專利名稱：復合菌劑及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬微生物技術領域，涉及一種復合菌劑及其應用。
背景技術：
水體富營養化已成為困擾世界各國的普遍性環境問題。浮游藻類的大量繁殖導致水華的頻繁爆發，嚴重影響了人類的生活、生產和身體健康，造成了世界范圍內的生態災害，因此，探索控制水華發生的有效途徑已迫在眉睫。目前，治理水體富營養化主要是采用物理和化學方法，但這兩種方法不僅會消耗大量的財力和物力，而且會在一定程度上破壞生態環境。溶藻菌作為水華和赤潮的防治生物，日益受到 國內外環境工作者的廣泛關注。國外對溶藻菌的研究已有數十年的歷史，自Geitler報道一種寄生在剛毛藻上的粘細菌以來，陸續有溶藻菌的相關報道，研究重點也逐漸從單一溶藻菌的篩選及溶藻特性研究過渡到菌一藻種群生態學及分子調控機理等方面。目前，國內對溶藻細菌的研究還處于初始階段，因此，尋找高效溶藻菌對溶藻菌的深入研究及應用具有重要意義。水華魚腥藻是導致水體富營養化的主要藻種之一，其分布廣，能夠產生藻毒素，直接和間接危害人類，然截止目前，利用微生物方式控制水華魚腥藻的研究甚是罕見，利用不同溶藻方式的溶藻菌復合而成的溶藻菌劑更是具有高效溶藻效果的特點。
發明內容
本發明的目的，就是為了提供一種復合菌劑，該復合菌劑可以影響水華魚腥藻的生長效應和光合色素，從而起到溶藻作用。本發明中的芽孢桿菌SSAL-6和不動桿菌SSAL-8分別從黃化的水華魚腥藻液中分離篩選獲得，芽孢桿菌SSAL-6的分類命名為芽孢桿菌，拉丁文學名為Bacillussp.;已于2012年6月6日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址北京市朝陽區北辰西路I號院3號)保藏，保藏號為CGMCC No. 6195。不動桿菌SSAL-8的分類命名為不動桿菌，拉丁文學名為Acinetobactersp.,已于2012年6月6日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址北京市朝陽區北辰西路I號院3號)保藏，保藏號為CGMCC No. 6196。為了實現本發明的目的，本發明采用了以下技術方案一種復合菌劑，由芽孢桿菌SSAL-6和不動桿菌SSAL-8復合而成，芽孢桿菌SSAL-6和不動桿菌SSAL-8的菌體量之比為I 2 2 I。上述復合菌劑，其中，所述芽孢桿菌SSAL-6和不動桿菌SSAL-8的菌體量之比為
I Io上述復合菌劑的制備方法是，將芽孢桿菌SSAL-6和不動桿菌SSAL-8分別置于200mL LB液體培養基中，在250rpm、37°C下振蕩培養12h，至菌懸液OD值為O. 8 1.0，菌體濃度為IO8 109cells/mL時，將芽孢桿菌SSAL-6和不動桿菌SSAL-8復合。上述復合菌劑的制備方法，其中，所述LB液體培養基的組分及配比為酵母提取物，5g ;胰蛋白胨，IOg ；NaCl, IOg ;蒸餾水IOOOmL ；LB液體培養基的pH值為7. 0-7. 2。上述復合菌劑的應用，用于降解水華魚腥藻。上述復合菌劑的應用，其中，當芽孢桿菌SSAL-6和不動桿菌SSAL-8的菌體量之比為1:1時，復合菌劑對水華魚腥藻的降解效果隨復合菌劑濃度的增大而增加，當復合菌劑的濃度為15%時，對水華魚腥藻葉綠素a的抑制率達96%。
圖1為復合菌劑對水華魚腥藻的影響電子透射顯微鏡圖；圖2為復合菌劑對水華魚腥藻細胞數的影響示意圖；圖3為復合菌劑對水華魚腥藻干重的影響示意圖； 圖4為復合菌劑對水華魚腥藻色素吸收光譜的影響示意圖；圖5為復合菌劑對水華魚腥藻葉綠素a的影響示意圖。
具體實施例方式以下舉例說明本發明，但是并不用于限定本發明的保護范圍。實施例1復合菌劑對水華魚腥藻生長效應的影響將芽抱桿菌(Bacillussp.) SSAL-6 和不動桿菌(Acinetobactersp. ) SSAL-8 分別置于200mL LB液體培養基中，250rpm，37°C下振蕩培養12h，至菌懸液OD值為O. 8 1.0(菌體濃度為IO8 109cells/mL)時，將芽孢桿菌(Bacillussp.) SSAL-6和不動桿菌(Acinetobactersp.) SSAL-8 復合。水華魚腥藻培養參照藻類生長抑制實驗的標準方法(國家環保部)，采用水生111號無氮培養液培養，pH為7. 5。培養溫度30±2°C，連續24h光照，光照強度3000±2001x，
靜置培養，每天定期搖動3次。其中，上述的LB液體培養基組分及配比為酵母提取物，5g ;胰蛋白胨，IOg ；NaCl,IOg ;蒸餾水IOOOmL ；LB液體培養基的pH值為7. 0-7. 2。上述的水華魚腥藻液體培養基組分及配比為磷酸氫二鉀(K2HPO4)，O. 075g ;硫酸鎂(MgSO4 · H2O), O. 125g ;碳酸鈣(CaCO3)，
O.1OOg ;檸檬酸鐵(I %水溶液)，O. 5mL ;梓檬酸(I %水溶液)，O. 5mL ;鑰酸(I %水溶液)，5滴；氫氧化鈉(1%水溶液)，1. 5mL ;蒸懼水，1000mL。在水華魚腥藻濃度為5X IO4 IX IO5個/mL時，向IOOmL藻液中加入復合菌劑(菌體濃度約為 2X IO9 個 /mL,其中 Bacillussp. SSAL-6 和 Acinetobactersp. SSAL-8 菌體濃度均為 IO8-1O9個/mL)，處理濃度(v/v)梯度為2· 5%、5%、7· 5%、10%、12· 5%和 15%，每組樣設3個重復。制備與實驗組相同的一系列不同配比的培養液(LB培養液水生111號無氮培養液)，分別用于培養水華魚腥藻形成對照組。以細胞計數法測定藻體細胞數量、并測定水華魚腥藻干重。細胞計數方法從接種計時起，每隔24h取樣，用計數框進行細胞計數。用移液器取經過超聲波破碎儀打碎過的藻液0.1mL于計數框中，在低倍鏡下觀察，放大倍數40X10，隨機取五個視野，數出所看到的細胞數，取其平均值。N= 10XaXSi+/Sft ；a表示每個視野內細胞平均值；Si+R表計數框面積；Sft代表視野面積；N代表每mL中細胞個數。水華魚腥藻干重測定方法取定量的藻液，離心得藻，加入稱量皿，在80°C烘至恒重。不同濃度的復合菌劑對水華魚腥藻的細胞數的影響的測定結果如圖2所示，結果表明水華魚腥藻細胞的去除效果與復合菌劑的濃度呈現出一定的相關性，即隨著復合菌劑濃度的增長，對水華魚腥藻細胞的去除作用越強。當復合菌劑濃度為2. 5%,5%,7. 5%,10%U2. 5%和15%時，培養24h對水華魚腥藻細胞的去除率分別為5%、13%、24%、33%、37%和46%，培養168h后分別變為10%,35%,54%, 58%、63%和70%，與對照相比，呈現顯著差異(P < O. 05)。不同濃度的復合菌劑對水華魚腥藻的干重的影響的測定結果如圖3所示，結果表明純LB液體培養基的投入對水華魚腥藻干重亦會產生影響，當LB液體培養基濃度依次為
2.5%,5%,7. 5%A0%A2. 5%和15%時，培養168h后的水華魚腥藻干重相應增加，分別為 15. 89,16. 40,16. 77,17. 74,18. 30、和 19. 38mg/mL，而投加不同濃度(2. 5%~ 15% )的復合菌劑后，分別為14. 55、11· 11、8· 03、6· 66、6· 90和7. llmg/mL。通過排除LB液體培養基本身對水華魚腥藻生長的影響因素，可見，隨著復合菌劑濃度從2. 5%依次升至15%，復合 菌劑對水華魚腥藻干重的抑制率依次為8 %、32 %、52 %、63 %、62 %、和63 %。實施例2復合菌劑對水華魚腥藻光合色素的影響以Bhandari and Sharma法連續掃描400 750nm波長范圍內色素吸收光譜，并對水華魚腥藻葉綠素a含量進行測定。葉綠素a的提取測定取水華魚腥藻藻液IOmL過O. 45 μ m的復合纖維素膜，將帶藻細胞的膜冷凍過夜，取出后迅速用SmL熱乙醇于熱水浴中萃取2min,將萃取液超聲破碎5 20min后，于暗處靜置2 6h,離心(5000r/min,4°C ) 5min后取上清液3. 5mL置于比色皿中，于665nm和750nm處測吸光值，計算酸化前的光密度值(E665b = Abs665b-Abs750b),然后滴加200 μ L的lmol/L鹽酸酸化,5min后于波長665nm和750nm處再測吸光值，計算酸化后的光密度值(E665a = Abs665a-Abs75J。采用熱乙醇為萃取溶劑，A = 11. 5，K = 2. 43，比色皿光程為1cm。
27.9 X ( Ewsa - Ee65a) X V 葉綠素 a (μ§/ ) =y其中，V表示提取液體積(mL)，V表示樣品的體積(L)。不同濃度的復合菌劑對水華魚腥藻色素吸收光譜的影響的測定結果如圖4所示(A、B、C、D、E、F、G 分別代表溶藻菌濃度為 0%、2· 5%、5%、7· 5%、10%、12· 5%、15% )，結果表明不同濃度的復合菌劑作用于水華魚腥藻時，其色素光譜吸收曲線變化差異較大。中高濃度(> 7. 5% )處理下光譜吸收曲線已非常不明顯，各處峰值模糊甚微，表明復合菌劑已大大地抑制了藻體色素的種類和含量。中低濃度(2. 5 7. 5% )處理下，隨著復合菌劑濃度的增加，各色素光譜吸收峰值均有降低，這與復合菌劑對藻體細胞數以及干重的影響相一致，譜圖充分體現復合菌劑的濃度相關性。葉綠素a是光能的捕獲者，也是葉綠體膜內光傳導者，因此葉綠素a含量的多少，充分反映出藻體光合成能力的強弱。不同濃度的復合菌劑對水華魚腥藻葉綠素a的影響的測定結果如圖5所示，結果表明復合菌劑對葉綠素a的抑制作用隨著復合菌劑濃度的增加而增強。復合菌劑濃度為2. 5%,5%,7. 5%、10%、12. 5%和15%，24h對葉綠素a的抑制率分別為9%、15%、23%、30%、38%和 44%，168h 后依次升至 76%、81 %、91 %、95%、96%和96%。本發明的復合菌劑能夠有效地降解水華魚腥藻，對水體富營養化的控制提供了科學依據，為微生物治理水華的研究提供了重要基礎。在一定條件下，復合菌劑對水華魚腥藻的降解效果隨菌劑濃度的增大而增加，當復合菌劑的濃度為15%時，對水華魚腥藻葉綠素 a的抑制率可高達96%。
權利要求
1.一株芽孢桿菌，從黃化的水華魚腥藻液中分離篩選獲得，命名為SSAL-6，保藏號為 CGMCC No. 6195。
2.一株不動桿菌，從黃化的水華魚腥藻液中分離篩選獲得，命名為SSAL-8，保藏號為 CGMCC No. 6196。
3.一種復合菌劑，其特征在于，由芽孢桿菌SSAL-6和不動桿菌SSAL-8復合而成，芽孢桿菌SSAL-6和不動桿菌SSAL-8的菌體量之比為I 2 2 I。
4.根據權利要求3所述的復合菌劑，其特征在于，所述芽孢桿菌SSAL-6和不動桿菌 SSAL-8的菌體量之比為1:1。
5.根據權利要求3或4所述的復合菌劑的制備方法，其特征在于，將芽孢桿菌SSAL-6 和不動桿菌SSAL-8分別置于200mL LB液體培養基中，在250rpm、37°C下振蕩培養12h，至菌懸液OD值為O. 8 1. O,菌體濃度為IO8 109cells/mL時，將芽孢桿菌SSAL-6和不動桿菌SSAL-8復合。
6.根據權利要求5所述的復合菌劑的制備方法，其特征在于，所述LB液體培養基的組分及配比為酵母提取物，5g ;胰蛋白胨，IOg ；NaCl, IOg ;蒸餾水IOOOmL ；LB液體培養基的 pH 值為 7. 0-7.2。
7.根據權利要求3所述的復合菌劑的應用，用于降解水華魚腥藻。
8.根據權利要求7所述的復合菌劑的應用，其特征在于當芽孢桿菌SSAL-6和不動桿菌SSAL-8的菌體量之比為1:1時，復合菌劑對水華魚腥藻的降解效果隨復合菌劑濃度的增大而增加，當復合菌劑的濃度為15%時，對水華魚腥藻葉綠素a的抑制率達96%。
全文摘要
本發明提供了一種復合菌劑及其應用。該復合菌劑由芽孢桿菌SSAL-6和不動桿菌SSAL-8復合而成，其中芽孢桿菌SSAL-6和不動桿菌SSAL-8的菌體量之比為1～2∶2～1，最好為1∶1。本發明的復合菌劑能有效地降解水華魚腥藻。當芽孢桿菌SSAL-6和不動桿菌SSAL-8的菌體量之比為1∶1時，復合菌劑對水華魚腥藻的降解效果隨復合菌劑濃度的增大而增加，當復合菌劑的濃度為15％時，對水華魚腥藻葉綠素a的抑制率可高達96％。
文檔編號C12R1/01GK103013851SQ20121037880
公開日2013年4月3日 申請日期2012年10月8日 優先權日2012年10月8日
發明者沈健英, 孫秀敏 申請人:上海交通大學