專利名稱：骨骼肌特異性表達pepck-c以改變小鼠運動能力和代謝功能的轉基因載體的制作方法
技術領域：
本發明屬于基因工程技術領域，具體涉及一種骨骼肌特異性表達PEPCK-C以改變小鼠運動能力和代謝功能的轉基因載體。
背景技術：
憐酸烯醇式丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvatecarboxykinase, PEPCK)是催化糖異生(gluconeogenesis)反應的一個限速酶，即由草酰乙酸和GTP轉變為磷酸烯醇式丙酮酸、⑶P及C02的反應。目前已知有兩種PEPCK同工酶，分別是PEPCK-M (mitochondrialform)和PEPCK-C(cytosolic form)，PEPCK-C (也叫PCKl)在糖異生中有重要作用，對其研究也更多。目前PEPCK-C已成為肝臟糖異生的一明確的標記物，肝臟中此基因的轉錄水 平成為臨床上2型糖尿病評價的重要指標，即如果PEPCK-C的mRNA表達增加，糖異生的速率就一定會增加。PEPCK-C基因編碼了一個63kDa的蛋白酶，主要在肝臟和腎皮質中表達，并催化糖異生反應；在肝臟以及白色和棕色脂肪組織中，PEPCK-C還參與甘油異生反應(glyceroneogenesis);此外，PEPCK-C在流失反應(cataplerosis)中起作用，以去除朽1檬酸循環中的陰離子；PEPCK-C酶同時還廣泛存在于哺乳動物的組織內，包括小腸、結腸、乳腺、腎上腺、肺和肌肉。但是其在這些組織中的代謝作用仍未明確。PEPCK-C在不同組織中的活性是在轉錄水平上調控的。例如，在肝臟中特異表達 PEPCK-C基因只需要從_460bp到+69bp的啟動子序列，營養物質和荷爾蒙可調控PEPCK-C基因的轉錄水平，cAMP、糖皮質激素和胰島素都能調節PEPCK-C基因的轉錄，并已確定了它們在PEPCK-C啟動子上的相對應的調控序列。由于PEPCK-C在不同組織中的主要功能不同，所以不同的組織特異性的基因敲除或過表達引起多種不同的表型。正常情況下，PEPCK-C在骨骼肌中不表達或表達量很低。PEPCK-C用6個ATP的能量來催化丙酮酸轉變為一個葡萄糖，而在骨骼肌中的無氧酵解每分解一個葡萄糖，卻只能生成2個ATP。我們預期在骨骼肌中過度表達PEPCK-C，血液中的甘油三酯和游離脂肪酸可能都會向骨骼肌運輸，提供更多的能量，并可能影響機體的代謝水平。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種能在骨骼肌中特異性表達PEPCK-C以改變小鼠運動能力和代謝功能的轉基因載體。為解決上述技術問題，本發明采用的技術方案如下—種能在骨骼肌中特異性表達PEPCK-C的轉基因片段包含小鼠的α -骨骼肌肌動蛋白(a-skeletal actin)基因的啟動子、小鼠PEPCK-C的cDNA和牛生長激素基因(bGH)的3’端不翻譯區域，且帶有哺乳動物細胞中篩選用的抗性基因一嘌呤霉素(Puromycin)基因和原核細胞中篩選用的抗性基因一氨芐青霉素(ampicillin)基因(見圖2)。3. 3kb的小鼠α -骨骼肌肌動蛋白(a -skeletal actin)啟動子可保證下游的基因在骨骼肌中特異性表達。本發明構建的骨骼肌特異表達鼠PEPCK-C的轉基因載體的全序列如SEQ ID No:I所示，其中228-3525堿基為α -骨骼肌肌動蛋白(a-skeletal actin)基因的啟動子區，第3604-5472堿基為鼠PEPCK-C編碼區，第6386-6610堿基為bGH 3’端不翻譯區，第6693-7292堿基為嘌呤霉素(Puromycin)抗性基因，第9337-10336堿基為氨芐青霉素(Ampicillin)抗性基因。本發明的轉基因載體可用于體細胞克隆，以構建能夠改變小鼠運動能力和代謝功能的PEPCK-C轉基因小鼠。
圖I是本發明的技術流程圖。圖2是本發明構建的PST229轉基因載體的示意圖。
具體實施例方式根據下述實施例，可以更好地理解本發明。然而，本領域的技術人員容易理解，實施例所描述的內容僅用于說明本發明，而不應當也不會限制權利要求書中所詳細描述的本發明。實施例I :插入小鼠PEPCK-C編碼區域DNA片段，構建pst228。將本實驗室的載體pst215用BsaBI和AscI雙酶切，酶切體系為2 μ g質粒DNA，
3μ 110Xbuffer, I. 5 μ IBsaBI 酶，I. 5 μ IAscI 酶，加入 ddH20 補足體積至 30 μ 1，37。C 溫浴3小時。然后將酶切體系在1%的瓊脂糖凝膠中通過電泳分離，切出6. 3kb大小的DNA條帶，用膠回收純化試劑盒純化DNA。具體步驟為，將紫外光下切下目的DNA條帶裝入1.5ml離心管中，稱重后加入3倍體積的溶膠液，55°C保溫10分鐘，使瓊脂糖凝膠完全融化；融化的凝膠待溫度降至室溫后，將混合液轉入附柱中，10，OOOg離心I分鐘，倒掉流出液；加入650 μ I漂洗緩沖液，10，OOOg離心I分鐘，倒掉流出液；吸附柱再次離心，10，OOOg離心，I分鐘，倒掉流出液；將吸附柱轉移到一個新的I. 5ml離心管中，加入50 μ IddH2O，放置I分鐘，10，OOOg離心I分鐘收集純化產物。通過全基因合成(Invitrogen)得到小鼠PEPCK-C編碼區域DNA片段，用BsaBI和AscI 雙酶切，酶切體系為 3 μ g質粒 DNA，3 μ 110 X buffer, I. 5μ IBsaBI 酶，I. 5μ IAscI 酶，加入ddH20補足體積至30 μ 1，37° C溫浴3小時。然后將酶切體系在1%的瓊脂糖凝膠中通過電泳分離，切出I. 9kb大小的DNA條帶，用膠回收純化試劑盒純化DNA。。將pst215(BsaBI/AscI)和小鼠 PEPCK-C 編碼區域 DNA 片段(BsaBI/AscI)連接，連接反應中加入2μ I載體，6 μ I插入片段，1μ 1T4DNA連接酶，16° C溫浴16小時。將連接產物轉化到Ε. coli的感受態細胞中。取一管50 μ I的Trans5 α受態細胞置于冰上，待其融化后，向其中加入4μ I上述連接產物，輕彈混勻，后于冰上孵育30分鐘；42°C熱擊30秒，后冰上靜置10分鐘；加入500 μ I無抗性的LB液體培養基，37°C震蕩培養I小時；4，000rpm離心5分鐘，吸走，保留100 μ I左右的培養基，用移液器將細菌沉淀吹打均勻后涂布在含氨芐青霉素抗性的LB培養基平板上。然后將平板置于37°C溫箱培養16小時。
克隆生長出來后，挑單克隆菌落至3ml含氨芐青霉素的LB培養液中，37°C震蕩培養12小時，提取質粒DNA，用EcoRI酶切鑒定，陽性克隆中可得到4. Okb,2. 7kb、l. 9kb、
0.5kb的四條DNA條帶。再通過測序進一步確定陽性克隆的正確性，得到的克隆即為pst228。實施例2 :插入小鼠α-骨骼肌肌動蛋白基因的啟動子DNA片段，構建pst229。將pst228 用 Nrul 和 BsaBI 雙酶切，酶切體系為 2μ g 質粒 DNA，3y 110Xbuffer,
1.5 μ INrul SI, I. 5 μ IBsaBI酶，加入ddH20補足體積至30 μ 1，37° C溫浴3小時。然后將酶切體系在1%的瓊脂糖凝膠中通過電泳分離，切出7. Okb大小的DNA條帶，用膠回收純化試劑盒純化DNA。具體步驟同上。通過PCR擴增得到3. 3kb的小鼠α -骨骼肌肌動蛋白基因的啟動子DNA片段，PCR條件如下1 μ I (約 IOOng)鼠基因組 DNA，引物 I (TCG CGA ACG CGT GCCTTCCCTGTC)和引·物 2 (GAT CAC GAT CTA GTT TCT GCA AAG ACA AG)的終濃度均為 O. 5 μ Μ, dNTPs 的終濃度為 0·2πιΜ，5μ 110Xbuffer, I μ IHiFi Taq 酶，加入 ddH20 補足體積至 50 μ I. PCR 循環為，95° C，2分鐘；接著是95° C，30秒，55° C，60秒，72° C，3分鐘，35個循環；72° C，5分鐘；4° C，保溫。將PCR產物在1%的瓊脂糖凝膠中通過電泳分離，切出3. 3kb大小的DNA條帶，用膠回收純化試劑盒純化DNA。具體步驟同上。將PCR擴增得到的3. 3kb的小鼠α -骨骼肌肌動蛋白基因的啟動子DNA片段通過TA克隆連接到pEASY-T3載體(全式金公司)上。lμlpEASY-T3，加入4μl3. 3kb的鼠α-骨骼肌肌動蛋白基因的啟動子DNA片段，25° C，30分鐘。然后將連接反應轉化到E. coli感受態細胞中，把轉化后的細胞涂布到含有IPTG和X-Gal以及氨芐青霉素的LB平板上生長。克隆生長出來后，挑白色的單克隆菌落至3ml含氨芐青霉素的LB培養液中，37°C震蕩培養12小時，提取質粒DNA，用EcoRI酶切鑒定，陽性克隆中可得到3. Okb和3. 3kb的兩條DNA條帶。再通過測序進一步確定陽性克隆的正確性，得到的克隆即為PPEK。從pPEK用Nrul和BsaBI雙酶切以切出小鼠α -骨骼肌肌動蛋白基因的啟動子DNA,酶切體系為 3 μ gpPEK3DNA，3 μ 110 X buffer, I. 5 μ INrul 酶，I. 5 μ IBsaBI 酶，加入ddH20補足體積至30 μ 1，37° C溫浴3小時。然后將酶切體系在1%的瓊脂糖凝膠中通過電泳分離，切出3. 3kb大小的DNA條帶，用膠回收純化試劑盒純化DNA。具體步驟同上。將pst228 (Nrul/BsaBI)和小鼠α -骨骼肌肌動蛋白基因的啟動子DNA (NruI/BsaBI)連接，連接反應同上。將連接產物轉化到Ε. coli的感受態細胞中。具體步驟同上。克隆生長出來后，挑單克隆菌落至3ml含氨芐青霉素的LB培養液中，37 °C震蕩培養12小時，提取質粒DNA，用EcoRI酶切鑒定，陽性克隆中可得到6. lkb,2. lkb、L4kb和0.8kb的四條DNA條帶。再通過測序進一步確定陽性克隆的正確性，得到的克隆即為pst229,即本發明描述的轉基因載體。實施例3 :利用原核注射的方法構建轉基因小鼠并進行鑒定。將構建好的pst229轉基因載體直接注入受精卵，使外源基因整合到DNA中，然后將受精卵植入4-5周齡的代孕母鼠體內。PEPCK-Cmus轉基因小鼠繁殖成功后，進行運動及代謝方面的相關研究，研究發現，與同齡的野生型小鼠比較，PEPCK-Cmus轉基因小鼠運動能力更強(小鼠運動平板測試158. 25±54. 59vs. 2366±687. 77，單位m，P〈0. 01)，胰島素敏感性更高(胰島素耐量試驗血糖-時間曲線下面積16. 27 ± I. 16vs. 15. 19 ±O. 90,單位mmol/L,Ρ〈0· 05)，血脂水平較低(I. 64±0· 20vs. 5. 19±2· 02，單位nmol/L, Ρ〈0· 01)，空腹血糖(7. 73±0· 35vs. 6. 48±0· 78，單位mmol/L)、體重(25. 95±0· 07vs. 28. 25±0· 35，單位g)、腹部脂肪比例沒有差異(16. 14±1.92vs. 17. 52±1.20，單位:%)，但通過組織切片H&E染色和油紅染色結果發現骨骼肌中有明顯脂肪堆積。結果說明PEPCK-C基因在小鼠骨骼肌中特異性表達，提高了小鼠的運動耐力和胰島素敏感性并使血脂維持在較低水平，進一步說明PEPCK-C基因在骨骼肌中表達對機 體的能量代謝有重要作用。
權利要求
1.骨骼肌特異性表達PEPCK-C以改變小鼠運動能力和代謝功能的轉基因載體，其特征在于，所述轉基因載體含有小鼠的3. 3kb α -骨骼肌肌動蛋白基因的啟動子、小鼠PEPCK-C的cDNA和牛生長激素基因的3’端不翻譯區域，且帶有哺乳動物細胞中篩選用的抗性基因一嘌呤霉素基因和原核細胞中篩選用的抗性基因一氨芐青霉素基因。
2.根據權利要求I所述的骨骼肌特異性表達PEPCK-C以改變小鼠運動能力和代謝功能的轉基因載體，其堿基全序列如SEQ ID No. I所示。
全文摘要
本發明公開了一種肌肉組織特異性表達磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvate carboxykinase,PEPCK)以改變小鼠運動能力和代謝功能的轉基因載體，所述轉基因載體含有小鼠的3.3kbα-骨骼肌肌動蛋白(α-skeletal actin)基因的啟動子、小鼠PEPCK-C的cDNA和牛生長激素基因(bGH)的3’端不翻譯區，且帶有哺乳動物細胞中篩選用的抗性基因—嘌呤霉素(Puromycin)基因和原核細胞中篩選用的抗性基因—氨芐青霉素(Ampicillin)基因。本發明的轉基因載體可用于體細胞克隆，以構建PEPCK-Cmus轉基因小鼠。
文檔編號C12N15/85GK102827874SQ201210345550
公開日2012年12月19日 申請日期2012年9月18日 優先權日2012年9月18日
發明者戴一凡, 馮瑋, 任媛媛, 劉乃豐 申請人:中國藥科大學, 南京醫科大學