Npc1基因突變的檢測方法和試劑盒的制作方法

專利名稱：Npc1基因突變的檢測方法和試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明屬于基因技術領域；更具體地，本發明涉及NPCl基因突變的檢測方法和試劑盒。
背景技術：
膽固醇是哺乳動物細胞內的一種至關重要的脂質。它具有調節胞膜活動的獨特理化性質，并且是留類激素、羥固醇和維生素D的前體。膽固醇的失調會引發多種病變。在正常細胞中，低密度脂蛋白經受體介導內吞到達早期內體。隨著胞內體的pH值下降，逐漸獲得各種酸性水解酶，形成晚期內體。在晚期內體中，低密度脂蛋白顆粒解體， 膽固醇酯在酸性水解酶的作用下水解，釋放出游離的膽固醇。這些膽固醇大部分被運送到質膜，還有一部分到達內質網和其它位點。C型I類尼曼-匹克蛋白(NPCl)是ー個跨膜脂質泵，它能監測細胞內膽固醇水平的變化，通過改變小泡轉運方式或直接參與脂質跨膜轉運來調節細胞脂質的平衡。它能促進脂質(特別是膽固醇)從晚期內體/溶酶體轉運到高爾基復合體、內質網和細胞膜(Vance, J. E.，Lipid imbalance in the neurologicaldisorder, Niemann-Pick C disease. FEBS Lett, 2006. 580(23):p. 5518-24)。NPCl 蛋白幾乎在姆一種組織中都有表達(Dieschy, J. M. and S. D. Turley, Control of cholesterolturnover in the mouse. J Biol Chem, 2002. 277(6):p. 3801-4)。NPCl蛋白是細胞晚期內體中含有的一種跨膜糖蛋白，由1278個氨基酸組成，分子量為142kDa，包含13個跨膜區域。其中在第3個和第7個跨膜區域之間含有固醇感受域(SSD)，類似于內質網中的固醇感受蛋白，它能識別蛋白質環境中的游離固醇并參與介導溶酶體中膽固醇的流出。NPCl還包含8個保守的半胱氨酸和I個亮氨酸拉鏈結構，后者介導蛋白質ニ聚化，而前者類似于ー個環指模體，參與蛋白質-蛋白質或蛋白質-脂質之間的相互作用。已有研究證實，NPCl基因的突變與C型尼曼-匹克病(NPC)的發生密切相關。NPC是ー種罕見的常染色體隱性遺傳的神經脂質沉積癥。發病率大約為1:150，000。患病個體通常在成年之前去世，并且至今尚無有效的治療方法。臨床表現為肝脾腫大以及神經退行性疾病，包括眼肌麻痹、運動失調、肌張力障礙和癡呆等。生物學上表現為因細胞內膽固醇轉運障礙而導致的未酯化膽固醇在溶酶體和高爾基體內的堆積。目前，NPC被認為是由C型I類尼曼-匹克基因(NPCl)或C型2類尼曼-匹克基因(NPC2)的突變所導致的，其中95%的患者是由NPCl基因突變所致，目前已經被發現的突變達到200多個(Chang, T. Y. , et al. , Niemann-Pick type C disease and intracellular cholesteroltrafficking. J Biol Chem, 2005. 280(22):p. 20917-20 ；Tamura, H. , et al. , Niemann-Picktype C disease:novel NPCl mutations and characterization of the concomitantacid sphingomyelinase deficiency. Mol Genet Metab, 2006. 87(2):p. 113-21)。另外有報道指出，NPC I基因的突變可能與肥胖的發生有關。有研究組對1380個歐洲的肥胖病人和1416個年齡匹配的正常體重的對照人群進行全基因組關聯分析(GffAS)，并且在另外的14186個包含肥胖病人和正常対照的人群中對分析結果進行驗證，發現ー個位于NPCl基因上的單核苷酸多態性位點(SNP)與肥胖表型呈現顯著的相關性(rsl805081,P=2. 9X10_7)。但這個 SNP 位點 rsl805081 (H215R)對 NPCl 蛋白的功能有何影ロ向尚イ、渭楚(Meyre, D.，et al. , Genome-wiae association study for early-onset andmorbid adult obesity identifies three new risk loci in European populations. NatGenet, 2009. 41(2) :p. 157-9)。以小鼠作為模型進行研究時，科學家發現與作為對照的正常(NpCl+/+)小鼠相比，NPCl純合突變(Npcl+)的小鼠除了具有神經功能缺損和細胞膽固醇轉運缺陷等癥狀之外，還表現為遲發性的減重和食欲減退(Xie，C.，et al., Cholestero Ibalance and metabolism in mice with loss oi function of Niemann-PicK しprotein. Am J Physiol, 1999. 276(2Pt I):ρ·E336-44)。而雜合突變(Npcl+勺的小鼠在高脂飲食的誘導下表現出明顯的體重增加(Jelinek, D.，et al.，DecreasedNpcl gene dosage in mice is associated with weight gam.Obesity(bilverSpring), 2010. 18(7) :p. 1457-9)。因此，NPCl基因的突變可視為危險因素，對其突變的檢測對于生物學研究和臨床 診斷都具有重要的意義。目前，對于基因變異的檢測較為常用的技術是聚合酶鏈式反應(PCR)。然而，NPCl基因的擴增模板通常為待檢測個體的血液基因組DNA，復雜度較高，難以得到理想的目的基因片段用于后續的測序。因此，對于NPCl基因突變的檢測還有待于進ー步優化。

發明內容
本發明的目的在于提供ー種NPCl基因突變的檢測方法和試劑盒。在本發明的第一方面，提供ー種檢測樣品中是否存在NPCl基因變異的試劑，所述的試劑是引物對，選自下組SEQIDNO: I 和 SEQ ID NO: 2 ；SEQIDNO:3 和 SEQ ID NO:4 ；SEQIDNO:5 和 SEQ ID NO:6 ；SEQIDNO:7 和 SEQ ID NO:8 ；SEQIDNO:9 和 SEQ ID NO: 10 ；SEQIDNO: 11 和 SEQ ID NO: 12 ；SEQIDNO: 13 和 SEQ ID NO: 14 ；SEQIDNO: 15 和 SEQ ID NO: 16 ；SEQIDNO:17 和 SEQ ID NO:18 ；SEQIDNO: 19 和 SEQ ID NO:20 ；SEQIDNO:21 和 SEQ ID NO:22 ；SEQIDNO:23 和 SEQ ID NO:24 ；SEQIDNO:25 和 SEQ ID NO:26 ；SEQIDNO:27 和 SEQ ID NO:28 ；SEQIDNO:29 和 SEQ ID NO:30 ；SEQIDNO:31 和 SEQ ID NO:32 ；
SEQ ID NO:33 和 SEQ ID NO:34 ；SEQ ID NO:35 和 SEQ ID NO:36 ；SEQ ID NO:37 和 SEQ ID NO:38 ；SEQ ID NO:39 和 SEQ ID NO:40 ；SEQ ID NO:41 和 SEQ ID NO:42 ；SEQ ID NO:43 和 SEQ ID NO:44 ;和/或SEQ ID NO:45 和 SEQ ID NO:46。在另ー優選例中，引物對SEQ ID NO: I和SEQ ID NO:2用于擴增NPCl外顯子I序列； SEQ ID NO: 3和SEQ ID NO:4用于擴增NPCl外顯子2序列；SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6用于擴增NPCl外顯子3序列；SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8用于擴增NPCl外顯子4序列；SEQ ID NO:9 和 SEQ ID NO: 10 用于擴增 NPCl 外顯子 5 序列；SEQ ID NO: 11 和 SEQ ID NO: 12 用于擴增 NPCl 外顯子 6 序列；SEQ ID NO: 13 和 SEQ ID NO: 14 用于擴增 NPCl 外顯子 7 序列；SEQ ID NO: 15 和 SEQ ID NO: 16 用于擴增 NPCl 外顯子 8 序列；SEQ ID NO: 17 和 SEQ ID NO: 18 用于擴增 NPCl 外顯子 9 序列；SEQ ID NO: 19 和 SEQ ID NO:20 用于擴增 NPCl 外顯子 10 序列；SEQ ID NO:21 和 SEQ ID NO:22 用于擴增 NPCl 外顯子 11 序列；SEQ ID NO: 23 和 SEQ ID NO: 24 用于擴增 NPCl 外顯子 12 序列；SEQ ID NO:25 和 SEQ ID NO:26 用于擴增 NPCl 外顯子 13 序列；SEQ ID NO:27 和 SEQ ID NO:28 用于擴增 NPCl 外顯子 14 序列；SEQ ID NO:29 和 SEQ ID NO:30 用于擴增 NPCl 外顯子 15 和 16 序列；SEQ ID NO:31 和 SEQ ID NO:32 用于擴增 NPCl 外顯子 17 序列；SEQ ID NO: 33 和 SEQ ID NO: 34 用于擴增 NPCl 外顯子 18 和 19 序列；SEQ ID NO:35 和 SEQ ID NO:36 用于擴增 NPCl 外顯子 20 序列；SEQ ID NO:37 和 SEQ ID NO:38 用于擴增 NPCl 外顯子 21 序列；SEQ ID NO:39 和 SEQ ID NO:40 用于擴增 NPCl 外顯子 22 序列；SEQ ID NO:41 和 SEQ ID NO:42 用于擴增 NPCl 外顯子 23 序列；SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:44用于擴增NPCl外顯子24序列；和/或SEQ ID NO:45 和 SEQ ID NO:46 用于擴增 NPCl 外顯子 25 序列。在本發明的另一方面，提供ー種檢測樣品中是否存在NPCl基因變異的試劑盒，所述的試劑盒中含有所述的ー種或多種弓I物對；較佳的，所述的試劑盒中含有SEQ IDNO: 1-46的引物。在另ー優選例中，所述的試劑盒中還含有PCR擴增試劑；核酸提取試劑；核酸序列分析軟件；和/或使用說明書。
在本發明的另一方面，提供一種獲得NPCl基因擴增產物的方法，所述的方法包括以核酸樣品為模板，利用所述的引物對進行PCR擴增，獲得擴增產物。在另ー優選例中，在進行PCR擴增時，PCR熱循環步驟如下(a) 94 ± I °C 進打 30 ± 5 秒；(b) 59±4°C 退火 45±5 秒；(C) 72 ± I °C 進行 45 ± 5 秒；重復步驟(a)- (c) 25±5 次。在另ー優選例中，在進行PCR擴增時， 若以SEQ ID NO: I和SEQ ID NO:2為引物，退火溫度是60± 1°C ；若以SEQ ID N0:3和SEQ ID NO:4為引物，退火溫度是60± 1°C ；若以SEQ ID N0:5和SEQ ID NO:6為引物，退火溫度是60± 1°C ；若以SEQ ID N0:7和SEQ ID NO:8為引物，退火溫度是60± 1°C ；若以SEQ ID N0:9和SEQ ID NO: 10為引物，退火溫度是60± 1°C ；若以SEQ ID NO: 11 和 SEQ ID NO: 12 為引物，退火溫度是 60± 1°C ；若以SEQ ID NO: 13 和 SEQ ID NO: 14 為引物，退火溫度是 60± 1°C ；若以SEQ ID NO: 15 和 SEQ ID NO: 16 為引物，退火溫度是 60± 1°C ；若以SEQ ID NO: 17 和 SEQ ID NO: 18 為引物，退火溫度是 60± 1°C ；若以SEQ ID NO: 19 和 SEQ ID NO: 20 為引物，退火溫度是 60± I°C ；若以SEQ ID NO:21 和 SEQ ID NO:22 為引物，退火溫度是 60± 1°C ；若以SEQ ID NO: 23 和 SEQ ID NO: 24 為引物，退火溫度是 60± I°C ;若以SEQ ID NO: 25 和 SEQ ID NO: 26 為引物，退火溫度是 60± I°C ;若以SEQ ID NO: 27 和 SEQ ID NO: 28 為引物，退火溫度是 60± I°C ;若以SEQ ID NO: 29 和 SEQ ID NO: 30 為引物，退火溫度是 60± I°C ;若以SEQ ID NO:31 和 SEQ ID NO:32 為引物，退火溫度是 60± 1°C ；若以SEQ ID NO: 33 和 SEQ ID NO: 34 為引物，退火溫度是 60± I°C ;若以SEQ ID NO: 35 和 SEQ ID NO: 36 為引物，退火溫度是 60± I°C ;若以SEQ ID NO: 37 和 SEQ ID NO: 38 為引物，退火溫度是 60± I°C ;若以SEQ ID NO: 39 和 SEQ ID NO: 40 為引物，退火溫度是 60± I°C ;若以SEQ ID N0:41 和 SEQ ID NO:42 為引物，退火溫度是 60± 1°C ；若以SEQ ID N0:43和SEQ ID NO:44為引物，退火溫度是60± 1°C ;或若以SEQ ID NO: 45 和 SEQ ID NO: 46 為引物，退火溫度是 60± I°C。在另ー優選例中，在進行PCR熱循環前，還包括模板變性步驟95±1°C進行3±2分鐘；或在進行PCR熱循環后，還包括延伸步驟72±1°C進行10±2分鐘。在另ー優選例中，在PCR擴增體系中，還加入ニ甲基亞砜，其在PCR擴增體系中的終濃度按照體積為3-10%。在本發明的另一方面，提供ー種確定待測核酸樣品中是否存在NPCl基因變異的方法，所述的方法包括
(I)采用所述的方法從待測核酸樣品中擴增NPCl基因片段；(2)分析(I)擴增產物中NPCl基因片段的序列，并與野生型NPCl基因中對應的序列進行比較；如果存在不同，則表明待測核酸樣品中存在NPCl基因變異。本發明的其它方面由于本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。


圖I和2顯示了采用本發明優化的引物進行PCR擴增獲得的擴增產物的電泳結果。其中，泳道1-23依次表示DNA Marker,以及利用表I中NPCl-I (F和R) ,NPCI-2 (F和R)、NPCI-3 (F 和 R) ,NPCI-4 (F 和 R) ,NPCI-5 (F 和 R) ,NPCI-6 (F 和 R) ,NPCI-7 (F 和 R) ,NPCI-8 (F和 R)、NPCI-9 (F 和 R)、NPC1-10 (F 和 R)、NPCl-Il (F 和 R)、NPCト 12 (F 和 R)、NPCト 13 (F 和R)、NPCト 14 (F 和 R)、NPCト 15/16 (F 和 R)、NPCト 17 (F 和 R)、NPC ト 18/19 (F 和 R) ,NPCI-20 (F和 R)、NPCト21 (F 和 R)、NPCト22 (F 和 R)、NPCト23 (F 和 R) ,NPCI-24 (F 和 R)、NPCト25 (F 和 R)相應引物，對C型尼曼-匹克病患者的血液基因組DNA為模板進行PCR擴增獲得的擴增產物的電泳結果。圖3和4顯示了采用其它引物(表2)進行PCR擴增獲得的擴增產物的電泳結果。其中，泳道1-23依次表示DNA Marker,以及利用表2中NPCl_lF_a和NPCl_lR_a，NPC1_2F_a 和 NPCl_2R_a，NPCl_3F_a和 NPCl_3R_a，NPCl_4F_a和 NPCl_4R_a，NPCl_5F_a和 NPC1_5R_a, NPCl_6F_a 和 NPCl_6R_a，NPCl_7F_a 和 NPCl_7R_a，NPCl_8F_a 和 NPCl_8R_a，NPC1_9F_a 和 NPCl_9R_a，NPCl_10F_a 和 NPCl_10R_a, NPCl_llF_a 和 NPCl_llR_a, NPCl_12F_a 和NPCl_12R_a, NPCl_13F_a 和 NPCl_13R_a， NPCl_14F_a 和 NPCl_14R_a， NPCl_15/16F_a 和NPCl_15/16R_a, NPCl_17F_a 和 NPCl_17R_a，NPCl_18/19F_a 和 NPCl_18/19R_a，NPC1_20F_a 和 NPCl_20R_a， NPCl_21F_a 和 NPCl_21R_a， NPCl_22F_a 和 NPCl_22R_a， NPCl_23F_a 和NPCl_23R_a，NPCl_24F_a 和 NPCl_24R_a，NPCl_25F_a 和 NPCl_25R_a 引物，對 C 型尼曼-匹克病患者的血液基因組DNA為模板進行PCR擴增獲得的擴增產物的電泳結果。
具體實施例方式本發明人經過廣泛而深入的研究，找到了ー類特別適合于擴增NPCl基因的引物，所述引物經過合理的設計、優選而獲得，用于PCR擴增時特異性良好，且擴增效率高。本發明人還優化了 PCR擴增反應，進ー步提高了擴增效率。NPCl 基因C型I類尼曼-匹克蛋白(NPCl)是參與胞內膽固醇轉運的重要跨膜蛋白。NPCl基因定位于18qll_ql2，基因組DNA包含約55kb，共25個外顯子，編碼1278個氨基酸。NPCl蛋白廣泛表達于腦神經細胞，其功能異常引起細胞內膽固醇轉運障礙，從而導致一系列病理變化(Vanier, Μ. Τ. , et al. , Genetic heterogeneity in Niemann-Pick Cdisease:a study using somatic cell hybridization and linkage analysis. Am J HumGenet，1996. 58(1):p. 118-25)。并且研究發現，NPCl基因在患病人群中變異率較高，而在正常人群中變異率很低。因此，針對NPCl基因各外顯子上堿基的突變檢測對于疾病的診斷是重要的。
NPCl基因變異的檢測試劑或試劑盒基于NPCl基因與C型尼曼-匹克病和肥胖的密切相關性，可以通過分析NPCl基因的變異情況，對C型尼曼-匹克病和肥胖的患病人群進行易感性分析，還可以對相關人群的患病風險進行早期評估。可以采用多種技術來檢測NPCl基因的變異位點，目前較為方便的是用NPCl基因特異的引物進行PCR擴增，然后對擴增產物進行序列測定，從而判斷是否發生變異。該檢測技術既可以針對cDNA，也可以針對基因組DNA。本發明人在研究中發現，檢測NPCl基因突變時，利用一般的引物進行PCR擴增時特異性較差，擴增效率不高。因此，需要設計和篩選特異性好的引物。經過大量的實驗和比較，本發明人找到了對應于NPCl基因25個外顯子的23對引物。經驗證，所述引物獲得的擴增產物既包含了 NPCl基因各外顯子上完整的序列，且特異性非常好，PCR擴增成功率接近100%，特別適用于復雜體系的PCR擴增。各引物的核苷酸序列及其較佳的退火溫度如表I所示。
權利要求
1.一種檢測樣品中是否存在NPCl基因變異的試劑，其特征在于，所述的試劑是引物對，選自下組SEQ ID NO:I 和 SEQ ID NO:2 ；SEQ ID NO:3 和 SEQ ID NO:4 ；SEQ ID NO:5 和 SEQ ID NO:6 ；SEQ ID NO:7 和 SEQ ID NO:8 ；SEQ ID NO:9 和 SEQ ID NO:10 ；SEQ ID NO:11 和 SEQ ID NO:12 ；SEQ ID NO:13 和 SEQ ID NO:14 ；SEQ ID NO:15 和 SEQ ID NO:16 ；SEQ ID NO:17 和 SEQ ID NO:18 ；SEQ ID NO:19 和 SEQ ID NO:20 ；SEQ ID NO:21 和 SEQ ID NO:22 ；SEQ ID NO:23 和 SEQ ID NO:24 ；SEQ ID NO:25 和 SEQ ID NO:26 ；SEQ ID NO:27 和 SEQ ID NO:28 ；SEQ ID NO:29 和 SEQ ID NO:30 ；SEQ ID NO:31 和 SEQ ID NO:32 ；SEQ ID NO:33 和 SEQ ID NO:34 ；SEQ ID NO:35 和 SEQ ID NO:36 ；SEQ ID NO:37 和 SEQ ID NO:38 ；SEQ ID NO:39 和 SEQ ID NO:40 ；SEQ ID NO:41 和 SEQ ID NO:42 ；SEQ ID NO:43 和 SEQ ID NO:44 ;和 / 或SEQ ID NO:45 和 SEQ ID NO:46。
2.如權利要求I所述的試劑盒，其特征在于， SEQ ID NO: I和SEQ ID NO: 2用于擴增NPCl外顯子I序列； SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4用于擴增NPCl外顯子2序列； SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6用于擴增NPCl外顯子3序列； SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8用于擴增NPCl外顯子4序列； SEQ ID NO:9和SEQ ID NO: 10用于擴增NPCl外顯子5序列； SEQ ID NO: 11和SEQ ID NO: 12用于擴增NPCl外顯子6序列； SEQ ID NO: 13和SEQ ID NO: 14用于擴增NPCl外顯子7序列； SEQ ID NO: 15和SEQ ID NO: 16用于擴增NPCl外顯子8序列； SEQ ID NO: 17和SEQ ID NO: 18用于擴增NPCl外顯子9序列； SEQ ID NO: 19和SEQ ID NO:20用于擴增NPCl外顯子10序列； SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22用于擴增NPCl外顯子11序列； SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24用于擴增NPCl外顯子12序列； SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26用于擴增NPCl外顯子13序列；SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28用于擴增NPCl外顯子14序列； SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30用于擴增NPCl外顯子15和16序列； SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32用于擴增NPCl外顯子17序列； SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34用于擴增NPCl外顯子18和19序列； SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36用于擴增NPCl外顯子20序列； SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38用于擴增NPCl外顯子21序列； SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:40用于擴增NPCl外顯子22序列； SEQ ID NO:41和SEQ ID NO:42用于擴增NPCl外顯子23序列； SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:44用于擴增NPCl外顯子24序列；和/或 SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:46用于擴增NPCl外顯子25序列。
3.—種檢測樣品中是否存在NPCl基因變異的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒中含有選自權利要求I的一種或多種引物對； 較佳的，所述的試劑盒中含有SEQ ID NO: 1-46的引物。
4.如權利要求I所述的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒中還含有 PCR擴增試劑； 核酸提取試劑； 核酸序列分析軟件；和/或 使用說明書。
5.一種獲得NPCl基因擴增產物的方法，其特征在于，所述的方法包括 以核酸樣品為模板，利用選自權利要求I的引物對進行PCR擴增，獲得擴增產物。
6.如權利要求5所述的方法，其特征在于，在進行PCR擴增時，PCR熱循環步驟如下(a)94 ± I °C 進行 30 ± 5 秒；(b)59±4°C 退火 45 ±5 秒； (c)72±l°C進行45±5 秒； 重復步驟(a)-(c) 25±5次。
7.如權利要求5或6所述的方法，其特征在于，在進行PCR擴增時， 若以SEQ ID NO: I和SEQ ID NO:2為引物，退火溫度是58± 1°C ； 若以SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4為引物，退火溫度是60± 1°C ； 若以SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6為引物，退火溫度是60± 1°C ； 若以SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8為引物，退火溫度是60± 1°C ； 若以SEQ ID NO:9和SEQ ID NO: 10為引物，退火溫度是60± 1°C ； 若以SEQ ID NO: 11和SEQ ID NO: 12為引物，退火溫度是60± 1°C ; 若以SEQ ID NO: 13和SEQ ID NO: 14為引物，退火溫度是60± 1°C ； 若以SEQ ID NO: 15和SEQ ID NO: 16為引物，退火溫度是60± 1°C ； 若以SEQ ID NO: 17和SEQ ID NO: 18為引物，退火溫度是60± 1°C ； 若以SEQ ID NO: 19和SEQ ID NO:20為引物，退火溫度是60± 1°C ； 若以SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22為引物，退火溫度是60± 1°C ； 若以SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24為引物，退火溫度是60± 1°C ； 若以SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26為引物，退火溫度是60± 1°C ；若以SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28為引物，退火溫度是60± 1°C ； 若以SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30為引物，退火溫度是60± 1°C ； 若以SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32為引物，退火溫度是60± 1°C ； 若以SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34為引物，退火溫度是60± 1°C ； 若以SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36為引物，退火溫度是60± 1°C ； 若以SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38為引物，退火溫度是60± 1°C ； 若以SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:40為引物，退火溫度是60± 1°C ； 若以SEQ ID N0:41和SEQ ID NO:42為引物，退火溫度是60± 1°C ； 若以SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:44為引物，退火溫度是60± 1°C ;或 若以SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:46為引物，退火溫度是60± 1°C。
8.如權利要求5或6所述的方法，其特征在于， 在進行PCR熱循環前，還包括模板變性步驟95±1°C進行3±2分鐘；或 在進行PCR熱循環后，還包括延伸步驟72±1°C進行10±2分鐘。
9.如權利要求5或6所述的方法，其特征在于，在PCR擴增體系中，還加入二甲基亞砜，其在PCR擴增體系中的終濃度按照體積為3-10%。
10.一種確定待測核酸樣品中是否存在NPCl基因變異的方法，其特征在于，所述的方法包括 (1)采用權利要求5所述的方法從待測核酸樣品中擴增NPCl基因片段； (2)分析(I)擴增產物中NPCl基因片段的序列，并與野生型NPCl基因中對應的序列進行比較；如果存在不同，則表明測核酸樣品中存在NPCl基因變異。
全文摘要
本發明涉及NPC1基因突變的檢測方法和試劑盒。首次揭示一類特別適合于擴增NPC1基因的引物，所述引物經過合理的設計、優選而獲得，用于PCR擴增時特異性良好，且擴增效率高。本發明人還優化了PCR擴增反應，進一步提高了擴增效率。
文檔編號C12Q1/68GK102827942SQ20121034762
公開日2012年12月19日 申請日期2012年9月18日 優先權日2012年9月18日
發明者寧光, 崔斌, 洪潔, 曹旻, 石娟, 繆琳 申請人:上海市內分泌代謝病研究所