用于人EGFR基因突變檢測的探針、試劑盒及其檢測方法與流程

本發明涉及基因檢測領域，具體而言，涉及用于人EGFR基因突變檢測的探針、試劑盒及其檢測方法。
背景技術：
：空氣污染等環境因素導致近年來中國肺癌患病人數急劇增加。十萬人肺癌發病率從2002年的39.6％增加到2011年的63％，尤其是兒童和青少年的發病率大幅提升。改革開放三十年以來，肺癌導致的死亡人數增加了465％，肺癌在我國已經成為發病率及死亡率均排名第一的惡性腫瘤。按傳統的組織病理學分類，肺癌可分小細胞肺癌和非小細胞肺癌。非小細胞肺癌(Non-small-cellLungCancer，NSCLC)，包括鱗癌、腺癌、大細胞癌，與小細胞肺癌相比其癌細胞生長分裂較慢，擴散轉移相對較晚，非小細胞肺癌約占肺癌總數的80-85％。表皮生長因子受體(EpidermalGrowthFactorReceptor，EGFR)是表皮生長因子(EGF)細胞增殖和信號傳導的受體。EGFR屬于ErbB受體家族的一種，該家族包括EGFR(ErbB-1),HER2/c-neu(ErbB-2),Her3(ErbB-3)和Her4(ErbB-4)。EGFR屬于酪氨酸激酶型受體，EGFR與其配體在胞外區結合后，EGFR分子間形成同二聚體，也可與其他HER家族分子結合形成異二聚體，之后其胞內區的酪氨酸激酶(TK)被激活，酪氨酸殘基相互磷酸化，隨后其下游偶聯蛋白(PLCγ、aCBL、GRB2、SHC、p85)與該磷酸化部位特異性結合，將信號傳遞到下游的RAS-MAPK通路、PI3K-AKT通路、STAT通路等，從而激活增殖、細胞凋亡逃逸、血管新生、轉移等與與腫瘤發生發展密切相關的生物學行為。在包括肺癌在內的各類腫瘤中，頻繁發現EGFR基因的過度表達，而且還與預后有關，因此EGFR作為分子靶標倍受矚目。研究表明，EGFR突變基因與酪氨酸激酶抑制類藥物(tyrosinekinaseinhibitors，TKI)使用有療效關聯，這些藥物包括Iressa(易瑞沙)和Tarceva(特羅凱)，EGFR基因突變影響著TKI的臨床療效。EGFR突變主要包括4種類型：外顯子19缺失突變、外顯子2l點突變、外顯子18點突變和外顯子20插入突變。目前發現EGFR基因突變90％以上的突變位于外顯子19、21，最常見的EGFR突變為外顯子19LREA缺失和外顯子21L858R突變，二者均會導致酪氨酸激酶結構域活化，且均為TKI的敏感性突變，外顯子20的T790M突變與EGFR-TKI獲得性耐藥有關，還有許多類型的突變臨床意義尚不明確。肺腺癌患者EGFR基因敏感突變陽性率在高加索人群約為10％，在亞裔人群和我國均為50％左右。目前EGFR基因突變檢測主要分為腫瘤組織樣本的檢測以及腫瘤循環DNA(CirculatingtumorDNA，ctDNA)的檢測。目前，臨床上主要通過組織活檢或手術等方式獲得的腫瘤組織樣本來檢測EGFR基因突變，但是由于獲取腫瘤組織標本需采用侵入性手段，這個過程往往會增加病人的痛苦，產生額外的手術風險，并且腫瘤具有異質性，對于已經發生轉移的癌癥患者而言，通過穿刺或手術僅僅取某個部位的癌組織，并不能反映患者整體的情況。其次，有些患者自身的情況決定了其不適合組織活檢，而有些腫瘤在受到穿刺或手術的擾動之后，有加速轉移的風險。最后，組織活檢存在費用高等待時間長等諸多問題，其滯后性對患者的治療也是不利的。因此，近年來“液體活檢”的概念正在興起，其基本思想為運用血液等體液樣本替代腫瘤組織樣本行病理學、分子生物學的檢測，通過檢測患者體液樣本(主要是血液)中的腫瘤循環DNA來獲取腫瘤基因突變信息已經成為一種趨勢。與目前標準的組織活檢相比，革命性的液體活檢具有下列不可替代的優勢：創傷小、可重復性、均化異質性、實時判斷療效，并隨腫瘤的發展而動態調整治療決策。因此，2015年MITTechnologyReview發布的年度十大突破技術(BreakthroughTechnologies2015)，ASCO年度進展(Clinicalcanceradvance2015)中對未來十年的期許，液體活檢均榜上有名。通過檢測ctDNA以追蹤整個病程中腫瘤的特異性基因改變，對腫瘤篩查、診斷、療效監測及預后判斷等具有重要價值，同時可從中探索腫瘤轉移復發及耐藥的分子機制，識別新的靶向治療位點等，因此ctDNA的檢測已經成為腫瘤液體活檢應用的三大熱門方向之一(注：另兩個為CTC與外泌體)。目前，主要的基因突變檢測方法主要包括直接測序法(PCR-sanger測序法)、擴增阻遏突變系統(Amplificationrefractorymutationsystem，ARMS)、變性高效液相色譜法(Denaturinghigh-performanceliquidchromatograph，DHPLC)、高分辨率溶解曲線(highresolutionmelting，HRM)、等位基因特異的Taqman聚合酶鏈式反應(Competitiveallele-specificTaqmanpolymerasechainreaction，CAST-PCR)、數字PCR(digitalPCR,dPCR)、高通量測序技術(High-throughputsequencing，HTS)等。1、直接測序法。直接測序法首先針對突變位點設計PCR引物，通過PCR擴增獲得目的基因片段，然后對PCR產物進行sanger測序并對測序結果進行初步分析。初步分析完成后，對可能攜帶突變信息的樣本的PCR產物，需要通過切膠等方法回收，回收后的PCR產物連接克隆載體(一般為質粒)，挑選陽性克隆測序以確認突變。2、擴增阻遏突變系統。該方法利用PCR引物的3’端末位堿基必須與模板DNA互補才能有效擴增的原理，設計針對突變位點的特異性PCR擴增引物，在嚴格的擴增條件下，只有在引物3’堿基與模板配對時PCR反應才能正常進行，從而檢測出突變。通過設計兩條上游引物，其中一條的3’端與正常基因序列互補，另一條的3’端與突變基因序列互補，檢測時分別加入兩種上游引物及共用的下游引物，進行兩個平行的PCR,根據兩個PCR反應的結果，可以區分是否存在突變以及突變為純合子還是雜合子。ARMS方法的檢測靈敏度大約在1％左右。3、變性高效液相色譜法。該方法的原理基于發生錯配的雜合雙鏈DNA與完全匹配的純合雙鏈DNA解鏈特征的差異，利用色譜方法進行分離。由于雜合雙鏈在突變位點處出現錯配，易于形成“Y”型結構，與色譜柱的固定相結合能力降低，因此雜合雙鏈DNA比純合雙鏈DNA優先洗脫出來，通過洗脫峰的改變可以判斷是否存在突變。該方法的優點在于對已知及未知的突變均可以檢測，但檢測前仍需通過PCR獲取目的基因片段，檢測過程需要打開反應管，容易造成污染，檢測靈敏度在5％左右，且對于陽性結果并不能確定其具體突變類型，最終還是需要測序驗證。4、高分辨率溶解曲線。該方法是基于核酸片段的物理性質，通過飽和染料結合于PCR擴增產物，監測PCR產物的溶解曲線變化分析基因突變。該方法的檢測靈敏度大約在5％左右，對于陽性結果并不能確定具體突變類型，最終還是需要測序驗證。5、等位基因特異的Taqman聚合酶鏈式反應。該方法采用優化Taqman探針，通過特異性MGB探針阻止PCR引物與野生型DNA的結合，因此可以優先擴增突變型DNA，該檢測方法的靈敏度在1％左右。6、數字PCR。數字PCR基于單分子PCR方法來進行計數的核酸定量，是一種絕對定量的方法。主要采用微流控或微滴化方法，將大量稀釋后的核酸溶液分散至芯片的微反應器或微滴中，每個反應器的核酸模板數少于或者等于1個。這樣經過PCR循環之后，有一個核酸分子模板的反應器就會給出熒光信號，沒有模板的反應器就沒有熒光信號。根據相對比例和反應器的體積，就可以推算出原始溶液的核酸濃度。數字PCR的檢測靈敏度大約在0.1％左右。7、高通量測序技術。該技術是對傳統Sanger測序(稱為一代測序技術)革命性的改變,其基本原理是邊合成邊測序，在Sanger等測序方法的基礎上，用不同顏色的熒光標記四種不同的dNTP，當DNA聚合酶合成互補鏈時，每添加一種dNTP就會釋放出不同的熒光，根據捕捉的熒光信號(例如Illumina測序平臺)，或者通過半導體測序芯片捕捉DNA合成過程中的H+變化(例如Lifeiontorrent測序平臺)，并經過特定的計算機軟件處理，從而獲得待測DNA的序列信息，一次對幾十萬到幾百萬條核酸分子進行序列測定,又被稱為下一代測序技術(nextgenerationsequencing，NGS)。該技術的最大優勢在于其高通量，可以同時對多個樣本進行并行測序，除已知突變外還能發現未知突變，檢測靈敏度大約在1-5％左右。高通量測序的檢測流程一般包括DNA提取與純化、構建文庫、測序模板制備、測序、生物信息分析環節。但是，現有技術存在以下缺陷：直接測序法。直接測序法具有能夠確定突變范圍和類型的優點，但由于sanger測序通量低，以及測序方法本身的限制導致其靈敏度不高，只能對含量大于20％的基因突變進行檢測，遠遠不能滿足實際應用的需要，尤其是對于異質性的腫瘤體細胞突變，低靈敏度將導致大量的漏檢。同時，測序法檢測操作復雜，時效性差，對于要求高時效性和高靈敏度實際應用檢測，測序法的局限性早已凸顯。擴增阻遏突變系統需要采用實時熒光定量PCR檢測技術，每對引物只能檢測一種突變，且每種突變需要單獨建立一個PCR反應體系，同時檢測多個樣本多個檢測位點時操作繁瑣，且該方法需要抽提及純化DNA，對樣本的需要量較大，不適合同時檢測多個基因突變位點，且PCR操作過程易產生氣溶膠污染，帶來假陽性風險。等位基因特異的Taqman聚合酶鏈式反應亦存在同樣的缺點。變性高效液相色譜法及高分辨率溶解曲線法且對于陽性結果并不能確定其具體突變類型，最終還是需要測序驗證。兩種方法的檢測靈敏度在5％左右，不能滿足實際應用的需要。數字PCR技術雖然靈敏度較高，但該技術同樣極易產生假陽性結果，同時由于其操作復雜，對實驗操作的要求極高，此外設備及試劑價格昂貴嚴重限制了其大規模推廣應用。高通量測序技術需要經過DNA提取與純化、構建文庫、測序模板制備、測序數個環節，操作繁瑣，對實驗操作的要求極高。同樣，昂貴的設備及試劑價格嚴重限制了其大規模推廣應用。有鑒于此，特提出本發明。技術實現要素：本發明的第一目的在于提供用于人EGFR基因突變檢測的探針，這些探針由捕獲探針和檢測探針組成，捕獲探針特異性捕獲人EGFR基因的突變位點，檢測探針檢測突變位點旁側序列，進而實現精準檢測的目的。本發明的第二目的在于提供人EGFR基因突變檢測試劑盒，該試劑盒只需少量檢測樣本，檢測過程利用電場作用，加快反應速率，縮短反應時間，整個檢測過程可以在半小時內完成，大大節約檢測所需時間，并且檢測靈敏度和準確率高。為了實現本發明的上述目的，特采用以下技術方案：本發明提供的用于人EGFR基因突變檢測的探針，所述探針包括1-35探針對中的任一種或多種，每個探針對中包括捕獲探針和檢測探針；1-35探針對的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：1-70所示。本發明提供的探針是依據如SEQIDNO：71-91所示的野生型序列和如SEQIDNO：92-126所示的突變型序列依次進行的設計，其中，1-35探針對依次對應于SEQIDNO：92-126所示的突變型序列，而突變型序列為SEQIDNO：92、93、94對應的野生型序列均為如SEQIDNO：71所示；突變型序列為SEQIDNO：96、97、99、100、101、103、116、117、118、121、122、123、125對應的野生型序列均為如SEQIDNO：73所示。其余的突變型序列按序號依次與野生型序列對應。申請人經過大量試驗，兼顧捕獲探針和檢測探針的靈敏度和特異性，最終篩選得到靈敏度和特異性均很好的1-35探針對。1-35探針對依次對應于上述的突變型序列和野生型序列。本發明提供的用于人EGFR基因突變檢測的探針中的1-3探針對是針對EGFR的外顯子18點突變設計，4-28探針對是針對EGFR的外顯子19缺失突變設計，29-33探針對是針對EGFR的外顯子20突變設計，34-35探針對是針對EGFR的外顯子21點突變設計。具體地，1-3探針對的核苷酸序列如SEQIDNO：1-6所示；1探針對中的捕獲探針的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示，檢測探針如SEQIDNO：2所示；2探針對中的捕獲探針的核苷酸序列如SEQIDNO：3所示，檢測探針如SEQIDNO：4所示。相應地，其余探針對以此類推。本發明經多次篩選得到的捕獲探針與檢測探針配合作用，具有靈敏度高，特異性強，能檢測含有目標序列的各類樣本，結果準確可靠。具體地，本發明涉及的序列如表1所示。表1序列本發明采用電信號的變化實現對EGFR基因突變位點的檢測，基于此，進一步地，所述檢測探針上設置有標記物，所述標記物優選為地高辛、生物素、異硫氰酸熒光素標記物中的任一種。這樣，檢測探針與后續添加的帶有對應標記的酶結合，為檢測電信號變化提供基礎。本發明還提供了人EGFR基因突變檢測試劑盒，至少含有上述的探針、酶以及與所述酶對應的底物中的任一種或多種；所述酶上標記有與所述檢測探針上設置的標記物結合的物質。優選地，當檢測探針上的標記物為地高辛或異硫氰酸熒光素(縮寫FITC)時，酶上標記的物質相應的為地高辛抗體或異硫氰酸熒光素抗體；當檢測探針上的標記物為生物素時，酶上標記的物質為親和素。即檢測探針與酶可通過FITC與抗FITC抗體或地高辛與地高辛抗體或親和素如鏈霉親和素與生物素結合等的方式進行結合。優選地，所述酶為辣根過氧化物酶聚合物(縮寫Poly-HRP)或堿性磷酸酶；當所述酶為辣根過氧化物酶聚合物時，底物為TMB與H2O2的混合物、鄰苯二胺(O-phenylenediamine，OPD)、ABTS[2,2'-azino-di-(3-ethylbenziazobinesulfonate-6)]、3-(4-羥基)中的任一種；其中，OPD氧化后的產物為深桔黃色或棕色，ABTS反應產物呈藍綠色。當所述酶為堿性磷酸酶時，底物為對硝基苯磷酸鹽(p-nitropheny—phosphatedisodiumsalt，pNPP)、BCIP和NBT的組合物、4-硝基苯磷酸二鈉、萘酚AS-BI磷酸鹽、萘酚-AS-MX-磷酸鹽中的任一種。其中，pNPP在堿性磷酸酶的作用下生成黃色水溶性反應產物；BCIP和NBT是堿性磷酸酶最佳的發色底物組合之一，產物為深藍色；4-硝基苯磷酸二鈉，產物為黃色可溶性；萘酚AS-BI磷酸鹽，產物為紅色不溶性；萘酚-AS-MX-磷酸鹽，產物為紅色不溶性。本發明提供的EGFR基因突變檢測試劑盒，為EGFR基因突變的檢測提供便捷。為了更便于檢測，優選地，所述試劑盒還包括用于將所述捕獲探針固定的固定物、雜交buffer、封閉蛋白、PBS、清洗液、檢測孔板。其中檢測孔板的具體結構如申請號為201620769829.2公開的名稱為檢測電極以及檢測孔板中的檢測孔板所示。進一步地，所述封閉蛋白為酪蛋白、胎牛血清、小牛血清中的任一種。本發明提供的試劑盒中的各物質可以單獨存在，也可以以混合液的形式存在。進一步地，所述固定物包括導電聚合物材料和鹽離子化合物；所述導電聚合物材料為苯胺、噻吩和吡咯導電分子單體中的任一種；所述鹽離子化合物為氯化鹽、硝酸鹽、硫酸鹽中的任一種。其中，鹽可以為鈉、鉀、鎂、銨等等；如氯化鹽可以為氯化鈉、氯化鉀、氯化鎂、氯化銨等，同樣地，硝酸鹽可以為硝酸鈉、硝酸鉀、硝酸鎂、硝酸銨等，硫酸鹽可以為硫酸鈉、硫酸鉀、硫酸鎂、硫酸銨等等。本發明提供的EGFR基因突變檢測試劑盒用于檢測時，第一步通過電場條件下發生聚合反應而將捕獲探針固定于檢測孔板上，為后續檢測提供基礎。因此，為了便于檢測操作，優選地，所述捕獲探針與所述固定物以捕獲溶液的形式存在，所述捕獲溶液含有以下成分：導電聚合物材料的體積百分數為0.1％～5％，鹽離子化合物的濃度為0.01mol/L～2mol/L，捕獲探針的濃度為0.5-1.5μmol/L。即在檢測進行時，直接將捕獲溶液添加到檢測孔板的反應孔中即可，一般來說，96孔的檢測孔板中，每個反應孔的體積為300μl左右，加入20-80μl捕獲溶液都可。捕獲溶液添加至檢測孔板的反應孔中后，進行電場處理，使得捕獲溶液中的成分固定于檢測孔板的反應孔中，以利于后續反應的進行。為了提高檢測的便捷性，進一步地，所述捕獲探針與所述固定物附著于所述檢測孔板存在；具體采用以下方法制備：將所述捕獲溶液添加到所述檢測孔板的反應孔中，然后于電場處理后清洗即可。清洗時，程序為：從底部清洗程序：邊注液邊吸液；從上往下清洗程序：先注液，再吸液；重復一次上述步驟。清洗后加入待測樣本與雜交buffer的混合液，其中，雜交buffer于85-95℃水浴中處理5-15min，然后放置冷卻至室溫，與待檢測樣本以體積比為1:1.5-2.5混勻，然后取20-80μl加入檢測孔板的反應孔中，進行電場處理，然后采用與上述相同的清洗步驟進行清洗。本發明中的雜交buffer為探針的雜交提供良好的環境，任何實現該功能的雜交buffer均在本發明的保護范圍內。如所用的雜交buffer可以為以下中的任一種；雜交buffer1：含有Ficoll4001g/L，PVP3601g/L，BSA1g/L，NaH2PO480mM，Na2HPO4420mM，EDTA2.5mM，SDS6g/L，NaCl43.8g/L，二水檸檬酸鈉36.9g/L，pH為7-8；該buffer在使用前先加熱至65℃。雜交buffer2：該溶液中，20×SSC的體積百分數為10％，100×Denhardt的體積百分數為5％，DenaturedsalmonDNA的質量濃度為0.1mg/ml，甲酰胺的體積百分數為40％；雜交buffer3：50％甲酰胺，2×SSC，10％硫酸葡聚糖(pH為7)；雜交buffer4：1.5MNaCl，40mMpH7.2的磷酸鈉緩沖液，10mMEDTApH8，10×Denhardt's溶液，0.2％SDS；雜交buffer5：20-100nMTris-HCl，20-200nMMgCl2，0.01％-5％硫酸葡聚糖；雜交buffer6：5×SSC，1％封閉蛋白，0.1％N-月桂酰肌氨酸，0.02％SDS；雜交buffer7：0.5M磷酸二氫鈉，pH為7.5；10mMEDTA，7％SDS。上述雜交buffer中的百分數均指質量百分含量，各組分的含量也均為各組分在整個溶液中的終濃度。另外，本發明上述的雜交buffer中各組分的含量，可以有小幅度變動，這種變動也在本發明的保護范圍內。進一步地，所述檢測探針以檢測溶液的形式存在；所述檢測溶液是以PBS作為溶劑，其中封閉蛋白的重量百分數為0.1％～5％，檢測探針的濃度為0.5-1.5μmol/L。檢測溶液中封閉蛋白如酪蛋白的作用是封閉檢測物中非特異性位點，以提高檢測的靈敏性和準確度。進一步地，檢測溶液20-80μl添加至檢測孔板的反應孔中，電場處理，然后采用與上述相同的清洗步驟進行清洗。進一步地，所述酶是以酶液的形式存在；所述酶液是以PBS作為溶劑，其中封閉蛋白的重量百分數為0.1％～5％，酶的體積百分數為0.05％～0.2％。為了封閉檢測物中非特異性位點，提高檢測的靈敏性和準確度，酶液中也含有封閉蛋白。相應地，酶液的添加量為20-80μl，室溫孵育20-40min，檢測孔板進行清洗，清洗程序比上述清洗程序多一次重復。進一步地，所述清洗液包括含有質量濃度為0.04％-0.06％SDS的0.1×SSC-2×SSC混合液和含有體積百分數為0.05％-0.15％Tween20的PBS溶液。PBST(0.1％Tween20)1L:949ml的雙蒸水中加入50ml的20×PBS，混勻，加入1ml的Tween20，混勻。本發明中采用兩種清洗液，在加入酶液之前的步驟均是采用質量濃度為0.04％-0.06％SDS的0.1×SSC-2×SSC混合液進行清洗，而由于加入酶后用PBST洗。通過清洗，把非特異性的結合以及其他未反應的成分去除，提高檢測的準確性。另外，本發明上述的混合液均是工作液的濃度，然而根據需求也可以按上述工作液的濃度的數倍先配成母液，在使用時再相應的稀釋即可。因此，相應濃度的母液也在本發明的保護范圍內。其中，20×PBS1L配方為：磷酸二氫鉀：5.4g，磷酸氫二鈉：28.4g，氯化鈉：160g，氯化鉀4g，加去離子水約800mL充分攪拌溶解，然后加入濃鹽酸調pH至7.4，最后定容到1L。相應地，PBS即為1×PBS，將20×PBS稀釋20倍即可。清洗液也一般是先配置高濃度的SSC和SDS，再進行相應的稀釋即可。本發明提供的人EGFR基因突變檢測試劑盒，與現有技術相比，兼具精準可靠、快速便捷、經濟的明顯優勢，利于反復多次取樣檢測，使用范圍廣，取樣對人體無損傷，是理想的液體活檢產品。本發明還提供了一種檢測人EGFR基因突變的方法，包括以下步驟：將上述的捕獲溶液加入到檢測孔板中，電場處理3-10個循環，電場處理的程序為：電壓200-500mV，1-5s；電壓800-1500mV，1-5s；電場處理完畢后采用所述質量濃度為0.04％-0.06％SDS的2×SSC混合液清洗，然后加入待測樣本與雜交buffer的混合溶液，電場處理3-10個循環，電場處理的程序為：電壓200-500mV，1-5s；電壓300-800mV，1-5s；檢測孔板清洗，然后加入上述的檢測溶液，電場處理3-8個循環，電場處理的程序為：電壓200-500mV，1-5s；電壓300-800mV，1-5s；檢測孔板清洗，然后加入上述的酶液，孵育后清洗；加入底物，在電壓為-100～-300mV的電場處理下讀數，得到電流值。優選地，所述待測樣本為體液，所述體液包括但不限于血漿、唾液、胸腔積液。本發明提供的檢測人EGFR基因突變的方法，捕獲溶液加入檢測孔板，在電場作用下發生聚合反應，將捕獲探針固定在板底；然后加入檢測樣本，捕獲探針捕獲目標基因突變樣本；加入檢測溶液，生物素標記的檢測探針檢測突變位點旁側序列；加入酶液，酶通過其標記的親和素與檢測探針的生物素識別并結合；加入酶的底物，發生氧化還原反應，產生電流，檢測電流信號即完成整個檢測過程。與現有技術相比，本發明的有益效果為：(1)操作簡便快速現有技術都是基于PCR技術，首先需要從標本中提取及純化DNA，然后需要對DNA樣本進行PCR擴增，NGS更是要經過DNA提取與純化、構建文庫、測序模板制備、測序等環節，操作步驟繁雜，對操作的要求極高。因此，臨床上如果采用ARMS-PCR、數字PCR技術需要1-3天才能出報告，采用NGS技術更是需要1-2周才能出報告，對于需要爭分奪秒采取恰當治療措施的腫瘤疾病來說，這樣的報告周期嚴重制約其在臨床的應用。本發明提供的試劑盒通過電場誘導釋放和測量(EFIRM)檢測外體生物標志物，用于液體活檢時，只需少量患者體液樣本，比如抽取1ml病人的外周靜脈血或采集患者少量唾液，樣本不需要DNA提取和擴增，只需將約50μl待測血漿或唾液樣本與檢測試劑加入檢測孔板的相應反應孔當中，再將檢測孔板放入申請號為201610658321.X公開的保持結構及包括保持結構的檢測儀中的檢測儀(即EFIRM儀)進行電場處理和電信號的檢測即可。檢測過程利用電場作用，加快反應速率，縮短反應時間，整個檢測過程可以在半小時內完成，大大縮短了檢測時間。(2)高靈敏度與準確率ARMS的靈敏度大約在1％左右，NGS如果采用PCR擴增子測序或捕獲測序靈敏度大約在1-5％左右，靈敏度最高的為數字PCR，大約在0.1％左右。本發明采用EFIRM技術檢測ctDNA的靈敏度可以達0.1％，與數字PCR相當，達到目前ctDNA檢測技術的先進水平。在準確率方面，由于ctDNA具有嚴重碎片化(平均長度僅為166bp)、含量低(占外周血游離DNA的比例不到1％)、半衰期短(約2小時)等特性，因此對檢測技術的要求極高，目前市場上商品化的ctDNA檢測試劑中，基于ARMS-PCR技術的產品準確率一般在60-70％左右，與臨床需求相去甚遠，因而嚴重制約了其臨床應用。本發明提供的人EGFR基因突變檢測試劑盒在臨床預試驗中，與組織活檢結果對照準確率超過95％，同期采用數字PCR技術的準確率只有70％左右，因此，準確率明顯優于現有市場上的產品。(3)成本低廉首先，在檢測設備方面，目前無論是ARMS-PCR還是數字PCR都采用熒光信號檢測，檢測設備需配備昂貴的熒光檢測系統，因此ARMS-PCR技術使用的熒光定量PCR儀市場售價都在數十萬元左右，而數字PCR儀更達100多萬元。至于NGS技術所使用的高通量測序儀，無論是以illumina為代表的光學測序或以ionproton為代表的半導體測序系統，市場售價更高達數百萬元，高昂的價格嚴重制約了其在臨床的推廣應用。與之相比，本發明采用電場引導的釋放與測量技術，檢測過程利用電場作用，反應快速，最終結果以電信號的形式檢測，因此檢測設備不像ARMS-PCR及數字PCR那樣配備昂貴的熒光檢測系統，因而設備的成本大幅降低，僅相當于熒光定量PCR儀的一半左右，更不及高通量測序儀的十分之一。其次，在檢測試劑方面，EFIRM技術基于核酸雜交的原理，采用獨特設計的電化學技術，檢測用的探針無需像ARMS-PCR那樣進行熒光標記，并且由于節省了DNA提取與純化的步驟，因此檢測試劑成本與之相比大幅降低。與NGS需要經過DNA提取與純化、構建文庫、測序模板制備、測序數個環節，使用多個配套試劑盒相比，EFIRM的試劑成本更是節約了90％以上，競爭優勢明顯。(4)大幅降低對臨床客戶硬件及人員的要求由于采用EFIRM不需要DNA提取和PCR擴增，因而不存PCR容易污染的問題，在臨床使用時無需建立臨床基因擴增實驗室，操作人員亦不需要獲得臨床基因擴增的上崗許可，可以由一般技術人員操作，使得液體活檢技術在臨床推廣應用的門檻大大降低，利于液體活檢技術大范圍的推廣，擺脫現有ARMS-PCR、數字PCR、NGS技術只能在少數具備條件的大型三甲醫院開展的現狀。具體實施方式下面將結合實施例對本發明的實施方案進行詳細描述，但是本領域技術人員將會理解，下列實施例僅用于說明本發明，而不應視為限制本發明的范圍。實施例中未注明具體條件者，按照常規條件或制造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未注明生產廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規產品。實施例1對不同檢測樣本分別采用以下步驟進行檢測：1、捕獲探針固定在檢測孔板的板底1.1pyrrole與捕獲探針(簡稱CP)的混合液配制：取1個1.5ml離心管，依次加入超純水885μl，100μl3MKCl，渦旋震蕩混勻，離心；加入5μlpyrrole，渦旋震蕩混勻，離心；加入100μM捕獲探針10μl；渦旋震蕩混勻后離心，備用。1.2加樣：在96孔的檢測孔板上，每個孔加入30μl的已配制好的混合液，加樣時槍頭貼近孔的底部，但是不接觸到底部電極，加完后傾斜或拍打檢測孔板使液體在孔里的電極表面均勻覆蓋，然后立刻到EFIRM檢測儀上進行電場操作。1.3EFIRM電場處理：在EFIRM軟件上選擇進行實驗的對應列，電場參數設置為：電壓A：350mV，1s；電壓B:950mV，1s；進行5個循環。電場處理完畢，立刻取出，清洗檢測孔板。1.4檢測孔板清洗：在洗板機程序上選擇對應的實驗列，清洗程序選擇(2bottom，2top)，洗液選擇2×SSC(0.05％SDS)。清洗完畢，立刻進行下一步樣本上樣操作。2、樣本雜交：2.1雜交buffer預處理雜交buffer(使用
發明內容中的雜交buffer1)在水浴鍋中90℃水浴處理10min，然后室溫放置冷卻20min。2.2樣本的配制樣本從-20℃冰箱取出，放進4℃冰箱解凍。完全溶解后，樣本與雜交buffer按體積比1:2混合，渦旋振蕩后離心，即可上樣進行檢測。2.3加樣：在檢測孔板上，在對應的孔里加入空白對照buffer、相應濃度的陰性對照(WT)和陽性對照(MT)，上樣量30μl。加樣時槍頭貼近孔的底部，但是不接觸到底部電極，加完后傾斜或拍打檢測孔板使液體在孔里的電極表面均勻覆蓋，然后立刻到EFIRM上進行電場操作。2.4EFIRM電場處理：在EFIRM軟件上選擇進行實驗的對應列，電場參數設置為：電壓A：300mV，1s；電壓B:500mV，1s；進行5個循環。電場處理完畢，立刻取出，清洗檢測孔板。2.5檢測孔板清洗：在洗板機程序上選擇對應的實驗列，清洗程序選擇(2bottom，2top)，洗液選擇2×SSC(0.05％SDS)。清洗完畢，立刻進行DP加樣操作。3、檢測雜交3.1DP(檢測探針)溶液配制：從4℃冰箱取出酪蛋白的重量百分數為2％的casein/PBS溶液，取1個1.5mL離心管，加入990μl的casein/PBS，加入100μM的DP10μl，渦旋震蕩混勻，離心，備用。3.2加樣：根據實驗設計在對應的孔加入對應DP溶液30μl，加樣時槍頭貼近孔的底部，但是不接觸到底部電極，加完后傾斜或拍打檢測孔板使液體在孔里的電極表面均勻覆蓋，然后立刻到EFIRM上進行電場操作。3.3EFIRM電場處理：在EFIRM軟件上選擇進行實驗的對應列，電場參數設置為：電壓A：300mV，1s；電壓B:500mV，1s；進行5個循環。電場處理完畢，立刻取出，清洗檢測孔板。3.4檢測孔板清洗：在洗板機程序上選擇對應的實驗列，清洗程序選擇(2bottom，2top)，洗液選擇2×SSC(0.05％SDS)。清洗完畢，立刻進行加樣操作。4、ReporterHybridization4.1Poly-HRP溶液配制：從4℃冰箱取出酪蛋白的重量百分數為2％的casein/PBS溶液，取1個1.5mL離心管，加入999μl的casein/PBS(把casein/PBS溶液放回4℃冰箱)，加入1μl的poly-HRP(購自thermofisher，產品名稱為PierceTMStreptavidinPoly-HRP，貨號為21140，單位規格為0.5mL)，渦旋震蕩混勻，離心，備用。4.2加樣：根據實驗設計在對應的孔加入Poly-HRP溶液30μl，加樣時槍頭貼近孔的底部，但是不接觸到底部電極，加完后傾斜或拍打檢測孔板使液體在孔里的電極表面均勻覆蓋，然后蓋上檢測孔板蓋子，實驗臺上室溫孵育30min，計時器倒數計時。孵育時間到，立刻清洗檢測孔板。4.3檢測孔板清洗：在洗板機程序上選擇對應的實驗列，清洗程序選擇(3bottom，3top)，洗液選擇PBST(0.1％Tween20)。清洗完畢，立刻進行TMB加樣操作。5、Readout5.1加樣：根據實驗設計在對應的孔加入TMB/H2O2溶液(購自thermofisher,產品貨號為34022，名稱為TurboTMB底物溶液)，每個孔加入60μl，加樣時槍頭貼近孔的底部，但是不接觸到底部電極。加完立刻到EFIRM上進行電場操作。5.2EFIRM電場讀數：在EFIRM軟件上選擇進行實驗的對應列，電場參數設置為：電壓A：-200mV，60s，得到電流讀數。本實施例中，不同檢測樣本包括陰性組和陽性組，陰性組測定的基因為相應的野生型序列，陽性組測定的基因為相應的突變型序列，每個樣本設置20個平行孔進行檢測。相應地，每組的陰性組(WT)和陽性組(MT)采用相應的探針對進行檢測，以鑒定其檢測的穩定性，檢測的電流的變異系數(CV)結果如表2所示。表2中，變異系數cv(coefficientofvariation)，亦稱離散系數(coefficientofdispersion)或相對偏差(rsd)，是標準偏差與平均值之比，用百分數表示，計算公式為：cv＝sd/mean×100％。表2檢測結果其中，表2與表1中的探針對依次對應。從表2可以看出，本發明提供的人EGFR基因突變檢測試劑盒以及使用該試劑盒檢測人EGFR基因突變，可檢測低至1pM的序列含量的樣本，檢測靈敏度高；檢測得到的數值的變動范圍均在15％以下，有的甚至低至3％左右，檢測穩定性好。此外，檢測不同濃度的陰性樣品和陽性樣本，其檢測得到的數值均有很好的線性關系。另外，對系列濃度梯度的野生型序列樣本和突變型序列樣品，進行3次獨立測試，每次樣品測試20個復孔，野生樣品測得的數值結果判讀為野生則為符合，反之為不符合；突變樣品測得的數值結果判讀為突變則為符合，反之亦反，具體結果如表3所示。表3符合率另外，采用本實施例的方法對臨床上已經確認基因突變類型的190例的唾液樣本(突變70例，野生120例)、220例血漿樣本(突變85例，野生135例)和200例胸腔積液樣本(突變90例，野生110例)對不同的探針對進行雙盲測試，測試結果與臨床檢測結果進行對比，檢測結果見表4。表4檢測結果樣本陽性符合率陰性符合率血漿98.8％100％唾液98.6％100％胸腔積液98.9％100％另外，對不同樣本的檢測數據如表5-7所示。表5唾液樣本的具體檢測情況表6血漿樣本的具體檢測情況表7胸腔積液樣本的具體檢測情況其中，表4中的陽性符合率和陰性符合率的計算公式如表8所示。表8樣本統計陽性符合率＝a/(a+c)×100％；陰性符合率＝b/(b+d)×100％。從表4-7可以看出，不論是血漿樣本還是唾液樣本還是胸腔積液樣本均有較好的臨床檢測符合率，準確率高，超過95％以上，滿足臨床檢測應用的需求。上述方法對陰性樣本和陽性樣本進行檢測時，檢測得到的電流值差異大，能很好的區分不同的樣本。如對唾液的陰性樣本采用34探針對進行檢測，得到的電流值在41.6～65.6(-nA)，而陽性樣本的電流值在88.4～141.4(-nA)；相應地，對同樣的血漿樣本，陰性樣本得到的電流值在40.1～63.7(-nA)，而陽性樣本的電流值在83.6～139.2。另外，改變試劑盒中的各組分的濃度，進行檢測，結果同上述結果基本一致。綜上可知，本發明提供的人EGFR基因突變檢測試劑盒以及使用該試劑盒檢測人EGFR基因突變，操作簡便，樣本無創，并且所需樣本少，整個檢測過程可以在半小時內完成；具有靈敏性好，可以達0.1％，準確率高，超過95％以上；成本低，與NGS相比，成本節約90％以上；易于操作，對操作人員要求低。實施例2對待檢測樣本進行檢測，具體步驟如下：1、捕獲探針固定在檢測孔板的板底1.1pyrrole與捕獲探針(簡稱CP)的混合液配制：捕獲溶液含有以下成分：噻吩的重量百分數為5％，NaCl的濃度為2mol/L，捕獲探針的濃度為1.5μmol/L。1.2加樣：在96孔的檢測孔板上，每個孔加入20μl的已配制好的pyrrole與CP混合液，加樣時槍頭貼近孔的底部，但是不接觸到底部電極，加完后傾斜或拍打檢測孔板使液體在孔里的電極表面均勻覆蓋，然后立刻到EFIRM檢測儀上進行電場操作。1.3EFIRM電場處理：在EFIRM軟件上選擇進行實驗的對應列，電場參數設置為：電壓A：500mV，1s；電壓B:1500mV，1s；進行10個循環。電場處理完畢，立刻取出，清洗檢測孔板。1.4檢測孔板清洗：在洗板機程序上選擇對應的實驗列，清洗程序選擇(2bottom，2top)，洗液選擇2XSSC(0.06％SDS)。清洗完畢，立刻進行下一步樣本上樣操作。2、樣本雜交：2.1雜交buffer預處理雜交buffer(使用
發明內容中的雜交buffer3)在水浴鍋中95℃水浴處理5min，然后室溫放置冷卻。2.2樣本的配制樣本從-20℃冰箱取出，放進4℃冰箱解凍。完全溶解后，樣本與雜交buffer按體積比1:2.5混合，渦旋振蕩后離心，即可上樣進行檢測。2.3加樣：在檢測孔板上，在對應的孔里加入空白對照buffer、相應濃度的陰性對照(WT)和陽性對照(MT)，上樣量80μl。加樣時槍頭貼近孔的底部，但是不接觸到底部電極，加完后傾斜或拍打檢測孔板使液體在孔里的電極表面均勻覆蓋，然后立刻到EFIRM上進行電場操作。2.4EFIRM電場處理：在EFIRM軟件上選擇進行實驗的對應列，電場參數設置為：電壓A：500mV，1s；電壓B:800mV，1s；進行10個循環。電場處理完畢，立刻取出，清洗檢測孔板。2.5檢測孔板清洗：在洗板機程序上選擇對應的實驗列，清洗程序選擇(2bottom，2top)，洗液選擇2XSSC(0.06％SDS)。清洗完畢，立刻進行DP加樣操作。3、檢測雜交3.1DP(檢測探針)溶液配制：檢測溶液是以PBS作為溶劑，其中酪蛋白的重量百分數為5％，檢測探針的濃度為1.5μmol/L，渦旋震蕩混勻，離心，備用。3.2加樣：根據實驗設計在對應的孔加入對應DP溶液20μl，加樣時槍頭貼近孔的底部，但是不接觸到底部電極，加完后傾斜或拍打檢測孔板使液體在孔里的電極表面均勻覆蓋，然后立刻到EFIRM上進行電場操作。3.3EFIRM電場處理：在EFIRM軟件上選擇進行實驗的對應列，電場參數設置為：電壓A：500mV，1s；電壓B:800mV，1s；進行8個循環。電場處理完畢，立刻取出，清洗檢測孔板。3.4檢測孔板清洗：在洗板機程序上選擇對應的實驗列，清洗程序選擇(2bottom，2top)，洗液選擇2XSSC(0.06％SDS)。清洗完畢，立刻進行加樣操作。4、ReporterHybridization4.1Poly-HRP溶液配制：以PBS作為溶劑，其中酪蛋白的重量百分數為5％，poly-HRP的體積百分數為0.2％(購自thermofisher，產品名稱為PierceTMStreptavidinPoly-HRP，貨號為21140，單位規格為0.5mL)，渦旋震蕩混勻，離心，備用。4.2加樣：根據實驗設計在對應的孔加入Poly-HRP溶液20μl，加樣時槍頭貼近孔的底部，但是不接觸到底部電極，加完后傾斜或拍打檢測孔板使液體在孔里的電極表面均勻覆蓋，然后蓋上檢測孔板蓋子，實驗臺上室溫孵育40min，計時器倒數計時。孵育時間到，立刻清洗檢測孔板。4.3檢測孔板清洗：在洗板機程序上選擇對應的實驗列，清洗程序選擇(3bottom，3top)，洗液選擇PBST(0.15％Tween20)。清洗完畢，立刻進行TMB加樣操作。5、Readout5.1加樣：根據實驗設計在對應的孔加入TMB/H2O2溶液(購自thermofisher,產品貨號為34022，名稱為TurboTMB底物溶液)，每個孔加入80μl，加樣時槍頭貼近孔的底部，但是不接觸到底部電極。加完立刻到EFIRM上進行電場操作。5.2EFIRM電場讀數：在EFIRM軟件上選擇進行實驗的對應列，電場參數設置為：電壓A：-300mV，100s，得到電流讀數。實施例3對待檢測樣本進行檢測，具體步驟如下：1、捕獲探針固定在檢測孔板的板底1.1pyrrole與捕獲探針(簡稱CP)的混合液配制：捕獲溶液含有以下成分：苯胺的重量百分數為0.1％，NaCl的濃度為0.01mol/L，捕獲探針的濃度為0.5μmol/L。1.2加樣：在96孔的檢測孔板上，每個孔加入80μl的已配制好的pyrrole與CP混合液，加樣時槍頭貼近孔的底部，但是不接觸到底部電極，加完后傾斜或拍打檢測孔板使液體在孔里的電極表面均勻覆蓋，然后立刻到EFIRM檢測儀上進行電場操作。1.3EFIRM電場處理：在EFIRM軟件上選擇進行實驗的對應列，電場參數設置為：電壓A：200mV，5s；電壓B:800mV，5s；進行3個循環。電場處理完畢，立刻取出，清洗檢測孔板。1.4檢測孔板清洗：在洗板機程序上選擇對應的實驗列，清洗程序選擇(2bottom，2top)，洗液選擇2XSSC(0.04％SDS)。清洗完畢，立刻進行下一步樣本上樣操作。2、樣本雜交：2.1雜交buffer預處理雜交buffer(使用
發明內容中的雜交buffer6)在水浴鍋中85℃水浴處理15min，然后室溫放置冷卻。2.2樣本的配制樣本從-20℃冰箱取出，放進4℃冰箱解凍。完全溶解后，樣本與雜交buffer按體積比1:1.5混合，渦旋振蕩后離心，即可上樣進行檢測。2.3加樣：在檢測孔板上，在對應的孔里加入空白對照buffer、相應濃度的陰性對照(WT)和陽性對照(MT)，上樣量20μl。加樣時槍頭貼近孔的底部，但是不接觸到底部電極，加完后傾斜或拍打檢測孔板使液體在孔里的電極表面均勻覆蓋，然后立刻到EFIRM上進行電場操作。2.4EFIRM電場處理：在EFIRM軟件上選擇進行實驗的對應列，電場參數設置為：電壓A：200mV，5s；電壓B:300mV，5s；進行3個循環。電場處理完畢，立刻取出，清洗檢測孔板。2.5檢測孔板清洗：在洗板機程序上選擇對應的實驗列，清洗程序選擇(2bottom，2top)，洗液選擇2XSSC(0.04％SDS)。清洗完畢，立刻進行DP加樣操作。3、檢測雜交3.1DP(檢測探針)溶液配制：檢測溶液是以PBS作為溶劑，其中酪蛋白的重量百分數為0.1％，檢測探針的濃度為0.5μmol/L，渦旋震蕩混勻，離心，備用。3.2加樣：根據實驗設計在對應的孔加入對應DP溶液30μl，加樣時槍頭貼近孔的底部，但是不接觸到底部電極，加完后傾斜或拍打檢測孔板使液體在孔里的電極表面均勻覆蓋，然后立刻到EFIRM上進行電場操作。3.3EFIRM電場處理：在EFIRM軟件上選擇進行實驗的對應列，電場參數設置為：電壓A：200mV，5s；電壓B:300mV，5s；進行3個循環。電場處理完畢，立刻取出，清洗檢測孔板。3.4檢測孔板清洗：在洗板機程序上選擇對應的實驗列，清洗程序選擇(2bottom，2top)，洗液選擇2XSSC(0.04％SDS)。清洗完畢，立刻進行加樣操作。4、ReporterHybridization4.1Poly-HRP溶液配制：以PBS作為溶劑，其中酪蛋白的重量百分數為0.1％，poly-HRP的體積百分數為0.05％(購自thermofisher，產品名稱為PierceTMStreptavidinPoly-HRP，貨號為21140，單位規格為0.5mL)，渦旋震蕩混勻，離心，備用。4.2加樣：根據實驗設計在對應的孔加入Poly-HRP溶液20-80μl，加樣時槍頭貼近孔的底部，但是不接觸到底部電極，加完后傾斜或拍打檢測孔板使液體在孔里的電極表面均勻覆蓋，然后蓋上檢測孔板蓋子，實驗臺上室溫孵育20-40min，計時器倒數計時。孵育時間到，立刻清洗檢測孔板。4.3檢測孔板清洗：在洗板機程序上選擇對應的實驗列，清洗程序選擇(3bottom，3top)，洗液選擇PBST(0.05％Tween20)。清洗完畢，立刻進行TMB加樣操作。5、Readout5.1加樣：根據實驗設計在對應的孔加入TMB/H2O2溶液(購自thermofisher,產品貨號為34022，名稱為TurboTMB底物溶液)，每個孔加入30μl，加樣時槍頭貼近孔的底部，但是不接觸到底部電極。加完立刻到EFIRM上進行電場操作。5.2EFIRM電場讀數：在EFIRM軟件上選擇進行實驗的對應列，電場參數設置為：電壓A：-100mV，40s，得到電流讀數。同樣地，采用本發明實施例2和3提供的方法與實施例1相同的方式進行檢測，得到的結果與實施例1結果基本一致。可見，本發明提供的人EGFR基因突變檢測試劑盒以及使用該試劑盒檢測人EGFR基因突變，操作簡便，樣本無創，并且所需樣本少，整個檢測過程可以在半小時內完成；具有靈敏性好，可以達0.1％，準確率高，超過95％以上；成本低，與NGS相比，成本節約90％以上；易于操作，對操作人員要求低。盡管已用具體實施例來說明和描述了本發明，然而應意識到，在不背離本發明的精神和范圍的情況下可以作出許多其它的更改和修改。因此，這意味著在所附權利要求中包括屬于本發明范圍內的所有這些變化和修改。當前第1頁1 2 3