一種以重組粘質沙雷氏菌為菌種生產d-乳酸的方法
【專利摘要】本發明涉及一種以重組粘質沙雷氏菌為菌種生產D-乳酸的方法。首次以粘質沙雷氏菌為出發菌株，開發出一種可生產高純度D-乳酸的基因工程菌，該基因工程菌不表達乙酰乳酸合成酶。本發明的基因工程菌可高效地生產D-乳酸，產物中L-乳酸含量極低。本發明還提供了該基因工程菌的構建方法，以及優化的生產D-乳酸的方法。
【專利說明】一種以重組粘質沙雷氏菌為菌種生產D-乳酸的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物【技術領域】，具體涉及一種以重組粘質沙雷氏菌為菌種生產D-乳酸的方法。
【背景技術】
[0002]乳酸(Lacticacid, LA),又稱 2_ 羥基丙酸(2-Hydroxy propionic acid)、α-輕基丙酸、丙醇酸，是無氧條件下糖酵解的最終產物，由乳酸脫氫酶作用于丙酮酸和NADH而生成。
[0003]乳酸是世界三大有機酸之一(其它兩個為乙酸和丙酮酸)，其用途極為廣泛。在食品、醫藥、化妝品、化工等領域都有運用。乳酸的一些衍生物如乳酸酯和乳酸鹽等也經常在不同的行業中被用到。光學純度在97%以上的D-乳酸即可被視為高光學純度的D-乳酸，它是多個手性物質的前體，是一個重要的有機合成原料。在農藥領域中被用于合成高效低毒的殺蟲劑和除草劑，醫藥和化妝品上也用D-乳酸來合成某些手性物質，具有良好的經濟和社會價值。
[0004]乳酸的工業化生產已有100多年的歷史了，自從1886年德國學者Leichmann分離得到德氏乳桿菌(Ltobacillusdetbruckii)后，極大的推動了乳酸的工業生產由化學合成法向微生物發酵法的轉變。德氏乳桿菌是一株極為優秀的乳酸菌，它可以在50°C下將麥芽汁發酵轉化為乳酸。實際上由發酵法得到的乳酸種類主要是由菌種決定的，因菌種不同，發酵后可獲得L-乳酸、D-乳酸或消旋體乳酸。L-乳酸的研究步伐開始的較早，目前發酵生產L-乳酸的工藝條件已研究的十分清楚。與L-乳酸相比，D-乳酸除旋光性不同之外其它理化性質都和L-乳酸沒有明顯差別。因此，現在工業上D-乳酸的生產主要是借鑒L-乳酸已成熟的工藝，其關鍵則是在于篩選培育高純度D-乳酸生產菌種。
[0005]因此，本領域有必要培育高純度D-乳酸生產菌種，以應用于工業化生產。
【發明內容】
[0006]本發明的目的在于提供一種以重組粘質沙雷氏菌為菌種生產D-乳酸的方法。
[0007]在本發明的第一方面，提供一種應用重組粘質沙雷氏菌生產D-乳酸的方法，包括:
[0008](I)提供重組粘質沙雷氏菌，該菌株中乙酰乳酸合成酶不表達(包括低表達)；
[0009](2)培養⑴的重組粘質沙雷氏菌，從而生產D-乳酸。
[0010]在一個優選例中，步驟(1)中，所述的重組粘質沙雷氏菌的基因組中，含有突變的乙酰乳酸合成酶基因序列，其不編碼乙酰乳酸合成酶。
[0011]在另一優選例中，所述的重組粘質沙雷氏菌如下制備:
[0012](I)提供一打靶質粒，所述的打靶質粒中，含有乙酰乳酸合成酶基因第43bp_534位序列；
[0013](2)將(I)所述的打靶質粒轉入粘質沙雷氏菌內，通過同源交換使得粘質沙雷氏菌基因組上的乙酰乳酸合成酶基因失活；
[0014](3)選擇發生了同源交換的粘質沙雷氏菌，獲得重組粘質沙雷氏菌。
[0015]在另一優選例中，所述的同源交換方法是:將α-乙酰乳酸合成酶基因全長1686bp，將位于該基因43bp-534bp之間的片段克隆到pUTKm上，該質粒轉入到粘質沙雷氏菌中之后，上面的α -乙酰乳酸合成酶基因片段會與粘質沙雷氏菌基因組上的α-乙酰乳酸合成酶基因的同源部分發生交換，從而截斷該基因，不能正常表達有活性的酶，從而粘質沙雷氏菌失去了合成2，3- 丁二醇的能力。
[0016]在另一優選例中，步驟(1)和步驟(2)之間，還包括步驟:
[0017]將步驟(1)的重組粘質沙雷氏菌進行馴化培養。
[0018]在另一優選例中，所述的馴化培養方法如下:將重組粘質沙雷氏菌加入到含50±10g/L葡萄糖和50±10g/L乳酸鈉的液體培養基(較佳地為LB培養基)中，在起始pH值 6.0±0.5、28±2°C、200±50rpm 搖床上培養 12±3 小時；
[0019]將經過前述培養的菌液涂布到含50± 10g/L葡萄糖和50± 10g/L乳酸鈉的固體培養基(較佳地為LB培養基)上，在37±1°C下培養24~36小時(較佳地12~15小時)，選擇平板上體積較大的單個菌落。
[0020]在另一優選例中，步驟(2)中，所述的培養重組粘質沙雷氏菌包括:
[0021](a)在有氧、28±2°C (較佳地，28土 1°C )、pH 值為 7.0±0.3 (較佳地，7.0±0.2)的條件下培養重組粘質沙雷 氏菌，至菌體濃度0D_值達到25-40 (較佳地，28-35)；
[0022](b)向發酵培養基中添加葡萄糖使之終濃度為100±20g/L(較佳地，100±10g/U，在無氧、44±2°C (較佳地，44±1°C )、pH值為6.0±0.3(較佳地，6.0±0.2)的條件下，繼續培養36-60小時(較佳地，42-54小時)。
[0023]在另一優選例中，步驟(a)中，在轉速700±200rpm(較佳地，700±100rpm)，通氣量 200 ± 40vvm (較佳地，200 土 20vvm)下培養；
[0024]步驟(b)中，在轉速300± IOOrpm(較佳地，300±50rpm)下培養。
[0025]在另一優選例中，步驟(a)中，發酵培養基成分為:葡萄糖60±10g/L，酵母粉20±4g/L，NaCl 5± lg/L，KH2PO4 5±lg/L，MgSO4 0.5±0.lg/L，MnSO40.05±0.01g/L。
[0026]在本發明的另一方面，提供一種重組粘質沙雷氏菌，該菌株的基因組中所述的重組粘質沙雷氏菌的基因組中，含有突變的乙酰乳酸合成酶基因序列，其不編碼乙酰乳酸合成酶。
[0027]在一個優選例中，所述的重組粘質沙雷氏菌如下制備:
[0028](I)提供一打靶質粒，所述的打靶質粒中，含有乙酰乳酸合成酶基因第43bp_534位序列；
[0029](2)將⑴所述的打靶質粒轉入粘質沙雷氏菌內，通過同源交換使得粘質沙雷氏菌基因組上的乙酰乳酸合成酶基因失活；
[0030](3)選擇發生了同源交換的粘質沙雷氏菌，獲得重組粘質沙雷氏菌。
[0031]本發明的其它方面由于本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。
【專利附圖】
【附圖說明】[0032]圖1、氧對D-乳酸產量和OD6tltl值的影響。
[0033]圖2、溫度對D-乳酸產量和OD6tltl值的影響。
[0034]圖3、pH值對D-乳酸產量和0D_值的影響。
[0035] 圖4、經馴化的菌株與馴化前的菌株的活力比較。
【具體實施方式】
[0036]本發明經過深入的研究，首次以粘質沙雷氏菌為出發菌株，開發出一種可生產高純度D-乳酸的基因工程菌，該基因工程菌的基因組中含有突變的乙酰乳酸合成酶基因序列，其不編碼乙酰乳酸合成酶，因而不表達乙酰乳酸合成酶。本發明的基因工程菌的可高效地生產D-乳酸，產物中L-乳酸含量極低。本發明還提供了該基因工程菌的構建方法，以及優化的生產D-乳酸的方法。
[0037]術語
[0038]如本文所用，所述的“粘質沙雷氏菌”，又稱靈桿菌，屬于腸道桿菌科沙雷氏菌屬，為革蘭氏陰性兼性厭氧桿菌。粘質沙雷氏菌為非苛求性微生物，可利用多種碳源，如殼聚糖、葡萄糖、蔗糖、甘露糖、纖維二糖、檸檬酸甘油等，如此廣泛的碳源譜為其發酵生產提供了有利的條件。
[0039]除非另外說明，本發明中所述的“乙酰乳酸合成酶”是指“ α -乙酰乳酸合成酶”。
[0040]除非另外說明，本發明中所述的“基因工程菌”是指“重組粘質沙雷氏菌”。
[0041]如本文所用，所述的“同源交換”是指由兩條具有同源區的DNA分子，通過配對、鏈的斷裂和再連接，而產生片斷交換(crossing over)的過程。
[0042]如本文所用，所述的“接合轉移”是細菌的基因轉移的一種方式，在細菌的細胞相互接觸時遺傳信息由一個細胞轉移到另一個細胞。
[0043]如本文所用，所述的“不表達乙酰乳酸合成酶的菌株”是指一種菌株，其與相應的野生型菌株(即未突變乙酰乳酸合成酶基因的相同菌株)相比，乙酰乳酸合成酶的表達量(或酶活)降低了 90%以上，更優選地降低了 95%以上，最優選地降低了 97%以上，如降低了98%、99%或100% (即完全不表達乙酰乳酸合成酶)。
[0044]基因工程菌
[0045]本發明人深入研究后發現，通過將粘質沙雷氏菌中乙酰乳酸合成酶失活，可阻斷乙偶姻和2，3- 丁二醇代謝途徑，使碳源主要流向D-乳酸，從而可培育出高產D-乳酸的菌株。
[0046]本發明提供了一種高產D-乳酸的重組粘質沙雷氏菌，所述的重組粘質沙雷氏菌不表達乙酰乳酸合成酶。更特別地，所述的重組粘質沙雷氏菌的基因組中，乙酰乳酸合成酶基因插入失活而不表達。
[0047]乙酰乳酸合成酶是乙偶姻和2，3- 丁二醇代謝途徑相關的一種酶。粘質沙雷氏菌中的乙酰乳酸合成酶GenBank登錄號為JF519737。目前本領域技術人員對于在粘質沙雷氏菌中乙酰乳酸合成酶的表達情況與D-乳酸生產的關系還不清楚。
[0048]阻止乙酰乳酸合成酶表達或活性的方法是多種多樣的，例如可通過特異性結合乙酰乳酸合成酶的抗體或配體來抑制其活性；或利用小RNA分子或反義核苷酸從轉錄水平上抑制乙酰乳酸合成酶表達等等。而本發明人發現，對乙酰乳酸合成酶的編碼基因進行突變是最優選的方式。
[0049]對于乙酰乳酸合成酶的編碼基因進行突變的方法是多種多樣的，如存在于一個或多個關鍵位點(發揮酶活性的關鍵位點或關鍵結構域)上的點突變，或存在于一個或多個位置的插入突變，或存在于一個或多個位置的缺失突變等；此外，近期sigma公司推出了一種基于二類內含子的基因敲除系統TargeTron? Gene Knockout System,可用于進行基因敲除。上述這些方式均可用于本發明。作為本發明的特別優選的方式，對乙酰乳酸合成酶的編碼基因(乙酰乳酸合成酶基因)進行插入突變。本發明人發現，插入突變可以最徹底地阻止乙酰乳酸合成酶基因的表達，使得所述的基因工程菌不表達乙酰乳酸合成酶。因此，本發明人嘗試了多種乙酰乳酸合成酶基因突變方式后，優選采用插入突變的方式。
[0050]能夠使得乙酰乳酸合成酶基因不表達的基因突變方式均是可用的，例如可以在乙酰乳酸合成酶基因內部插入至少一種其它基因(如乙酰乳酸合成酶基因片段、氯霉素抗性基因)，破壞其原有的編碼方式，從而使得乙酰乳酸合成酶表達量下降。作為本發明的更優選方式，所述的基因工程菌的基因組中，乙酰乳酸合成酶基因序列的內部插入了 500bp的乙酰乳酸合成酶基因片段。更優選地，本發明采用的是乙酰乳酸合成酶基因第43bp-534bp位的片段。該長度既適合于基因操作，且突變效果良好，其在插入乙酰乳酸合成酶基因序列的內部后，完全地阻止了乙酰乳酸合成酶基因的表達。
[0051]本發明構建的重組粘質沙雷氏菌株易于培養，能夠利用的碳源廣泛，抗污染能力強，產物D-乳酸構型單一，為光學純，對于工業生產具有重要意義。
[0052]重組粘質沙雷氏菌的構建
[0053]本發明還提供了一種制備所述的重組粘質沙雷氏菌的方法，包括:構建用以插入失活乙酰乳酸合成酶基因的打靶質粒，將打靶質粒轉入受體粘質沙雷氏菌，篩選發生同源交換的基因工程菌。`較佳地，該方法包括:(I)提供一打靶質粒，所述的打靶質粒中，含有乙酰乳酸合成酶基因片段序列，其不編碼乙酰乳酸合成酶；(2)將(I)所述的打靶質粒轉入粘質沙雷氏菌內，通過同源交換使得突變的乙酰乳酸合成酶基因序列整合到粘質沙雷氏菌的基因組；和(3)選擇發生了同源交換的粘質沙雷氏菌，獲得重組粘質沙雷氏菌。
[0054]作為本發明的優選方式，用于構建打靶質粒的質粒選自:pUTKm、pSUP202、PSUP203、pLOl、pPHU281、pSZ21 ;更優選的，所述的打靶質粒是pUTKm。
[0055]外源DNA轉入粘質沙雷氏菌的方法主要有接合轉移、轉化或噬菌體轉染，這些方式均可用于本發明。轉化的方法在1982年就被C.S.F0RNARI和S.KAPLAN建立，最高可以達到每個存活細胞5X 10_6的轉化效率(Fornari CS, Kaplan S.1982.Genetic-Transformation of Rhodopseudomonas-Sphaeroides by Plasmid DNA.Journalof Bacteriology 152 (I):89-97)?
[0056]本發明人發現，接合轉移的方法是較為有效的。通過接合轉移的方法將打靶質粒轉入粘質沙雷氏菌內。所述的質粒為一種自殺質粒(suicide plasmid),其具有接合轉移基因。在構建基因缺失工程菌時，需要選擇適當的自殺質粒。自殺質粒的復制需要一種特殊的蛋白，大多數細菌不產生這種蛋白質，因此，當進入寄主細胞時，要么不能復制，被消除，要么被整合入染色體上，和染色體一起復制。利用自殺質粒的這個特點，將基因工程技術構建的基因缺失的DNA片斷，克隆入自殺質粒，利用缺失基因兩端的同源片斷，定位自殺質粒的整合位點。利用同源性DNA片斷可發生重組的原理，構建精確基因缺失菌株。[0057]作為本發明的優選方式，在進行接合轉移時，先將打靶質粒轉化到具有接合轉移功能的大腸桿菌中，混合培養帶有打靶質粒的大腸桿菌和粘質沙雷氏菌，從而打靶質粒通過接合轉移進入粘質沙雷氏菌中。所述的大腸桿菌優選的是大腸桿菌E.coli S17-1 λ Pir0
[0058]為了確認所選擇獲得的基因工程菌為發生了同源交換的基因工程菌(即乙酰乳酸合成酶基因被插入失活的細菌)，還可對其進行鑒定。鑒定的方法包括但不限于=PCR方法、Southern雜交方法或乳酸合成酶酶活測定方法。
[0059]生產D-乳酸的方法
[0060]現有技術中，通常應用粘質沙雷氏菌生產2，3- 丁二醇，而D-乳酸一般被作為粘質沙雷氏菌發酵生產2，3- 丁二醇過程中的一個副產物。而本發明中，通過改變菌株代謝途徑中的酶，實現了 D-乳酸的高產。
[0061]因此，本發明還提供了一種生產D-乳酸的方法，包括:(I)提供重組粘質沙雷氏菌，該菌株中乙酰乳酸合成酶不表達(包括低表達)；(2)培養(I)的重組粘質沙雷氏菌，從而生產D-乳酸。更具體地，本發明的方法利用自殺載體將粘質沙雷氏菌染色體上的乙酰乳酸合成酶基因插入失活，利用該菌在液體培養基中進行發酵，得到D-乳酸。
[0062]為了盡可能地提高D-乳酸的產量，對于應用本發明的重組粘質沙雷氏菌生產D-乳酸的方法，本發明人還針對各項發酵條件進行了改進。
[0063]作為本發明的優選方式，將所述的重組粘質沙雷氏菌進行馴化，使之在含有葡萄糖和乳酸鹽的培養基中生長活力顯著增加。所述的馴化培養方法如下:將重組粘質沙雷氏菌加入到含50±10g/L葡萄糖和50±10g/L乳酸鈉的液體培養基(較佳地為LB培養基)中，在起始pH值6.0 ± 0.5、28 ± 2 °C、200 土 50rpm搖床上培養12 ± 3小時；將經過前述培養的菌液涂布到含50± 10g/L葡萄糖和50± 10g/L乳酸鈉的固體培養基(較佳地為LB培養基)上，在37±1°C下培養24~36小時，選擇平板上體積較大的單個菌落。經驗證，馴化后獲得的菌體在葡萄糖培養基中的生長活力和乳酸鹽耐受性均得到了很大提升。
[0064]通過單因素實驗探索了發酵工藝條件中最主要的三項:氧、溫度、pH值對菌體生長代謝的影響。經過反復實驗比較，發現:菌體在有氧條件下，溫度為28°C，pH值為7.0時生長相對活躍；在無氧條件下，溫度為44°C，pH值為6.0時比較適合D-乳酸的生產積累。因此，本發明人將發酵的調控策略確定為兩步法，即前期菌體的生長階段和后期D-乳酸的生產積累階段。
[0065]作為本發明的優選方式，菌體生長階段的培養條件如下:在有氧、28±2°C (較佳地，28 土 1°C )、pH值為7.0±0.3 (較佳地，7.0±0.2)的條件下培養重組粘質沙雷氏菌，至菌體濃度0D_值達到25-40 (較佳地，28-35)。作為本發明的優選方式。更優選地，在轉速700 土 200rpm (較 佳地，700 土 IOOrpm)，通氣量 200 土 40vvm (較佳地，200 土 20vvm)下培養。
[0066]作為本發明的優選方式，D-乳酸的生產積累階段的培養條件如下:向發酵培養基中添加葡萄糖使之終濃度100±20g/L(較佳地，100±10g/L)，在無氧、44±2°C (較佳地，44± 1°C )、pH值為6.0±0.3 (較佳地，6.0±0.2)的條件下，繼續培養36-60小時(較佳地，42-54小時)。更優選地，在轉速300± IOOrpm(較佳地，300±50rpm)下培養。
[0067]培養基成分的優化主要集中于氮源和碳源的選擇以及培養基各組分濃度的初步優化上。使用的優化實驗方案包括單因素實驗、PB實驗設計、響應面分析等。作為本發明地優選方式，發酵培養基成分為:葡萄糖60±10g/L，酵母粉20±4g/L，NaCl 5 ± lg/L, KH2PO45±lg/L，MgSO4 0.5±0.lg/L，MnSO40.05±0.01g/L。優化后的種子培養基和發酵培養基在降低原先成本的基礎上提高了 D-乳酸的表達量。
[0068]本發明的主要優點在于:
[0069](I)使用本發明的重組粘質沙雷氏菌發酵生產D-乳酸，充分利用了該菌體在發酵生產環境友好型產物方面的潛力。利用粘質沙雷氏菌還有以下特點:重組粘質沙雷氏菌株易于培養，能夠利用的碳源廣泛，抗污染能力強，產物D-乳酸構型單一，為光學純。
[0070](2)本發明構建的重組粘質沙雷氏菌能夠穩定傳代和生產D-乳酸，具有利用多種碳源的能力，生長迅速和不容易污染，非常適合于作為工業化菌種。
[0071]下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如J.薩姆布魯克等編著，分子克隆實驗指南，科學出版社，2002中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0072]實施例1、乙酰乳酸合成酶基因阻斷載體pUTKm-ALS的構建
[0073]用Omega公司的細菌基因組提取試劑盒提取粘質沙雷氏菌MGl (購自Omega)的基因組DNA。[0074]以粘質沙雷氏菌MGl基因組DNA為模板，以SEQ ID N0:1和SEQ ID N0:2所示序列為PCR引物，擴增α-乙酰乳酸合成酶基因內約500bp的序列(為GenBank登錄號JF519737的α -乙酰乳酸合成酶基因序列中第43-534位)，稱為ALS。
[0075]SEQ ID NO:1:attggtaccCCGTCAACCCGCAGCCAGAGTA ；
[0076]SEQ ID NO:2:attagtactCCTTCTGTTCGCCGATGCGGAG ；
[0077]將擴增到的α -乙酰乳酸合成酶基因部分序列用限制性內切酶KpnI和ScaI進行酶切，酶切產物插入到PUTKm載體(GenBank:AF102233.1)的相應位點中，轉化大腸桿菌E.coli S17-1 λ pir,挑取重組子并驗證,得到重組質粒pUTKmALS。
[0078]實施例2、粘質沙雷氏菌中α -乙酰乳酸合成酶基因的敲除
[0079]將含有pUTKmALS的重組大腸桿菌Ε.coli S17-1 λ pir與粘質沙雷氏菌MGl進行接合轉移，使PUTKmALS進入粘質沙雷氏菌與其基因組進行同源重組，從而插入失活α -乙酰乳酸合成酶基因，從而使其不能產生2，3- 丁二醇。
[0080]具體操作如下:在30ml含有卡那霉素抗生素的LB培養基中培養供體菌E.coliS17-1 λ pir(內含pUTKmALS)和受體菌粘質沙雷氏菌MGl，過夜培養；按照1%接種量將上述供體菌和受體菌轉接入50ml的LB培養基中培養2h ;供體菌和受體菌按照體積比3:1的比例混合，離心并且去上清，加入100 μ I的新鮮LB培養基重懸菌體；將已經滅菌的0.45μπι濾膜平鋪在不加抗生素的LB平板上，取5 μ I懸浮菌液點在濾膜上，37 V中倒置培養8小時以上；取出濾膜，放入含有Iml的LB液體培養基的EP管中振蕩培養，取出100 μ I涂布在含200 μ g/ml卡那霉素和100μ g/ml氨芐青霉素的LB固體平板上，37 °C培養箱中倒置培養。能夠生長出來的即是發生同源重組的粘質沙雷氏菌。
[0081]之后，對生長出的粘質沙雷氏菌進行鑒定。采用引物SEQ ID N0:3和SEQ ID NO:4擴增片段，之后電泳鑒定，700bp處有條帶的為突變菌株，無條帶的為野生菌。經PCR驗證，獲得α -乙酰乳酸合成酶基因被插入失活的重組粘質沙雷氏菌，該菌株因為不能產生α -乙酰乳酸合成酶，從而不能生成2，3- 丁二醇，轉而生成大量D-乳酸。[0082]SEQ ID NO:3:AACAGGCAATGACTGGCAATGCG ；
[0083]SEQ ID NO:4:GAAGTAAGTTGGCCGCAGTG。
[0084]a -乙酰乳酸合成酶基因全長1686bp，將位于該基因43bp_534bp之間的片段克隆到pUTKm上，該質粒轉入到粘質沙雷氏菌中之后，上面的a -乙酰乳酸合成酶基因片段會與粘質沙雷氏菌基因組上的a-乙酰乳酸合成酶基因的同源部分發生交換，從而截斷該基因，不能正常表達有活性的酶，從而粘質沙雷氏菌失去了合成2，3- 丁二醇的能力。
[0085]實施例4、重組菌株適應發酵產生D-乳酸的馴化培養
[0086]為提高重組粘質沙雷氏菌菌株耐受乳酸的能力，對菌體進行馴化篩選。以LB培養基為出發培養基，在培養基中添加50g/L的葡萄糖和50g/L的乳酸鈉，以此為篩選培養基篩選菌體。將常規方法活化后的菌種接入培養基中，接種前向培養基中添加卡那霉素，使其濃度為100 μ g/mL。起始pH值為6.0，在28°C，200rpm搖床上培養12h。再將含1.5%(w/w)瓊脂粉的固體篩選培養基制成平板，將菌液涂布到平板上，37°C下培養24~36h，選擇平板上體積較大的單個菌落進行保種。
[0087]經以上步驟的篩選得到經馴化的菌株與馴化前的菌株進行比較。使用發酵培養基(葡萄糖 30g/L ;酵母粉 20g/L ;KH2P04 8g/L ；NaCl 5g/L ；MgS04 0.5g/L ；MnS04 0.05g/L)，通過搖瓶實驗驗證對比。按5%(v/v)的接種量分別接種馴化前和馴化后的菌株，在有氧條件、28°C、pH值為7.0的條件下培養12h，測定菌體濃度0D_值；然后再轉入無氧條件、44°C、pH值為6.0的條件下培養至48h，測定發酵液中的D-乳酸含量，結果如圖4。因此可見，馴化后的菌株在含有葡萄糖的培養基中生長活力遠遠優于馴化之前的菌株。這表明經過馴化的菌體的生長活力和乳酸鹽耐受性均得到了提升。
[0088]實施例5、重組菌搖瓶發酵D-乳酸的條件和培養基優化
[0089]通過單因素實驗探索了發酵工藝條件中最主要的三項:氧、溫度、pH值對菌體生長代謝的影響。
[0090](1)氧氣對菌體生長及乳酸生成的影響
[0091]利用初始種子培養基和初始發酵培養基在搖瓶實驗中考察氧氣對菌體的整個代謝狀況的影響。按5%(v/v)的接種量將活化后的菌種液接入到裝有50mL初始發酵培養基的250mL螺絲口三角瓶中，再在28°C下分別進行有氧培養(搖床轉速為200rpm，下同)和無氧培養12h。測定菌體濃度0D600值,考察氧氣對菌體生長的影響。然后在適合菌體生長的條件下重復剛才的菌體生長的搖瓶實驗，培養12h后再分別在有氧和無氧條件下培養至48h，考察氧氣對乳酸生產積累的影響。
[0092](2)溫度對菌體生長及乳酸生成的影響
[0093]利用初始種子培養基和初始發酵培養基在搖瓶實驗中考察溫度對菌體的整個代謝狀況的影響。按5%(v/v)的接種量將活化后的菌種液接種到裝有50mL初始發酵培養基的250mL螺絲口三角瓶中，后分別置于28°C、37°C、44°C下有氧培養12h，測定菌體濃度0D600值，考察溫度對菌體生長的影響。選出最適生長溫度后，再在最適生長溫度下重復菌體生長的搖瓶實驗，培養12h后分別置于28°C、37°C、44°C、50°C下無氧培養至48h，考察溫度對乳酸生產積累的影響。
[0094](3) pH值對菌體生長及乳酸生成的影響
[0095]利用初始種子培養基和初始發酵培養基在搖瓶實驗中考察pH值對菌體的整個代謝狀況的影響。按5%(v/v)的接種量將活化的菌種液接種到裝有50mL初始發酵培養基的250mL螺絲口三角瓶中，在28°C下有氧培養，使用NaOH分別將初始發酵培養基的初始pH值調為6.0、7.0、9.3培養12h，測定菌體濃度0D600值，考察pH值對菌體生長的影響。選出最適生長pH值后再在最適生長pH值下重復菌體生長的搖瓶實驗，培養12h后分別將pH控制在6.0,7.0,9.3并于無氧條件下培養至48h，考察pH值對乳酸生產積累的影響。
[0096]⑷結果
[0097]結果如圖1-3，發現菌體在有氧條件下，溫度為28°C，pH值為7.0時生長相對活躍；在無氧條件下，溫度為44°C，pH值為6.0時比較適合D-乳酸的生產積累。因此將發酵的調控策略確定為兩步法，即前期菌體的生長階段和后期D-乳酸的生產積累階段。
[0098]培養基成分的優化主要集中于氮源和碳源的選擇以及培養基各組分濃度的初步優化上。使用的優化實驗方案包括單因素實驗、PB實驗設計、響應面分析等。優化的目標主要是提高菌體濃度0D_值和提升D-乳酸的表達量這兩項。優化后的種子培養基和發酵培養基在降低原先成本的基礎上提高了 D-乳酸的表達量。
[0099]最后確定菌種的最適生長條件:pH值7.0,溫度28°C,有氧培養。
[0100]最后確定發酵生產D-乳酸的最適條件:pH值6.0,溫度44°C,無氧培養。
[0101]種子培養基(g/L):葡萄糖30 ;酵母粉 20 ；KH2PO4 8 ；NaCl 5 ；MgS04 0.5 ；MnSO4
0.05。
[0102]發酵培養基成分(g/L):葡萄糖60，酵母粉 20，NaCl 5，KH2PO4 5，MgSO4 0.5, MnSO4
0.05。
[0103]實施例6、重組菌發酵罐放大實驗
[0104]在3.7L發酵罐上做前面構建的重組粘質沙雷氏菌的發酵實驗時，發酵液的裝液量為2L。按5%接種量將菌株接種到發酵罐培養基。在有氧條件、28°C、pH值為7.0的條件下培養9h，由于菌體的初始濃度較高，有氧階段中發酵罐攪拌槳轉速為700rpm，通空氣量為200vvm。當發酵培養至9h時向發酵培養基中添加終濃度到100g/L的葡萄糖，關閉通氣閥門和排氣閥門，將攪拌轉速降低至300rpm以維持發酵液的均勻，并將發酵溫度升至44°C，pH值調至6.0,繼續培養至48h。
[0105]經檢測，發酵培養9h時，菌體濃度OD6tltl值增加到33.24，進入生長階段穩定期的菌體0D_值在20左右。9h時添加到發酵培養基中的100g/L的葡萄糖在發酵至48h時耗盡，D-乳酸在48h時的濃度為83.5g/L,由于D-乳酸只在無氧條件下產生,無氧發酵至48h的過程中乳酸轉化率為83.5%。通過使用乳酸試劑盒測定發現，發酵液中L-乳酸含量為0.9g/L,即D-乳酸的光學純度為98.9%。
[0106]本發明的發酵策略成功地提高了 D-乳酸的濃度，同時48h內將100g/L的葡萄糖耗盡。
[0107]在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
【權利要求】
1.一種應用重組粘質沙雷氏菌生產D-乳酸的方法，其特征在于，包括: (1)提供重組粘質沙雷氏菌，該菌株中乙酰乳酸合成酶不表達； (2)培養(I)的重組粘質沙雷氏菌，從而生產D-乳酸。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(1)中，所述的重組粘質沙雷氏菌的基因組中，含有突變的乙酰乳酸合成酶基因序列，其不編碼乙酰乳酸合成酶。
3.如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述的重組粘質沙雷氏菌如下制備: (1)提供一打靶質粒，所述的打靶質粒中，含有乙酰乳酸合成酶基因第43bp-534位序列； (2)將(I)所述的打靶質粒轉入粘質沙雷氏菌內，通過同源交換使得粘質沙雷氏菌基因組上的乙酰乳酸合成酶基因失活； (3)選擇發生了同源交換的粘質沙雷氏菌，獲得重組粘質沙雷氏菌。
4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟⑴和步驟(2)之間，還包括步驟: 將步驟(1)的重組粘質沙雷氏菌進行馴化培養。
5.如權利要求4所述的方法，其特征在于，所述的馴化培養方法如下:將重組粘質沙雷氏菌加入到含50±10g/L葡萄糖和50±10g/L乳酸鈉的液體培養基中，在起始pH值6.0±0.5、28±2°C、200±50rpm 搖床上培養 12±3 小時； 將經過前述培養的菌液涂布到含50 ±10g/L葡萄糖和50±10g/L乳酸鈉的固體培養基上，在37±1°C下培養24~36小時(較佳地12~15小時)，選擇平板上體積較大的單個菌落。
6.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)中，所述的培養重組粘質沙雷氏菌包括: (a)在有氧、28±2°C、pH值為7.0±0.3的條件下培養重組粘質沙雷氏菌，至菌體濃度OD600 值達到 25-40 ； (b)向發酵培養基中添加葡萄糖使之終濃度為100±20g/L，在無氧、44±2°C、pH值為6.0±0.3的條件下，繼續培養36-60小時。
7.如權利要求6所述的方法，其特征在于，步驟(a)中，在轉速700±200rpm，通氣量200±40vvm 下培養； 步驟(b)中，在轉速300 ± IOOrpm下培養。
8.如權利要求6所述的方法，其特征在于，步驟(a)中，發酵培養基成分為:葡萄糖60±10g/L，酵母粉 20±4g/L，NaCl 5± lg/L，KH2PO4 5±lg/L，MgSO4 0.5±0.lg/L，MnSO40.05±0.01g/L。
9.一種重組粘質沙雷氏菌，該菌株的基因組中所述的重組粘質沙雷氏菌的基因組中，含有突變的乙酰乳酸合成酶基因序列，其不編碼乙酰乳酸合成酶。
10.如權利要求9所述的重組粘質沙雷氏菌，其特征在于，所述的重組粘質沙雷氏菌如下制備: (1)提供一打靶質粒，所述的打靶質粒中，含有乙酰乳酸合成酶基因第43bp-534位序列； (2)將(I)所述的打靶質粒轉入粘質沙雷氏菌內，通過同源交換使得粘質沙雷氏菌基因組上的乙酰乳酸合成酶基因失活；(3)選擇發生了同源交換的粘質沙雷氏菌，獲得重組粘質沙雷氏菌。
【文檔編號】C12R1/43GK103667374SQ201210349403
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2012年9月18日 優先權日:2012年9月18日
【發明者】沈亞領, 饒犇, 蘇剛, 滿永博, 白方敏, 魏東芝 申請人:華東理工大學