方法，包括如下步驟
a)富集體液樣本中的循環腫瘤細胞；
b)識別出所述循環腫瘤細胞；
c)分離出單個循環腫瘤細胞。
通過去除體液樣本中的非循環腫瘤細胞物質，來提高循環腫瘤細胞的濃度，起到富集循環腫瘤細胞的作用。在富集后的體液樣本中，識別篩選出循環腫瘤細胞；將識別篩選出的循環腫瘤細胞一個個分離出來，便于后續的檢測和研究。
體液一般指細胞外液。
進一步的，所述步驟a)中，通過去除所述體液樣本中的白細胞和紅細胞來富集所述循環腫瘤細胞。
進一步的，所述步驟a)中，通過離心技術去除所述體液樣本中的紅細胞，通過抗體磁珠標記技術去除所述體液樣本中的白細胞。
進一步的，所述步驟b)中，利用免疫熒光染色法，用上皮細胞特異性標志識別出所述循環腫瘤細胞。
進一步的，所述步驟b)中，利用微流控芯片，通過比較腫瘤細胞和正常細胞的粒徑大小來識別出所述循環腫瘤細胞。
進一步的，所述步驟b)中，利用腫瘤細胞表面標志和熒光原位雜交法識別出所述循環腫瘤細胞。
進一步的，所述步驟c)中，利用微吸管分離出單個循環腫瘤細胞。
本發明的有益效果是通過將體液樣本中的循環腫瘤細胞一個個單獨分離出來, 從而便于后續的檢測和科學研究。
具體實施方式
下面通過具體實施方式
對本發明作進一步詳細說明。
一種獲取循環腫瘤單細胞的方法，首先，利用差減法在體液樣本中富集循環腫瘤細胞(CTC);接著，識別出循環腫瘤細胞；最后，分離出單個循環腫瘤細胞。
在一種實施方式中，該方法包括如下步驟a)利用現有離心技術去掉腫瘤患者體液樣本中的紅細胞，利用現有抗體磁珠標記技術移除白細胞，從而在該體液樣本中富集循環腫瘤細胞；b)通過免疫熒光染色法，用上皮細胞特異性標志識別出循環腫瘤細胞；c)采用微吸管，在熒光顯微鏡下操作，吸出單個循環腫瘤細胞。分離出的單個循環腫瘤細胞即可用于腫瘤分析檢測或其他科學研究。
本實施方式中，抗體磁珠標記技術即利用熒光標記抗體包被的磁珠與白細胞偶聯，來去除體液樣本中的白細胞。由于白細胞含有單核細胞、粒細胞、巨噬細胞和淋巴細胞等，可以利用不同的抗體組合來去除白細胞。
本實施方式中，微吸管的直徑一般為微米級。吸出操作時，可以采用人工用嘴輕吸的方式。由于采用微吸管，可以有效的控制吸力，使吸力不會過大。
在另一種實施方式中，該方法包括如下步驟a)利用離心技術去除腫瘤患者體液樣本中的紅細胞，利用抗體磁珠標記技術去除體液樣本中的白細胞，從而在該體液樣本中富集循環腫瘤細胞山)采用微流控芯片，通過比較腫瘤細胞和正常細胞的粒徑大小來識別出循環腫瘤細胞；c)分離出單個循環腫瘤細胞。
本實施方式中，正常細胞具有粒徑范圍，通過比較腫瘤細胞的粒徑和該粒徑范圍， 如該粒徑在該粒徑范圍之外,則是腫瘤細胞。
在又一種實施方式中，該方法包括如下步驟a)在體液樣本中富集循環腫瘤細胞山)利用現有腫瘤細胞表面標志和熒光原位雜交法識別出泌尿系統腫瘤細胞；c)采用微吸管，在熒光顯微鏡下操作，吸出單個循環腫瘤細胞。分離出的單個循環腫瘤細胞即可用于腫瘤分析檢測或其他科學研究。
本實施方式中，識別泌尿系統腫瘤細胞時,泌尿系統腫瘤細胞表面標志如膀胱癌的OCT、FGFR3或Ras基因、如腎癌的VHL基因等。具體識別時，可以使用膀胱癌特異性表面標志識別膀胱癌細胞，如以0CT4、FGFR3或Ras等多基因作為多個靶點進行識別，即能夠利用兩個或兩個以上的特異性表面標志進行識別鑒定。
以上內容是結合具體的實施方式對本發明所作的進一步詳細說明，不能認定本發明的具體實施只局限于這些說明。對于本發明所屬技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明構思的前提下，還可以做出若干簡單推演或替換。
權利要求
1.一種獲取循環腫瘤單細胞的方法，其特征在于，包括如下步驟 a)富集體液樣本中的循環腫瘤細胞； b)識別出所述循環腫瘤細胞； c)分離出單個循環腫瘤細胞。
2.如權利要求1所述的一種獲取循環腫瘤單細胞的方法，其特征在于，所述步驟a)中，通過去除所述體液樣本中的白細胞和紅細胞來富集所述循環腫瘤細胞。
3.如權利要求2所述的一種獲取循環腫瘤單細胞的方法，其特征在于，所述步驟a)中，通過離心技術去除所述體液樣本中的紅細胞,通過抗體磁珠標記技術去除所述體液樣本中的白細胞。
4.如權利要求2所述的一種獲取循環腫瘤單細胞的方法，其特征在于，所述步驟b)中，利用免疫熒光染色法，用上皮細胞特異性標志識別出所述循環腫瘤細胞。
5.如權利要求2所述的一種獲取循環腫瘤單細胞的方法，其特征在于，所述步驟b)中，利用微流控芯片，通過比較腫瘤細胞和正常細胞的粒徑大小來識別出所述循環腫瘤細胞。
6.如權利要求2所述的一種獲取循環腫瘤單細胞的方法，其特征在于，所述步驟b)中，利用腫瘤細胞表面標志和熒光原位雜交法識別出所述循環腫瘤細胞。
7.如權利要求1-6中任意一項所述的獲取循環腫瘤單細胞的方法，其特征在于，所述步驟c)中，利用微吸管分離出單個循環腫瘤細胞。
全文摘要
本發明公開了一種獲取循環腫瘤單細胞的方法，包括如下步驟a)富集體液樣本中的循環腫瘤細胞；b)識別出所述循環腫瘤細胞；c)分離出單個循環腫瘤細胞。通過將體液樣本中的循環腫瘤細胞一個個單獨分離出來，從而便于后續的檢測和科學研究。
文檔編號C12N5/09GK103031276SQ20121034423
公開日2013年4月10日 申請日期2012年9月17日 優先權日2012年9月17日
發明者孫小娟, 吳松, 蔡志明 申請人:孫小娟, 吳松, 蔡志明