專利名稱：一種高純度小鼠骨骼肌衛星細胞的簡易提取方法
技術領域：
本發明提供了一種簡單易行、高純度的小鼠骨骼肌衛星細胞的提取方法，為骨骼肌衛星細胞介導的基因轉染、骨骼肌及心肌再生提供種子細胞。
背景技術：
隨著顯微外科技術的發展和人們對小鼠模型優越性的認識，如繁殖快(只需21 天)、胎仔數多、維持消耗少及基因、信號通道與人類相似度高等，小鼠模型在目前的科研中應用廣泛。小鼠骨骼肌衛星細胞是骨骼肌中具有分化增殖潛能的肌源性干細胞。作為成體干細胞的一種，高純度骨骼肌衛星細胞作為成體種子細胞及基因治療工程細胞在缺血性心臟病的治療中展示了良好的臨床應用前景。然而，肌衛星細胞在成年骨骼肌中含量較低， 約1%-5%，而其數量在個體的生命過程中由于各種因素的影響而逐漸減少，且在一般情況下處于細胞周期的GO期，這就決定了通過原代細胞分離技術所能獲取的骨骼肌衛星細胞數量必然是有限的。因此，其分離和培養技術一直在不斷地摸索和改進中。傳統方法多采用膠原酶和胰酶分步消化及差速貼壁的方式進行提取純化，或者通過包有乙烯吡咯烷酮的硅膠顆粒(Percoll)梯度離心法分離衛星細胞，這些方法中，由于對消化及差速貼壁時間較難把握，且未形成統一標準，因而得到的衛星細胞依然含有大量的成纖維細胞等雜質細胞，純度較低；而流式細胞分選術、免疫磁珠分選術和平面黏附分離法等方法可獲得高純度衛星細胞，但部分單位缺乏相應的設備條件，且實驗所需抗體等試劑價格昂貴，所使用抗體也有相應的物種特異性，使這種方法的廣泛應用受限。
發明內容
本發明的目的是提供一種快速、高效、經濟地獲得高純度的小鼠骨骼肌衛星細胞的方法。為了達到上述目的，本發明提供了一種高純度小鼠骨骼肌衛星細胞的簡易提取方法，其特征在于，具體步驟為
第一步取5 7周齡C57BL/6小鼠，于小鼠四肢肌注射0. 75%鹽酸布比卡因0. 05
0.15mL ；
第二步36 60小時后，處死小鼠，用75vd%酒精浸泡10 20min，在超凈工作臺內剔出四肢肌肉0. 5 1. 5g，去除血管、脂肪及筋膜，無菌PBS液沖洗，將肌肉剪成0. 5
1.5mm3小粒，加入PBS液靜置3 7min，離心，棄上清液；
第三步加入1 5mL混合消化酶，置于37°C、CO2體積濃度為5%的孵箱中孵化，每隔 10 20min用吸管吹打震蕩3 7min，重復3次，加入3 7mL含15vol%胎牛血清的F12/ DMEM培養基中止消化，過濾細胞懸液，將所得濾液離心，棄上清，細胞沉淀用生長培養基重懸至2 4mL待用；
第四步以胎牛血清潤濕離心管管壁后，依次將60%Percoll分離液2 4mL、 20%Percoll分離液2 4mL、細胞懸液2 4mL沿管壁注入，離心，用長頭吸管小心吸出20%Percoll分離液與60% Percoll分離液分界面的細胞懸液0. 5 1. 5mL，離心，得細胞沉淀； 第五步細胞沉淀用生長培養基重懸后移入鼠尾膠包被的培養瓶中，于CO2溫箱中培養 0.證，命名為PP1，后將培養基連同非貼壁細胞一同轉移到新的培養瓶中再培養0.證，命名為PP2，之后將培養基連同未貼壁的細胞轉入新的培養瓶中培養Mh，命名為PP3，將PP3繼續培養7 后全量換液，得到小鼠骨骼肌衛星細胞。優選地，所述的混合消化酶配制方法為將II型膠原酶0. llg, II型dispease酶 0. 124g, CaCl2Hmg 以及 PBS50mL 混合。本發明的原理是
骨骼肌中的肌衛星細胞存在于肌纖維的肌膜層與基底膜之間，成體骨骼肌中衛星細胞含量極少，當骨骼肌組織受到損傷時，這些靜息期的肌衛星細胞才會被激活，大量分裂、增殖、分化。因此，當以鹽酸布比卡因預處理骨骼肌后，能引起肌組織損傷，伴有大量的炎癥細胞浸潤，從而激活衛星細胞并使其大量增殖。具體機制可能為，肌組織損傷后產生的大量單核及巨噬細胞能通過釋放某些具有有絲分裂活性的細胞因子如IL-6等和生長因子促進肌衛星細胞的活化增殖和分化。此外，有學者發現，肌衛星細胞與存活的肌纖維之間的相互接觸之間的接觸會抑制肌衛星細胞的活化、增殖和分化，布比卡因能選擇性損傷肌纖維而對肌衛星細胞沒有損傷作用，肌纖維溶解壞死可導致這種抑制關系的削弱，引起肌衛星細胞的活化增殖。本實驗中以布比卡因預處理后，所收獲的細胞量明顯增高，為純化后保持足量的衛星細胞提供了保障。傳統方法多采用膠原酶和胰酶分步消化、多次離心的方式進行衛星細胞的提取。 本發明在傳統分離方法的基礎上進行了優化和改進，通過采用自配的混合酶消化液對骨骼肌組織進行一次性消化，僅需一次低速離心便可獲得細胞。此種改良方法避免了傳統方法中多次消化離心的繁瑣操作，節省了細胞提取的時間，從而減輕了消化酶對細胞的損傷，減少了細胞的丟失，增加了細胞的收獲。在衛星細胞分離擴增培養過程中，骨骼肌組織中的成纖維細胞會影響衛星細胞的純度和生長狀態，兩者之間存在著一種此消彼長的競爭性生長特征，因此，如何去除夾雜其中的成纖維細胞的污染是純化方式不斷改良的主要目標。流式細胞分選術、免疫磁珠分選術和平面黏附分離法等方法可獲得高純度衛星細胞，但部分單位缺乏相應的設備條件，且實驗所需抗體等試劑價格昂貴，所使用抗體也有相應的物種特異性，使這種方法的廣泛應用受限。因此，目前研究的重點集中在如何快速、高效、經濟地獲得高純度的衛星細胞。大部分成纖維細胞于10-30min內貼壁，而衛星細胞30min左右開始貼壁，但附著不牢，輕輕晃動即浮起。普通的差速貼壁無法使一部分成纖維細胞貼壁，衛星細胞純度較低；而多次反復差速貼壁純化的最佳差速時間仍然不能確定，因此造成提取衛星細胞的純度無法保證；Percoll是一種包有乙烯吡咯烷酮的硅膠顆粒，不穿透生物膜，對細胞無毒性，其擴散常數低，預先鋪設的60%和20%的兩個非連續密度梯度比較穩定，在低速離心力下在數分鐘至數十分鐘內即可達到滿意的細胞分離效果，因此廣泛應用于分離細胞、亞細胞成分、細菌及病毒的實驗中。然而，雖然Percoll分離法來分離細胞收獲的衛星細胞純度高于單純差速貼壁法，但也不能完全避免非肌源性細胞的混入。因此，為進一步減少非肌源性細胞污染，本發明通過反復對比研究，優化了一系列差速貼壁時間，并將Percoll分離法與之相結合，其獲得的PP3純度明顯高于其他純化方法，且提純時間跨度僅為兩天，避免了反復差速貼壁法長久的耗時。細胞傳代后，其混雜的成纖維細胞將因為較快的增殖速度形成生長優勢，從而造成衛星細胞純度迅速下降。故在每次傳代時仍應通過預貼壁30min盡可能去除成纖維細胞，以維持傳代衛星細胞一定的純度。本發明方法簡易、快速，骨骼肌衛星細胞純化率及產率高，經本方法提取、純化的小鼠骨骼肌衛星細胞體外培養具有較高的增殖及分化能力，可進行體外基因修飾或體內移植。本方法通過預處理肌肉組織，一步法混合酶消化，結合Percoll不等密度梯度離心，并通過優化差速貼壁時間，提取了高純度的小鼠骨骼肌衛星細胞，為進一步的基因轉染及細胞移植提供了基礎。
圖1為Percoll不等密度梯度離心后示意圖骨骼肌衛星細胞為20%及 60%Percoll液交界處。圖2為提純后骨骼肌衛星細胞desmin免疫熒光染色圖deSmin表達強陽性。圖3為小鼠成纖維細胞desmin免疫染色(陰性對照)圖無desmin表達。圖4為流式細胞儀衛星細胞純度鑒定圖紅色曲線為骨骼肌衛星細胞desmin陽性純度(92. 59 士 1.29%)，綠色曲線為陰性對照的小鼠成纖維細胞。圖5為提純后第4天圖骨骼肌衛星細胞對數生長期，細胞呈梭形，形態均一。圖6為肌管形成圖用馬血清誘導分化后，多個相鄰衛星細胞可融合可形成肌管。
具體實施例方式下面結合實施例來具體說明本發明。本發明中所述的？85185液皆為？!1值為7.4 的磷酸鹽緩沖溶液。本發明中所有的濃度均為體積濃度。
實施例1.實驗動物6周齡C57BL/6小鼠，由上海斯萊克實驗動物有限公司提供。2.取材部位預處理以100 μ L微量注射器于小鼠四肢肌注射0.75%鹽酸布比卡因 0. lmL。3.取材48小時后，頸椎脫臼法處死小鼠，將整個小鼠以75%酒精浸泡15min，在超凈工作臺內剔出四肢肌肉約lg，仔細去除肌肉上附著的血管、脂肪及筋膜，無菌PBS液沖洗3遍，將肌肉剪成約Imm3肉糜小粒，加入無菌PBS液浸泡，靜置5min，離心，棄上清液。4. 一步法混合消化酶消化加入3mL混合消化酶(配制方法為將II型膠原酶(Sigma Aldrich, Catalog No. :C6885)0. llg, II 型 dispease 酶(Roche, Catalog No. :4942078001)0. 124g, CaCl2Hmg, PBS50mL 混合)，置于 37°C、5%C02 孵箱中孵化，每隔 15min用吸管吹打震蕩5min重復3次，一小時后，加入5mL含15%胎牛血清的F12/DMEM培養基中止消化，200目過濾網過濾細胞懸液2次，1400r/min離心lOmin，棄上清，細胞沉淀用 DMEM/F12 生長培養基(Gibco, Catalog No. 11330032)重懸至 3mL 待用。5. Percoll非連續密度梯度離心以2mL胎牛血清(Gibco, Catalog No. 10099141)潤濕 15mL 離心管管壁后，依次將 60%Percoll 分離液(GE Healthcare, CatalogNo. 17-0891-01) 3mL、20%Percoll分離液3mL、步驟4中的細胞懸液3mL沿管壁緩緩注入， 1800r/min離心20min。長頭吸管小心吸出20% Percoll分離液與60% Percoll分離液分界面的細胞懸液約lmL，1000r/min離心5min，得細胞沉淀。6.優化差速貼壁時間細胞沉淀用含15%胎牛血清的DMEM/F12生長培養基重懸至5mL后移入鼠尾膠包被的培養瓶中，于(X)2溫箱37°C中培養0. (第一次貼壁)，命名為 PP1，后將培養基連同非貼壁細胞一同轉移到新的培養瓶中再在37°C培養0. (第二次貼壁)，命名為PP2，之后將培養基連同未貼壁的細胞轉入新的培養瓶中37°C培養24h(第三次貼壁)，獲得PP3。PP3繼續培養7 后全量換液。7.骨骼肌衛星細胞鑒定取PP3細胞，4g/L臺盼藍染色計數活細胞。用4%多聚甲醛固定，按常規免疫熒光染色方法鑒定成肌細胞的純度。一抗主要采用肌衛星細胞特異性標志物結蛋白(desmin) (abeam, Catalog No. abl5200), Cy3 標記二抗(Beyotime, Catalog No. :A0516)，并采用 hoechst33258 (Beyotime, Catalog No. :C1017)復染細胞核，觀察免疫熒光結果，流式細胞儀檢測衛星細胞純度(以不表達desmin的小鼠成纖維細胞系做陰性對照)。8.骨骼肌衛星細胞培養增殖、分化將步驟6所得的提純后細胞以含15%胎牛血清的F12/DMEM培養基進行培養，每日觀察細胞形態與生長情況，待細胞生長至80%接觸后傳代，每次傳代均預貼壁30min，預貼壁步驟與上述的第一次貼壁相同，之后將培養基連同未貼壁的細胞轉入新的培養瓶中37°C培養完成細胞貼壁，當細胞培養貼壁后，將培養基更換為分化液(配制方法為在DMEM/F12培養基中按體積比100 :2加入馬血清，再按體積比 100 1加入青鏈霉素)進行誘導分化培養，觀察分化形成肌管的狀態。9.結果改良本方法提取、純化方式中Percoll不等密度梯度離心后見圖1，純化后最終所獲得的細胞經臺盼藍染色計數，約有95%以上的細胞不著色，提示該方法所得的細胞存活率較高。經免疫熒光染色后，desmin呈強陽性表達(圖2，3)，流式細胞儀鑒定其純度為92. 59 士 1. 29% (圖 4)。原代骨骼肌衛星細胞傳代后貼壁速度明顯加快，0. 5h開始貼壁，2h內90%以上的衛星細胞完成貼壁。骨骼肌衛星細胞體外培養時潛伏期為l-2d，從第3d起進入對數生長期，5-6d開始進入細胞增殖的平臺期。進入對數生長期后，隨著細胞的增殖，形成散在分布的細胞集落(圖5);細胞常常拉長變細，同時趨向于平行排列。當細胞匯合超過60%-70%后， 骨骼肌衛星細胞之間出現融合現象，有散在的肌管細胞形成。至7-8d可見大片肌管細胞形成，肌管細胞之間亦可相互融合。培養條件良好時，倒置相差顯微鏡下可觀察到肌管細胞自發性收縮。細胞貼壁后更換為分化培養基，發現細胞的分裂、增殖速度顯著下降，細胞維持在較低的密度水平。24h后開始有少量骨骼肌衛星細胞相互融合，散在的肌管細胞開始形成(圖6)，7 后可見絕大多數的骨骼肌衛星細胞融合，培養皿內以肌管細胞為主。
權利要求
1.一種高純度小鼠骨骼肌衛星細胞的簡易提取方法，其特征在于，具體步驟為 第一步取5 7周齡C57BL/6小鼠，于小鼠四肢肌注射0. 75%鹽酸布比卡因0. 05 0.15mL ；第二步36 60小時后，處死小鼠，用75vd%酒精浸泡10 20min，在超凈工作臺內剔出四肢肌肉0. 5 1. 5g，去除血管、脂肪及筋膜，無菌PBS液沖洗，將肌肉剪成0. 5 1.5mm3小粒，加入PBS液靜置3 7min，離心，棄上清液；第三步加入1 5mL混合消化酶，置于37°C、CO2體積濃度為5%的孵箱中孵化，每隔 10 20min用吸管吹打震蕩3 7min，重復3次，加入3 7mL含15vol%胎牛血清的F12/ DMEM培養基中止消化，過濾細胞懸液，將所得濾液離心，棄上清，細胞沉淀用生長培養基重懸至2 4mL待用；第四步以胎牛血清潤濕離心管管壁后，依次將60%Percoll分離液2 4mL、 20%Percoll分離液2 4mL、細胞懸液2 4mL沿管壁注入，離心，用長頭吸管小心吸出20% Percoll分離液與60% Percoll分離液分界面的細胞懸液0. 5 1. 5mL，離心，得細胞沉淀； 第五步細胞沉淀用生長培養基重懸后移入鼠尾膠包被的培養瓶中，于CO2溫箱中培養 0.證，命名為PP1，后將培養基連同非貼壁細胞一同轉移到新的培養瓶中再培養0.證，命名為PP2，之后將培養基連同未貼壁的細胞轉入新的培養瓶中培養Mh，命名為PP3，將PP3繼續培養7 后全量換液，得到小鼠骨骼肌衛星細胞。
2.如權利要求1所述的高純度小鼠骨骼肌衛星細胞的簡易提取方法，其特征在于，所述的混合消化酶配制方法為將II型膠原酶0. llg, II型dispease酶0. 124g, CaCl2Hmg以及PBS50mL混合。
全文摘要
本發明提供了一種高純度小鼠骨骼肌衛星細胞的簡易提取方法,其特征在于,具體步驟為第一步于小鼠四肢肌注射鹽酸布比卡因；第二步處死小鼠，剔出四肢肌肉，去除血管、脂肪及筋膜，將肌肉剪成0.5～1.5mm3小粒；第三步加入混合消化酶孵化，過濾細胞懸液，將所得濾液離心，棄上清，細胞沉淀用生長培養基重懸；第四步依次將60%Percoll分離液、20%Percoll分離液、細胞懸液沿管壁注入，用長頭吸管小心吸出20%Percoll分離液與60%Percoll分離液分界面的細胞懸液，離心，得細胞沉淀；第五步將細胞沉淀培養,得到小鼠骨骼肌衛星細胞。本發明方法簡易、快速，骨骼肌衛星細胞純化率及產率高，具有較高的增殖及分化能力，可進行體外基因修飾或體內移植。
文檔編號C12N5/074GK102424813SQ20111043864
公開日2012年4月25日 申請日期2011年12月25日 優先權日2011年12月25日
發明者徐德民, 朱鎧, 王春生, 賴顥, 過常發 申請人:復旦大學附屬中山醫院