一種利用木質纖維素原料高溫同步糖化發酵生產乙醇的新工藝的制作方法
【專利摘要】乙醇是一種潔凈、可再生、生產過程不凈排放碳的交通燃料，是目前使用量最大的生物運輸燃料。本發明涉及一種利用木質纖維素原料在高溫高固形物含量情況下同步酶解糖化發酵生產乙醇工藝。木質纖維素原料經過預處理之后，利用纖維素酶和耐溫釀酒酵母(TIB-S.C?Y01)進行高溫同步糖化發酵，通過合理分批補料提高底物濃度，提高乙醇產量，使其達到經濟的蒸餾濃度。實驗利用不同原料進行高溫同步糖化發酵，乙醇產量在5-10％(v/v)。利用耐溫釀酒酵母進行高溫同步糖化發酵，為木質纖維素原料高溫同步糖化發酵奠定基礎。
【專利說明】—種利用木質纖維素原料高溫同步糖化發酵生產乙醇的新工藝
【技術領域】
[0001]本發明屬于工業生產乙醇生物【技術領域】，特別涉及一種利用木質纖維素原料在高溫、高固形物含量底物條件下的同步酶解糖化發酵生產乙醇工藝。
【背景技術】
[0002]當今傳統化石能源的供給日益緊張，以及人類對使用傳統化石能源所造成的嚴重環境污染有了充分認識的情況下，纖維質燃料乙醇作為一種新型的、可再生清潔能源越來越受到世人的重視。中國是一個農業大國，各類農作物纖維資源十分豐富，僅秸桿一項就達7.0X10nkg以上，其中玉米秸桿約2.2X10nkg，這些資源長期沒有得到合理的開發利用。如果將它們轉化成氣體或液體燃料，這樣不但緩解人類所面臨的資源危機，食物短缺，環境污染等一系列問題，也為人類持續發展提供了保證。
[0003]目前，國內多數的燃料乙醇生產線，主要采用分步糖化發酵的生產工藝，進行燃料乙醇的生產。然而與分步糖化發酵相比，同步糖化發酵有很多優點:1)可以促進反應動力學過程，減少酶解產物對酶的反饋抑制；2)葡萄糖生成與消耗幾乎同時進行，增加了發酵產率；3)糖化與發酵在一個反應器中進行，減少了設備投資；4)由于同時糖化發酵可以縮短反應時間等。1977年，Takgt首次報道了同步糖化發酵法。他將里氏木霉產生的纖維素酶和釀酒酵母放在一個容器里，創造了邊糖化邊發酵的所謂同步糖化發酵法(simultaneoussaccharification and fermentation, SSF),俗稱一步法。在同一容器中，加入纖維素材料、纖維素酶和酵母等乙醇生產菌，使纖維素糖化產生的葡萄糖、纖維二糖和各種寡糖分子在第一時間被發酵成乙醇。SSF法中常用的微生物是霉菌和釀酒酵母，主要特點是纖維素的糖化和糖的發酵在同一裝置內同時進行。
[0004]由于糖化和發酵可在同一反應器里進行，SSF節省了設備投資，反應時間可縮短一半，大幅度減少了纖維素的酶解成本。與纖維素糖化和乙醇發酵相繼進行的兩步法相比，SSF過程中，水解終產物一葡萄糖不斷被`乙醇生產菌利用，生成與消失幾乎同步，消除了葡萄糖濃度的增加對纖維素酶的反饋抑制作用，增加了乙醇的發酵產率。乙醇的存在和PH值降低使發酵過程污染雜菌的可能性減少。而葡萄糖苷酶及時降解反饋抑制纖維素酶活的纖維二糖，減輕了酶解中間產物對酶活性發揮的抑制，促進了酶促反應的動力學過程。
[0005]同步糖化發酵雖然被認為是纖維素乙醇轉化最有效的途徑，可以使抑制纖維素酶的水解產物——葡萄糖和纖維二糖的積累降到最低。但常用作工業生產的纖維素酶生產菌的β -葡萄糖苷酶在酶系中含量相對較低，而發酵體系中水解的中間產物一纖維二糖只能通過β_葡萄糖苷酶來降解，因此發酵液中的纖維二糖不能得到完全的降解。作為纖維素酶的競爭性抑制物，纖維二糖的利用或減少就成為提高酶解效率的重要環節。
[0006]同步糖化發酵的效率通常以乙醇產量來表示。由于發酵中存在多種影響因素，乙醇濃度受到多方面的影響。其中，發酵溫度、底物濃度和酶液濃度是影響較大的因素。纖維素酶解與酵母糖化同時進行，最為突出的是兩者的溫度不協調。在SSF過程中，表現纖維素酶的最佳溫度為45~50°C，而乙醇發酵的最佳溫度為20~40°C。折衷兩者的最佳溫度得到的溫度既不最適合發酵、也不最適合水解。美國可再生能量研究所的1.Ballesteros等人選用耐熱酵母對提高SSF過程的轉化率進行了研究，但由于酵母產酒能力較差而無法應用到實際生產中。在工業生產中，發酵的乙醇達到5%為比較經濟的蒸餾濃度，要達到這個濃度最可簡單的辦法是提高底物濃度和酶液濃度。理論上，底物濃度和酶液濃度直接影響底物糖化后的總糖量，進而影響酵母的生長。由于纖維素材料在預處理過程中，會產生糠醛、羥甲基糠醛等一系列酵母生長的抑制物，因而底物濃度的一味提高會影響工業酵母的生長，繼而降低乙醇發酵濃度。而高劑量纖維素酶的使用會直接增加乙醇的生產成本。適宜的底物濃度和酶液濃度是同步糖化發酵體系里基礎的工藝標準。
[0007]為了克服上述缺點，我們經過適應性進化改造工業釀酒酵母，提高菌種的發酵溫度以及對乙酸、糠醛、羥甲基糠醛等一系列酵母生長的抑制物的耐受性，為木質纖維素原料高溫同步糖化發酵奠定基礎。
【發明內容】
[0008]本發明的目的在于提供一種利用木質纖維素原料在高溫、高固形物含量情況下同步酶解糖化發酵生產乙醇的工藝，本發明所用菌種為耐高溫生產乙醇酵母菌，釀酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae) TIB-S.C YOl已于2011年12月30日藏保于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)，保藏號為CGMCC No5679。
[0009]為達到上述發明目的本發明所采用的技術方案是:
[0010]—種利用木質纖維素原料高溫同步酶解糖化發酵(high temperature SSF,ΗΤ-SSF)生產乙醇的工藝，包括如下步驟:
[0011]I)培養種子，其中又包括下述步驟:
[0012](I)配置培養基:在250mL三角瓶中，盛放50mL的YH)培養基，在1000mL三角瓶中，盛放250mL的YPD培養基，成分包括葡萄糖2%，蛋白胨2%，牛肉膏1%，pH為5.5，121°C，滅菌 20min。
[0013](2)種子活化:將耐溫釀酒酵母TIB-S.C YOl CGMCC No5679從_80°C中拿出轉接到有50mL —級種子培養基的250mL三角瓶中，40°C、200r/min的搖床培養24小時后。
[0014](3)種子培養:將活化的酵母菌轉接IOml到含有250ml的種子培養基的1000mL三角瓶中，共準備4個1000mL三角瓶，共1000mL的種子培養基，在40°C、200r/min的搖床培養16小時后，加入到發酵罐中進行同步糖化酶解發酵。
[0015]2)發酵消毒，其中又包括下述步驟:
[0016](I)準備發酵罐:將發酵罐罐內清理干凈，并將pH電極、溶氧電極等安裝。
[0017](2)滅菌消毒:將發酵罐內注入水至浸沒電極之后進行滅菌，110°C，0.1lOMpa滅菌20min之后冷卻并將罐內水放掉。
[0018]3) HT-SSF過程，包括下述步驟:
[0019](I)計算物料含水量:將一定質量的物料盛放在玻璃平皿中，在85°C條件下烘干至恒重之后冷卻，稱其質量并計算含水量。
[0020](2)物料液化:將12%物料加入到發酵罐中，并加入對應的水和纖維素酶，溫度40°C，轉速lOOrpm，罐壓0.005Mpa，通氣10L/min條件下液化12小時。[0021](3)加入菌種:12小時時，將菌種接入到發酵罐中，并補入6%的物料和相對應的纖維素酶，溫度40°C，轉速lOOrpm，罐壓0.005Mpa,通氣3L/min開始SSF，每隔12小時取樣。
[0022](4)補料補酶:24小時時，補入6%的物料和相對應的纖維素酶。
[0023](5)補菌種補料補酶:36小時時，接入一定量菌種，并補入3%的物料和相對應的
纖維素酶。
[0024](6)補料補酶:48小時時，補入3%的物料和相對應的纖維素酶，SSF總時間為96小時。
[0025](7)樣品檢測:樣品中葡萄糖、木糖、乙醇、乙酸和乳酸等用HPLC檢測。
【具體實施方式】
[0026]下面通過實施例對本發明作進一步說明。
[0027]實施例1 30L發酵罐進行玉米芯高溫同步糖化酶解發酵生產乙醇
[0028]測定含水量:稱取IOg原料，85°C烘干后稱取干重后測得含水量，根據含水量數據計算30%底物所對應原料總質量(本次實驗測得原料固形物含量為93.9% )。
[0029]發酵罐準備:30L發酵罐進行空氣過濾器消毒，安裝pH電極并加水沒過電極后進行實消，之后排空水并清零。
[0030]發酵菌種準備:耐溫釀酒酵母TIB-S.C YOl CGMCC No5679接種裝有50mL —級種子培養基的250mL搖瓶中，該培養基的pH為5.5，含有下述質量百分比的組分:葡萄糖2 %，蛋白胨2%，酵母膏I %。在40°C、200r/min的搖床培養24小時后，將培養的酵母菌轉接IOml到含有250ml的二級種子培養基的1000mL三角瓶中，準備4個1000mL三角瓶，共1.0L的種子，該培養基的PH為5.5，含有下述質量百分比的組分:葡萄糖10%，蛋白胨2%，酵母膏1%。在40°C、200r/min的搖床培養16小時。
[0031]HT-SSF過程:根據含水量及補料方案計算出反應體系需加水量(本次實驗反應體系15L，一次性加水11L，稱取12%底物含量對應的原料(1.9Kg)，纖維素酶0.465L(20FPU/g底物)，開攪拌并投料。完成后設定SSF程序，溫度40°C，pH5.0，轉速IOOrpm，罐壓0.005Mpa，微通氣。待攪拌均勻后取樣，之后12小時補料6%及對應酶量；24小時補料6%及對應酶量；36小時補料3%及對應酶量；48小時補料3%及對應酶量；12小時和36小時時接入耐溫釀酒酵母TIB-S.C YOl CGMCC No5679各IL總接種量為15 %。然后每12小時取一次樣，取樣在加料之前，總底物濃度為30%。利用HPLC測定96小時時剩余葡萄糖0.305g/L，乙醇產量為56.216g/L，酶解率為73%。
[0032]實施例2 30L發酵罐進行汽爆玉米秸桿物料高溫同步糖化酶解發酵生產乙醇
[0033]測定含水量:稱取IOg原料，85°C烘干后稱取干重后測得含水量，根據含水量數據計算30%底物所對應原料總質量(本次實驗測得原料固形物含量為96.1% )。
[0034] 發酵罐準備:30L發酵罐進行空氣過濾器消毒，安裝pH電極并加水沒過電極后進行實消，之后排空水并清零。
[0035]發酵菌種準備:耐溫釀酒酵母TIB-S.C YOl CGMCC No5679接種裝有50mL —級種子培養基的250mL搖瓶中，該培養基的pH為5.5，含有下述質量百分比的組分:葡萄糖2 %，蛋白胨2%，酵母膏I %。在40°C、200r/min的搖床培養24小時后，將培養的酵母菌轉接IOml到含有250ml的二級種子培養基的1000mL三角瓶中，準備4個1000mL三角瓶，共1.0L的種子，該培養基的pH為5.5，含有下述質量百分比的組分:葡萄糖10%，蛋白胨2%，酵母膏1%。在40°C、200r/min的搖床培養16小時。
[0036]HT-SSF過程:根據含水量及補料方案計算出反應體系需加水量(本次實驗反應體系15L，一次性加水11L，稱取12%底物含量對應的原料(1.87Kg)，纖維素酶0.455L(20FPU/g底物)，開攪拌并投料。完成后設定SSF程序，溫度40°C，pH5.0，轉速IOOrpm，罐壓
0.005Mpa，微通氣。待攪拌均勻后取樣，之后12小時補料6%及對應酶量；24小時補料6%及對應酶量；36小時補料3%及對應酶量；48小時補料3%及對應酶量；12小時和36小時時分別接入耐溫釀酒酵母TIB-S.C YOl CGMCC No5679各IL總接種量為15%。然后每12小時取一次樣，取樣在加料之前，總底物濃度為30%。利用HPLC測定96小時時剩余葡萄糖
3.305g/L,乙醇產量為34.694g/L，酶解率為65.8%。
[0037]實施例3 300L發酵罐進行汽爆玉米秸桿物料高溫同步糖化酶解發酵生產乙醇
[0038]測定含水量:稱取IOg原料，85°C烘干后稱取干重后測得含水量，根據含水量數據計算30%底物所對應原料總質量。(本次實驗測得原料固形物含量為93.9% )
[0039]種子罐準備:30L種子罐進行空氣過濾器消毒，安裝pH電極和溶氧電極并加水沒過電極后進行實消 ，之后排空水并配制YPD培養基進行實消。
[0040]發酵罐準備:300L發酵罐進行空氣過濾器消毒，安裝pH電極并加水沒過電極后進行實消，之后排空水并清零。
[0041]發酵菌種準備:耐溫釀酒酵母TIB-S.C YOl CGMCC No5679接種裝有50mL—級種子培養基的250mL搖瓶中，該培養基的pH為5.5，含有下述質量百分比的組分:葡萄糖10%，蛋白胨2 %，酵母膏I %。在40°C、200r/min的搖床培養24小時后，將培養的酵母菌轉接IOml到含有250ml的二級種子培養基的1000mL三角瓶中，準備4個1000mL三角瓶，共1.0L的種子，該培養基的PH為5.5，含有下述質量百分比的組分:葡萄糖10%，蛋白胨2%，酵母膏1%。在40°C、200r/min的搖床培養16小時后，接種到30L發酵罐培養16小時。
[0042]HT-SSF過程:根據含水量及補料方案計算出反應體系需加水量(本次實驗反應體系150L，一次性加水106L，稱取12%底物含量對應的原料(19Kg)，纖維素酶4.65L，開攪拌并投料。完成后設定SSF程序，溫度40°C，pH5.0，轉速lOOrpm，罐壓0.005Mpa，微通氣。待攪拌均勻后取樣，之后12小時補料6%及對應酶量；24小時補料6%及對應酶量；36小時補料3%及對應酶量；48小時補料3%及對應酶量；12小時和36小時時接入耐溫釀酒酵母TIB-S.C YOl CGMCC No5679，總接種量為15%。SSF過程中每12小時取一次樣，取樣在加料之前，總底物濃度為30%。利用HPLC測定96小時時剩余葡萄糖1.411g/L，乙醇產量為57.014g/L，酶解率為 73.9%。
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【權利要求】
1.一種利用木質纖維素原料在高溫高固形物含量情況下同步酶解糖化發酵(HT-SSF)生產乙醇工藝，包括如下步驟: (1)發酵所用菌種在較高溫度下培養。 (2)HT-SSF過程中，初始底物濃度為12%，在48小時之內分批補加底物，且溫度要維持聞于38 C。
2.根據權利要求1中所述的方法，其特征是菌種的生長溫度是38-50°C。
3.根據權利要求1中所述的方法，其特征是菌種的生長及發酵生產的培養基包括碳源、氮源和維生素，pH4.5-6.5。
4.根據權利要求1所述，其特征是所述碳源為質量百分含量為5%-40%的葡萄糖和/或蔗糖和/或淀粉和/或糖蜜和/或生物質水解糖液。
5.根據權利要求1所述，其特征是所述氮源為質量百分含量為0.1% -5%的玉米漿和/或牛肉膏和/或酵母提取物和/或蛋白胨和/或豆柏和/或豆餅粉和/或花生柏。
6.根據權利要求1所述，其特征是SSF過程中，初始底物濃度為12%。
7.根據權利要求1所述，其特征是SSF過程中，總底物濃度為25-40%。
8.根據權利要求1所述，其特征是SSF過程中，溫度控制在40-50°C。
9.根據權利要求1所述，其特征是SSF過程中，纖維素酶用量為10-40FPU/g底物。
10.根據權利要求2、6、7、8、9所述，本發明是用于高溫同步酶解糖化發酵生產乙醇。
【文檔編號】C12P7/10GK103667362SQ201210362282
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2012年9月21日 優先權日:2012年9月21日
【發明者】馬延和, 王欽宏, 齊顯尼, 汪保衛, 涂然, 彭彥峰 申請人:天津工業生物技術研究所